Il protocollo descrive un metodo passo-passo per purificare le proteine ubiquitinate dalle cellule di mammifero usando la proteina oncosoppressore p53 come esempio. Le proteine p53 ubiquitinate sono state purificate dalle cellule in rigorose condizioni di non denaturazione e denaturazione.
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Articolo metodologico
Purificazione delle proteine ubiquitinate p53 da cellule di mammifero
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'ubiquitinazione è un tipo di modificazione post-traduzionale che regola non solo la stabilità, ma anche la localizzazione e la funzione di una proteina substrato. Il processo di ubiquitinazione avviene intracellulare negli eucarioti e regola quasi tutti i processi biologici cellulari di base. La purificazione delle proteine ubiquitinate aiuta lo studio del ruolo dell'ubiquitinazione nel controllo della funzione delle proteine substrato. Qui, una procedura passo-passo per purificare le proteine ubiquitinate nelle cellule di mammifero è descritta con la proteina oncosoppressore p53 come esempio. Le proteine p53 ubiquitinate sono state purificate in rigorose condizioni di non denaturazione e denaturazione. La proteina p53 cellulare totale Flag-tagged è stata purificata con agarosio coniugato con anticorpi anti-Flag in condizioni non denaturanti. In alternativa, la proteina ubiquitinata cellulare totale marcata con His-è stata purificata utilizzando resina carica di nichel in condizioni di denaturazione. Le proteine p53 ubiquitinate negli eluati sono state rilevate con successo con anticorpi specifici. Utilizzando questa procedura, le forme ubiquitinate di una data proteina possono essere efficacemente purificate dalle cellule di mammifero, facilitando gli studi sui ruoli dell'ubiquitinazione nella regolazione della funzione proteica.
Introduzione
L'ubiquitina è una proteina evolutivamente conservata di 76 aminoacidi 1,2,3. L'ubiquitina lega covalentemente i residui di lisina sulle proteine bersaglio attraverso cascate che coinvolgono gli enzimi attivanti (E1), coniuganti (E2) e ligasi (E3). L'ubiquitina viene prima attivata dall'enzima E1 e quindi trasferita agli enzimi coniuganti E2. Successivamente, le ubiquitina ligasi E3 interagiscono sia con gli enzimi E2 caricati con ubiquitina che con le proteine del substrato e mediano la formazione di un legame isopeptidico tra il C-terminale dell'ubiquitina e un residuo di l....
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Protocollo
NOTA: Le cellule H1299 sono state gentilmente fornite dalla Banca delle cellule staminali, Accademia cinese delle scienze e si sono dimostrate negative per la contaminazione da micoplasma.
1. Coltura cellulare
- Per la coltura iniziale, posizionare 1 x 106 cellule della linea cellulare di adenocarcinoma polmonare umano, H1299 in una capsula di Petri da 10 cm con 10-12 ml di terreno RPMI 1640 integrato con siero bovino fetale (FBS) al 1%, additivo glutamminico all'1%, piruvato di sodio all'1% e antibiotici (100 U/mL di penicillina e 100 μg/ml di streptomicina). Mantenere le celle a 37 °C in un incubatore u....
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Risultati
Il diagramma schematico mostra le proteine p53 marcate con bandiera (Flag-p53) e ubiquitina (HH-Ub) con doppia marcatura His/HA (Figura 1A). Le procedure utilizzate per purificare le proteine ubiquitinate sono riassunte nella Figura 1B. L'ubiquitina Poly-His-taggata può essere legata alle proteine bersaglio nelle cellule di mammifero. Le proteine ubiquitinate possono essere purificate con sfere Flag/M2 in condizioni di non denaturazione o mediante cromatografia .......
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Discussione
L'ubiquitinazione svolge un ruolo critico in quasi tutti i processi cellulari fisiologici e patologici2. Negli ultimi anni, sono stati fatti grandi progressi nella comprensione del ruolo molecolare dell'ubiquitina nelle vie di segnalazione e di come i cambiamenti nel sistema dell'ubiquitina portino a diverse malattie umane2. La purificazione delle proteine ubiquitinate contribuisce a fornire informazioni sui ruoli esatti dell'ubiquitinazione in questi processi. Le miscele d.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione della National Natural Science Foundation of China (81972624) a D.L.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| β-mercaptoetanolo | Sangon Biotech | M6250 | |
| Amersham ECL IgG di topo, Ab intero legato a HRP (da pecore) | GE healthcare | NA931 | Antibdoy secondario |
| Amersham ECL Rat IgG, Ab intero legato a HRP (da asino) | GE healthcare | NA935 | Antibdoy secondario |
| Anti-Flag M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220 | FLAG/M2 beads |
| Anticorpo monocolonale anti-GFP | Santa cruz | sc-9996 | Anticorpo primario |
| Anti-HA Alta affinità | Roche | 11867423001 | Anticorpo primario |
| Anticorpo monocolonale anti-Mdm2 (SMP14) | Santa cruz | sc-965 | Anticorpo primario |
| Anticorpo monocolonale anti-p53 (DO-1) | Santa cruz | sc-126 | Anticorpo |
| primario EDTA | Sigma-Alddich | E5134 | solvente |
| Siero fetale bovino | VivaCell | C04001-500 | FBS |
| FLAG Peptide | Sigma-Alddich | F3290 | Preparare il tampone di eluizione |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | integratore |
| Guanidina-HCI | Sangon Biotech | A100287-0500 | solvente |
| H1299 | Banca di cellule staminali, Accademia cinese di Scienze | ||
| Laboratorio di immagini | Bio-rad | software | |
| Immidazolo | Sangon Biotech | A500529-0100 | solvente |
| Immobilon Western Chemiluminescente HRP Substrato | Millipore | WBKLS0500 | |
| Lipofectamina 2000 reagenti | Invitrogen | 11668019 | Reagente di trasfezione |
| MG132 | MedChemExpress | HY-13259 | Inibitore del proteasoma |
| Na2HPO4 | Sangon Biotech | A501727-0500 | solvente |
| NaCl | Sangon Biotech | A610476-0005 | solvente |
| NaF | Sigma-Alddich | 201154 | solvente |
| NaH2PO4 | Sangon Biotech | A501726-0500 | solvente |
| Ni-NTA agarosio | QIAGEN | 30230 | resina caricata con nichel |
| Membrana di tamponamento in nitrocellulosa | GE healthcare | 10600002 | 0,45 &; m dimensione dei pori |
| Opti-MEM siero ridotto mezzo | Gibco | 31985-070 | mezzo di trasfezione |
| PBS | Corning | 21-040-cv | |
| Soluzione di penicillina-streptomicina | Sangon Biotech | E607011-0100 | cocktail di |
| antibiotici inibitori della proteasi | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| RPMI 1640 | Biological Industries | 01-100-1ACS | medio |
| Sarkosyl | Sigma-Alddich | L5777 | solvente |
| SDS Caricamento Tampone | Beyotime | P0015L | |
| Piruvato di sodio | Gibco | 11360-070 | integratore |
| Tris-base | Sangon Biotech | A501492-0005 | solvente |
| Tris-HCI | Sangon Biotech | A610103-0250 | solvente |
| Triton Reagente X-100 | Sangon Biotech | A110694-0500 | |
| Tween-20 | Integratore Sangon Biotech | A100777-0500 | |
| Sistema di imaging a chemiluminescenza ad altissima sensibilità Bio-rad | ChemiDoc XRS+ | ||
| Urea | Sangon Biotech | A510907-0500 |
Riferimenti
- Kwon, Y. T., Ciechanover, A. The ubiquitin code in the ubiquitin-proteasome system and autophagy. Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 873-886 (2017).
- Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine.
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Ristampe e permessi
