Zebrafish Corneal Wound Healing: dall'abrasione all'analisi di imaging della chiusura della ferita

Poiché la maggior parte degli epiteli sono a contatto con l'ambiente esterno, sono soggetti a lesioni fisiche, rendendoli adatti per lo studio dei processi di guarigione delle ferite. Tra i tessuti ben studiati, la cornea è un modello estremamente utile nello studio degli aspetti cellulari e molecolari della guarigione delle ferite. Come superficie esterna trasparente, fornisce protezione fisica all'occhio ed è il primo elemento a focalizzare la luce sulla retina. Mentre la struttura e la composizione cellulare della retina differiscono tra la specie¹, questi elementi della cornea sono generalmente simili in tutti gli occhi di tipo camera, indipendentemente dalla specie.

La cornea è composta da tre strati principali². Il primo e più esterno strato è l'epitelio, che viene costantemente rinnovato per garantirne la trasparenza. Il secondo strato è lo stroma, che contiene cellule sparse, chiamate cheratociti, all'interno di uno spesso strato di fibre di collagene rigorosamente organizzate. Il terzo e più interno strato è l'endotelio, che consente la diffusione di nutrienti e liquidi dalla camera anteriore agli strati esterni. Le cellule epiteliali e stromali interagiscono attraverso fattori di crescita e citochine³. Questa interazione è evidenziata dalla rapida apoptosi e dalla successiva proliferazione dei cheratociti dopo danno epiteliale ^4,5. In caso di una ferita più profonda, come una puntura, i cheratociti prendono parte attiva al processo di guarigione⁶.

Essendo a contatto con l'ambiente esterno, le lesioni fisiche corneali sono comuni. Molti di loro sono causati da piccoli oggetti estranei⁷, come sabbia o polvere. Il riflesso dello sfregamento degli occhi può portare a estese abrasioni epiteliali e rimodellamento corneale⁸. Secondo le dimensioni e la profondità della ferita, queste lesioni fisiche sono dolorose e richiedono diversi giorni per guarire⁹. Le caratteristiche ottimali di guarigione delle ferite di un modello facilitano la comprensione degli aspetti cellulari e molecolari della chiusura della ferita. Inoltre, tali modelli si sono dimostrati utili anche per testare nuove molecole con il potenziale di accelerare la guarigione corneale, come precedentemente dimostrato^10,11.

Il protocollo qui descritto mira a utilizzare il pesce zebra come modello rilevante per studiare le lesioni fisiche corneali. Questo modello è molto conveniente per gli studi di screening farmacologico in quanto consente di aggiungere molecole direttamente all'acqua del serbatoio e, quindi, di entrare in contatto con una cornea curativa. I dettagli forniti qui aiuteranno gli scienziati a eseguire i loro studi sul modello di zebrafish. La lesione in vivo viene eseguita con una bava oculare opaca. L'impatto sulle cellule epiteliali adiacenti o a distanza da esso può essere analizzato rimuovendo specificamente l'epitelio corneale centrale. Negli ultimi anni, numerosi rapporti si sono concentrati su tale metodo sulla cornea dei roditori 12,13,14,15,16,17; tuttavia, ad oggi, solo un singolo rapporto ha applicato questo metodo al pesce zebra¹⁸.

A causa della sua semplicità, la ferita fisica è utile per delineare il ruolo delle cellule epiteliali nella chiusura della ferita. Un altro modello ben consolidato di danno corneale è l'ustione chimica, in particolare l'ustione alcalina 19,20,21. Tuttavia, un tale approccio danneggia indirettamente l'intera superficie oculare, compresa la cornea periferica e lo stroma corneale¹⁹. In effetti, le ustioni alcaline potenzialmente inducono ulcere corneali, perforazioni, opacizzazione epiteliale e rapida neovascolarizzazione²², e l'esito incontrollabile delle ustioni alcaline squalifica tale approccio per gli studi generali di guarigione delle ferite. Numerosi altri metodi sono utilizzati anche per studiare la guarigione delle ferite corneali secondo il particolare focus dello studio in questione (ad esempio, debridement epiteliale completo²³, la combinazione di lesioni chimiche e meccaniche per ferite a spessore parziale²⁴, ablazione laser ad eccimeri per ferite che si estendono allo stroma²⁵). L'uso di una bava oculare limita il punto focale alla risposta epiteliale alla ferita e fornisce una ferita altamente riproducibile.

Come con ogni metodo di inflizione della ferita, l'uso di una bava oculare presenta vantaggi e svantaggi. Lo svantaggio principale è che la risposta essendo per lo più epiteliale, non riflette perfettamente le abrasioni osservate in ambito clinico. Tuttavia, questo metodo presenta numerosi vantaggi, tra cui la facilità con cui può essere impostato ed eseguito, la sua precisione, la sua riproducibilità e il fatto che non sia invasivo, rendendolo un metodo ben tollerato dagli animali.

Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal consiglio nazionale per gli esperimenti sugli animali.

1. Preparativi

1. Preparare in anticipo la soluzione madre di tricaina utilizzata per l'anestesia²⁶ (soluzione madre allo 0,4% utilizzata in questo protocollo). Utilizzare guanti e tenere i materiali in una cappa aspirante quando possibile.
   1. Per 50 ml di una soluzione allo 0,4%, pesare 200 mg di polvere di tricaina in un tubo da 50 ml. Sciogliere la polvere in circa 45 ml di acqua a doppio distillato.
   2. Regolare il pH della soluzione madre di tricaina a 7 con 1 M Tris (pH 8,8, ~1,25 mL). Aggiungere la soluzione di Tris allo stock di tricaina in aliquote, mescolare accuratamente il brodo dopo ogni aliquota e controllare il pH dopo ogni aggiunta di Tris.
2. Prima dell'esperimento, preparare una soluzione di lavoro allo 0,02% di tricaina.
   1. Scongelare 2 mL di soluzione madre allo 0,4% e aggiungere a 40 mL di acqua di sistema (concentrazione finale 0,02%). Posizionare la soluzione in un piccolo contenitore.
3. Prima dell'esperimento, preparare l'acqua di recupero contenente analgesico. Utilizzare guanti e tenere i materiali nel cappuccio dei fumi quando possibile.
   1. Per un litro di acqua di recupero, pesare 2,5 mg di lidocaina cloridrato in polvere e scioglierlo in acqua dolce del sistema. Controllare il pH e regolare a 7 se necessario.
4. Prima dell'esperimento, preparare la soluzione fissante (glutaraldeide al 2,5% in soluzione di fosfato di sodio 0,1 M (Na-PO₄) a pH 7,4). Utilizzare guanti e tenere i materiali in una cappa aspirante.
   1. Per 10 mL della soluzione di fissaggio, pipettare 5 mL di 0,2 M Na-PO₄ in un tubo. Aggiungere 0,5 ml di glutaraldeide al 50% e aggiungere acqua a doppio distillato per ottenere il volume finale di 10 ml. Proteggere la soluzione dalla luce e conservarla sul ghiaccio o in frigorifero prima dell'uso.
      NOTA: se i campioni devono essere raccolti per diverse ore dopo l'avvolgimento, preparare la soluzione fissante appena prima dell'uso.
5. Preparare l'attrezzatura per il ferimento (Figura 1).
   1. Riempire i serbatoi di recupero o i contenitori più piccoli con acqua di sistema.
   2. Avere la bava oftalmica pronta. Controllare che la punta della bava sia pulita. Se necessario, rimuovere i detriti cellulari con un batuffolo di cotone umido.
   3. Fai un'incisione sul lato di una spugna morbida e inumidisci la spugna con acqua di sistema. Posizionare la spugna sulla base/ stadio di un microscopio di dissezione. Garantire uno spazio di lavoro sufficiente per l'utilizzo della bava e un'illuminazione sufficiente dai lati e/o dall'alto per vedere correttamente la superficie dell'occhio.

2. Anestesia

1. Trasferire un pesce dall'acquario alla soluzione di tricaina allo 0,02% con una rete il più delicatamente possibile.
2. Monitorare l'anestesia, verificando la mancanza di risposta allo stimolo meccanico della luce.
   NOTA: per un'anestesia coerente, viene utilizzata un'esposizione di 2 minuti alla tricaina prima dell'abrasione con pesci AB selvatici adulti. Con pesci di altro background genetico, potrebbe essere necessaria una durata diversa.

3. Abrasione

1. Posizionare delicatamente il pesce anestetizzato con un cucchiaio nell'incisione sulla spugna, con la testa sporgente dalla superficie della spugna.
2. Accendere la bava e focalizzare la vista del microscopio sulla superficie dell'occhio.
3. Avvicinarsi con attenzione alla superficie dell'occhio con la punta della bava. Quando tocchi la superficie dell'occhio, inizia a muovere la punta della bava sulla superficie dell'occhio con un movimento circolare. Evitare movimenti improvvisi, in quanto potrebbero portare all'inclinazione dell'occhio nella presa e alla punta della bava per scivolare.
4. Quando l'abrasione è fatta, posizionare con cura il pesce nell'acqua di sistema contenente l'analgesico per il recupero.
5. Pulire la bava subito dopo l'uso con un batuffolo di cotone umido.

4. Raccolta di campioni

1. Nel momento desiderato, raccogliere il pesce con una rete e metterlo in soluzione di tricaina allo 0,02%. Tenere l'animale nella soluzione fino a quando il movimento opercolare non è cessato completamente e il pesce non reagisce al tatto.
2. Metti il pesce su una capsula di Petri con un cucchiaio e tienilo con una pinzetta. Decapitare il pesce con le forbici sezionanti. Evitare di fare graffi sulla superficie dell'occhio durante la manipolazione del campione.
3. Mettere il tessuto in una provetta contenente 0,1 M Na-PO₄.
   1. Risciacquare il tessuto sostituendo il Na-PO₄ 0,1 M con un tampone pulito in modo che non rimanga sangue nella soluzione.

5. Elaborazione del campione per microscopia elettronica

1. Fissare il tessuto in glutaraldeide al 2,5%/0,1 M Na-PO₄ (pH 7,4) per ~24 h a +4 °C. Tenere il campione su un portacampioni rotante/tremante per garantire una corretta fissazione.
2. Rimuovere la soluzione fissante e risciacquare il campione più volte con 0,1 M Na-PO₄.
3. Sezionare il campione a questo punto.
   1. Posizionare il campione su una goccia di 0,1 M Na-PO₄ su una piastra di dissezione. Se entrambi gli occhi dello stesso pesce devono essere ripresi, tagliare il campione di testa in due con forbici da dissezione fine.
   2. In alternativa, raccogliere gli occhi solo posizionando con cura le punte delle pinzette sottili nell'orbita oculare dal lato dell'occhio, facendo particolare attenzione a non graffiare la superficie dell'occhio. Quindi, estrarre l'occhio dalla presa.
   3. Trasferire il campione sezionato in una provetta contenente 0,1 M Na-PO₄. Assicurarsi che non vi sia tessuto extra nella provetta del campione, in quanto potrebbe aderire alla parte superiore dell'occhio durante l'elaborazione del campione.
4. Conservare il campione in 0,1 M Na-PO₄ (massimo una settimana) a +4 °C.
5. Elaborare i campioni per l'imaging al microscopio elettronico.
   1. Postfiggere i campioni in tetrossido di osmio al 2% in tampone Na-PO_{4 da} 0,1 M per 1 ora a temperatura ambiente (RT).
   2. Lavare i campioni 3 volte per 5 minuti ogni lavaggio in 0,1 M Na-PO₄ a RT.
   3. Disidratare i campioni successivamente in etanolo al 30%, 50% e 70% per 1 ora in ogni soluzione a RT.
   4. Immergere i campioni in etanolo al 96% per 2-3 ore a RT.
   5. Successivamente, incubare i campioni due volte in etanolo al 100%, prima per 1 ora e poi in etanolo fresco al 100% durante la notte a +4 °C.
   6. Sottoporre i campioni a 30 cicli in un essiccatore automatico a punti critici.
6. Incorporare e rivestire in platino i campioni.
   1. Posizionare una linguetta adesiva su un supporto. Se il campione deve essere contrassegnato sulla parte superiore del supporto, lasciare un pezzo di carta da copertina della scheda sulla scheda e scrivere l'ID del campione sulla carta.
   2. Posizionare il supporto con la linguetta sulla base di un microscopio di dissezione.
   3. Posizionare delicatamente il campione di tessuto sul supporto con una pinzetta fine, la cornea rivolta verso l'alto.
   4. Rivestire il campione con platino utilizzando il dispositivo appropriato. Dopo il rivestimento, conservare i campioni a temperatura ambiente fino all'imaging.

6. Imaging (Figura 2)

1. Utilizzare i dispositivi come consigliato nel manuale dell'utente e dagli esperti di imaging.
2. Acquisisci immagini dell'ingrandimento desiderato e utilizza immagini 2.000-2.500x per l'analisi.
3. Regola la luminosità e il contrasto in modo che non ci siano aree sovraesposte nell'immagine e i bordi delle celle e le microridge siano visti nel modo più chiaro possibile.
   NOTA: la posizione e l'angolo del tessuto influiscono sulle impostazioni di luminosità e contrasto. Potrebbe essere necessario regolarli da campione a campione e tra diverse regioni del tessuto.

7. Misurazione della forma, delle dimensioni e del modello di microridge della cella

1. Aprire l'immagine TIFF in Fiji ImageJ 1.53²⁷. Impostate la scala utilizzando la barra della scala dell'immagine: create una linea di dimensioni uguali alla barra della scala con lo strumento linea . Seleziona Analizza | Impostare la scala e digitare la distanza nota. Aprire il ROI manager dal | Analizza Menu Strumenti .
2. Per le dimensioni e l'rotondità della cella, selezionate Analizza | Impostare le misure | Descrittori di forma. Utilizzare lo strumento Lente di ingrandimento per visualizzare le celle in ingrandimento. Selezionare le celle con lo strumento Poligono e aggiungere ogni selezione al gestore del ROI. Infine, misurare le celle selezionate e salvare la misurazione.
3. Analisi di Microridge (Figura 3 e Figura 4)
   1. Assicurarsi che l'immagine sia in formato a 8 bit dal | Menu Tipo .
   2. Selezionate una cella con lo strumento Poligono e cancellate lo sfondo da Modifica | Chiaro all'esterno.
   3. Smussate l'immagine da una a tre volte selezionando Elabora | Fluida e regola la luminosità e il contrasto da Image | Regolare | Luminosità / Contrasto in modo che le microridge si distinguano nel modo più chiaro possibile.
   4. Convolvere l'immagine da Process | Filtri | Convolvere, trasforma in binario da Process | | binaria Crea binario e scheletra l'immagine in bianco e nero selezionando Elabora | | binaria Scheletrare.
   5. Utilizzare la funzione Analizza ossatura nel | Analizza Menu Scheletro per misurare i parametri microridge e salvare i valori.
      NOTA: in SEM, le singole immagini possono differire in termini di luminosità e contrasto. Pertanto, i passaggi dell'analisi potrebbero richiedere regolazioni da un'immagine all'altra.

Questo studio descrive un metodo che utilizza una bava oftalmica in esperimenti di guarigione delle ferite corneali zebrafish. Il metodo è stato modificato da studi precedenti sui topi, dove la bava ha dimostrato di rimuovere gli strati cellulari epiteliali in modo efficiente13. Le sfide nel ferimento corneale del pesce zebra includono le dimensioni relativamente piccole dell'occhio e, nel caso di esperimenti che richiedono tempo, la necessità di mantenere un flusso d'acqua costante attraverso le branchie (come descritto da Xu e colleghi28). I principali vantaggi di questo metodo sono la sua semplicità e velocità. Un microscopio di dissezione standard viene utilizzato per l'uso controllato della bava (Figura 1). Poiché la procedura è di breve durata (circa 3 minuti dall'inizio dell'anestesia), il pesce si riprende bene dalla manipolazione e non è necessaria alcuna attrezzatura aggiuntiva per il mantenimento dell'anestesia e l'erogazione di ossigeno.

Esistono diversi modi per visualizzare la ferita corneale. Questo protocollo utilizza la microscopia elettronica a scansione (SEM, Figura 2), che ha una lunga storia di utilizzo negli studicorneali 29,30. Sebbene questo approccio non consenta una valutazione degli strati inferiori dell'epitelio, fornisce un metodo semplice per stimare la velocità di guarigione delle ferite e confrontare le superfici corneali di diverse regioni dell'occhio. A 3 ore dopo la ferita, mentre l'area della ferita è chiusa (Figura 2), il sito in cui sono uniti i bordi della ferita rimane visibile (Figura 2).

Le cellule superficiali sulla cornea del pesce zebra contengono microridge pronunciate31. Recentemente, uno studio ha riportato che queste strutture sono perse in cellule allungate adiacenti alle ferite sulla pelle di zebrafish32. Tuttavia, i risultati presentati mostrano che sull'epitelio corneale abraso, le microridge possono essere osservate in alcune cellule allungate vicino al sito della ferita (Figura 4B). In alcune regioni periferiche, le microridge vengono perse dal centro della cellula (Figura 4C, D). Per un'analisi più dettagliata, l'area e la rotondità delle cellule apicali sono quantificate, oltre alla quantità di microridge e alla lunghezza media in ImageJ27 (Figura 3 e Figura 4E-H).

L'analisi della microridge viene eseguita utilizzando la funzione Skeleton (modificata da van Loon e colleghi33). Un confronto tra le due regioni periferiche (Figura 4A (regioni C e D), Figura 4C e Figura 4D) rivela che le cellule nella Figura 4D sono più allungate (indicando riarrangiamenti cellulari come reazione alla ferita) e hanno microridge medie più corte rispetto alle cellule nella Figura 4C. Questo risultato suggerisce che il cambiamento nella forma cellulare è correlato con la modifica della microridge e sottolinea l'eterogeneità all'interno dell'epitelio corneale nella risposta della ferita.

Misurare l'area e la rotondità delle cellule apicali su immagini SEM è un modo semplice e riproducibile per ottenere dati quantitativi sull'aspetto cellulare in diverse regioni della cornea. Sebbene limitato al 2D, questo approccio aiuta ad acquisire una comprensione generale della dinamica e della velocità dei riarrangiamenti cellulari durante la chiusura della ferita. Le immagini SEM vengono utilizzate per analizzare i modelli di microridge sulla superficie della cellula apicale. L'elaborazione delle immagini qui descritta fornisce un'approssimazione dei cambiamenti nei parametri microridge, che sarebbe noioso misurare a mano.

Figura 1: La configurazione per l'abrasione corneale. (A) Un microscopio di dissezione è necessario per l'abrasione controllata sul piccolo occhio di zebrafish. (B) La spugna aiuta a stabilizzare il pesce anestetizzato durante la procedura. (C) Il pesce viene anestetizzato su una capsula di Petri e l'animale anestetizzato viene trasferito sulla spugna con un cucchiaino. Una bava oculare con una punta di 0,5 mm viene utilizzata per abradere la cornea. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Visualizzazione della cornea ferita con microscopia elettronica a scansione. La panoramica della cornea abrasa raccolta a 0, 1, 2 o 3 ore dopo la ferita (HPW). Il contorno tratteggiato indica il bordo della ferita. Barre di scala = 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Un esempio di modifica dell'immagine prima della misurazione della microridge. Sebbene non sia una replica esatta della superficie cellulare originale, il modello scheletrato finale cattura le differenze tra il centro cellulare e la periferia. Barra della scala = 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Un confronto tra l'area delle cellule apicali, la rotondità e i valori di microridge tra due regioni periferiche dopo l'abrasione corneale. (A) Una panoramica dell'occhio ferito. Le caselle indicano la posizione delle immagini di ingrandimento superiore (in B, C e D). (C, D) Le celle selezionate per l'analisi del descrittore di forma sono contrassegnate da un contorno verde. (E, F) Valori di area cellulare apicale (E) e rotondità (F) delle celle selezionate. (G, H) Microridge lunghezza totale (G) e lunghezza media (H) delle stesse celle. I gruppi sono stati confrontati statisticamente con un t-test a due code (*p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01) Barre di scala = 500 μm in A, 50 μm in B, C e D. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.