Questo protocollo si concentra sul danneggiamento della superficie oculare del pesce zebra attraverso l'abrasione per valutare la successiva chiusura della ferita a livello cellulare. Questo approccio sfrutta una bava oculare per rimuovere parzialmente l'epitelio corneale e utilizza la microscopia elettronica a scansione per tracciare i cambiamenti nella morfologia cellulare durante la chiusura della ferita.
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Articolo metodologico
Zebrafish Corneal Wound Healing: dall'abrasione all'analisi di imaging della chiusura della ferita
In questo articolo
Sommario
Abstract
Come la superficie trasparente dell'occhio, la cornea è strumentale per la visione chiara. A causa della sua posizione, questo tessuto è soggetto a insulti ambientali. In effetti, le lesioni oculari più frequentemente riscontrate clinicamente sono quelle alla cornea. Mentre la guarigione delle ferite corneali è stata ampiamente studiata nei piccoli mammiferi (cioè topi, ratti e conigli), gli studi di fisiologia corneale hanno trascurato altre specie, incluso il pesce zebra, nonostante il pesce zebra sia un classico modello di ricerca.
Questo rapporto descrive un metodo per eseguire un'abrasione corneale sul pesce zebra. La ferita viene eseguita in vivo su pesci anestetizzati utilizzando una bava oculare. Questo metodo consente una ferita epiteliale riproducibile, lasciando intatto il resto dell'occhio. Dopo l'abrasione, la chiusura della ferita viene monitorata nel corso di 3 ore, dopo di che la ferita viene rielettileializzata. Utilizzando la microscopia elettronica a scansione, seguita dall'elaborazione delle immagini, la forma della cellula epiteliale e le protrusioni apicali possono essere studiate per studiare i vari passaggi durante la chiusura della ferita epiteliale corneale.
Le caratteristiche del modello zebrafish consentono lo studio della fisiologia del tessuto epiteliale e del comportamento collettivo delle cellule epiteliali quando il tessuto viene sfidato. Inoltre, l'uso di un modello privato dell'influenza del film lacrimale può produrre nuove risposte per quanto riguarda la risposta corneale allo stress. Infine, questo modello permette anche la delineazione degli eventi cellulari e molecolari coinvolti in qualsiasi tessuto epiteliale sottoposto ad una ferita fisica. Questo metodo può essere applicato alla valutazione dell'efficacia del farmaco nei test preclinici.
Introduzione
Poiché la maggior parte degli epiteli sono a contatto con l'ambiente esterno, sono soggetti a lesioni fisiche, rendendoli adatti per lo studio dei processi di guarigione delle ferite. Tra i tessuti ben studiati, la cornea è un modello estremamente utile nello studio degli aspetti cellulari e molecolari della guarigione delle ferite. Come superficie esterna trasparente, fornisce protezione fisica all'occhio ed è il primo elemento a focalizzare la luce sulla retina. Mentre la struttura e la composizione cellulare della retina differiscono tra la specie1, questi elementi della cornea sono generalmente simili in tutti gli occhi di tipo camera, indi....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal consiglio nazionale per gli esperimenti sugli animali.
1. Preparativi
- Preparare in anticipo la soluzione madre di tricaina utilizzata per l'anestesia26 (soluzione madre allo 0,4% utilizzata in questo protocollo). Utilizzare guanti e tenere i materiali in una cappa aspirante quando possibile.
- Per 50 ml di una soluzione allo 0,4%, pesare 200 mg di polvere di tricaina in un tubo da 50 ml. Sciogliere la polvere in circa 45 ml di acqua a doppio distillato.
- Regolare il pH della soluzione madre di tricaina a 7 con 1 M Tris (pH 8,8, ....
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Risultati
Questo studio descrive un metodo che utilizza una bava oftalmica in esperimenti di guarigione delle ferite corneali zebrafish. Il metodo è stato modificato da studi precedenti sui topi, dove la bava ha dimostrato di rimuovere gli strati cellulari epiteliali in modo efficiente13. Le sfide nel ferimento corneale del pesce zebra includono le dimensioni relativamente piccole dell'occhio e, nel caso di esperimenti che richiedono tempo, la necessità di mantenere un flusso d'acqua costante attraverso le .......
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Discussione
Le lesioni fisiche corneali sono la causa più comune di visite dei pazienti oftalmologici in ospedale. Pertanto, è importante stabilire modelli pertinenti per lo studio di diversi aspetti della fisiopatologia corneale. Finora, il topo è il modello più comunemente usato per lo studio della guarigione delle ferite corneali. Tuttavia, l'aggiunta di colliri sugli occhi feriti murini per convalidare l'impatto di farmaci specifici sulla guarigione delle ferite corneali può essere difficile. A questo proposito, il modello zebra.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Pertti Panula per l'accesso all'unità Zebrafish e Henri Koivula per la guida e l'aiuto con gli esperimenti di zebrafish. Questa ricerca è stata sostenuta dall'Accademia di Finlandia, dalla Fondazione Jane e Aatos Erkko, dalla Fondazione culturale finlandese e dal programma ATIP-Avenir. L'imaging è stato eseguito presso l'unità di microscopia elettronica e l'unità di microscopia ottica, Istituto di biotecnologia, supportato da HiLIFE e Biocenter Finland.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,1 M Na-PO4 (tampone fosfato di sodio), pH 7,4 | interna | è preparata da 1 M di tampone fosfato di sodio (1 M Na2 HPO4 regolato a pH 7,4 con 1 M NaH2 PO4 ). | |
| 0,2 M Na-PO4 (tampone fosfato di sodio), pH 7,4 | La soluzione interna | è preparata da 1 M di tampone fosfato di sodio (1 M Na2 HPO4 regolato a pH 7,4 con 1 M NaH2 PO4 ). | |
| Punte di fresa da 0,5 mm | Alger Equipment Company | BU-5S | |
| 1M Tris, pH 8,8 | |||
| Agar Scientific | G3347N | ||
| Fresa Algerbrush, strumento completo | Alger Equipment Company | BR2-5 | |
| Scambi di cotone | Heinz Herenz Amburgo | 1030128 | |
| Piastra | di dissezionestrumenti | ||
| Fine Science Tools | |||
| distillata doppia | Eppedorf interne | ||
| , 2ml | qualsiasi fornitore | ||
| Etile 3-amminobenzoato metansolfonato sale | Sigma | A5040 | Attenzione: provoca irritazione. |
| Glutaraldeide, soluzione acquosa al 50%, grado I | Sigma | G7651 | Attenzione: tossico. |
| Lidocaina cloridrato | Sigma | L5647 | Attenzione: tossico. |
| monta | Agar Scientific | G301P | |
| Piastra di Petri | Thermo Scientific | 101VR20 | |
| Strisce indicatrici di pH | Macherey-Nagel | 92110 | |
| Cucchiai di plastica | qualsiasi fornitore | ||
| Tubi di plastica, 15 ml | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Tubi di plastica, 50 ml | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Microscopio elettronico a scansione | FEI | Quanta 250 FEG | |
| Spugna morbida | qualsiasi fornitore | ||
| Sputter coater | Quorum Technologies | GQ150TS | |
| Stereomicroscopio | Leica |
Riferimenti
- Baden, T., Euler, T., Berens, P. Understanding the retinal basis of vision across species. Nature Reviews.Neuroscience. 21 (1), 5-20 (2020).
- Nishida, T., Saika, S., Morishige, N. Cornea and sclera: Anatomy and physiology. Cornea: Fundamentals, diagnosis and management, 4th ed. Manis, ....
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Ristampe e permessi
