Le cellule staminali mesenchimali infrarotulee (IFP-MSC) possono essere isolate facilmente dal cuscinetto adiposo infrarotuleo dell'articolazione del ginocchio. Proliferano bene in vitro, formano colonie CFU-F e si differenziano in linee adipogeniche, condrogeniche e osteogeniche. Qui viene fornita la metodologia per l'isolamento, l'espansione e la differenziazione delle IFP-MSC dall'articolazione del soffocamento della capra.
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Articolo metodologico
Isolamento, espansione e differenziazione delle cellule staminali mesenchimali dal cuscinetto di grasso infrarotuleo dell'articolazione soffocante della capra
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'IFP, presente nell'articolazione del ginocchio, funge da fonte promettente di MSC. L'IFP è un tessuto facilmente accessibile in quanto viene regolarmente resecato e scartato durante le procedure artroscopiche e gli interventi chirurgici di sostituzione del ginocchio. Inoltre, la sua rimozione è associata a una morbilità minima del sito donatore. Studi recenti hanno dimostrato che le IFP-MSC non perdono la loro capacità di proliferazione durante l'espansione in vitro e hanno un potenziale di differenziazione osteogenica indipendente dall'età. Le IFP-MSC possiedono un potenziale di differenziazione condrogena superiore rispetto alle MSC derivate dal midollo osseo (BMSC) e alle cellule staminali derivate dal tessuto adiposo (ADSC). Sebbene queste cellule siano facilmente ottenibili da pazienti anziani e malati, la loro efficacia è limitata. Pertanto, l'utilizzo di IFP-MSC da donatori sani è importante per determinare la loro efficacia nelle applicazioni biomediche. Poiché l'accesso a un donatore umano sano è difficile, i modelli animali potrebbero essere un'alternativa migliore per consentire la comprensione fondamentale. Grandi animali come cani, cavalli, pecore e capre svolgono un ruolo cruciale nella ricerca traslazionale. Tra questi, la capra potrebbe essere un modello preferito poiché l'articolazione soffocante della capra ha l'anatomia più vicina all'articolazione del ginocchio umano. Inoltre, l'IFP di capra può soddisfare i numeri MSC più elevati necessari per le applicazioni di rigenerazione dei tessuti. Inoltre, il basso costo, la disponibilità e la conformità ai principi 3R per la ricerca sugli animali li rendono un modello attraente. Questo studio dimostra un semplice protocollo per isolare le IFP-MSC dall'articolazione soffocante delle capre e dalle condizioni di coltura in vitro per la loro espansione e differenziazione. L'IFP asettico isolato dalla capra è stato lavato, tritato e digerito enzimaticamente. Dopo la filtrazione e la centrifugazione, le cellule raccolte sono state coltivate. Queste cellule erano aderenti, avevano una morfologia simile alle MSC e dimostravano una notevole capacità clonogenica. Inoltre, si sono differenziati in linee adipogeniche, condrogeniche e osteogeniche, dimostrando la loro multipotenza. In conclusione, lo studio dimostra l'isolamento e l'espansione delle MSC, che mostrano il potenziale nelle applicazioni di ingegneria tissutale e medicina rigenerativa.
Introduzione
Le cellule staminali mesenchimali (MSC) sono un candidato interessante per le terapie cellulari nella medicina rigenerativa 1,2. Possono essere raccolti da una varietà di fonti tissutali come midollo osseo, cordone ombelicale, placenta, polpa dentale e tessuto adiposo sottocutaneo3. Tuttavia, poiché la disponibilità di cellule staminali negli adulti è limitata e la loro procedura di isolamento è spesso invasiva (con conseguente morbilità del sito donatore), è auspicabile avere una fonte alternativa di cellule staminali che potrebbe aggirare queste sfide.
L'ar....
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Protocollo
Il protocollo si basa sull'isolamento delle IFP-MSC dalle capre. Capra IFP e sangue sono stati raccolti da un mattatoio locale. Poiché tali collezioni di tessuti sono al di fuori della competenza di un comitato etico istituzionale per gli animali, non era richiesta l'approvazione etica.
1. Isolamento delle IFP-MSC dall'articolazione femorotibiale del ginocchio di capra
- Raccogliere l'articolazione femorotibiale della capra (campione) che comprende ~ 15 cm ciascuna delle regioni femorali e tibiali degli arti posteriori. Posizionare immediatamente il campione in una scatola di raccolta del campione sterilizzata e con....
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Risultati
Isolamento delle IFP-MSC dall'articolazione femorotibiale della capra
Le fasi coinvolte nell'isolamento delle IFP-MSC dall'articolazione soffocante di una capra sono illustrate nella Figura 1. Il cuscinetto adiposo presente nella superficie interna non articolata della rotula è stato rimosso, tritato e digerito enzimaticamente. Le IFP-MSC sono state isolate e coltivate con successo in vitro (Figura 2A).
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Discussione
Nel presente protocollo è stato fornito un metodo semplice, affidabile e riproducibile per l'isolamento delle MSC dall'IFP caprino. Le cellule isolate con questo metodo sono state utilizzate con successo nei nostri precedenti studi per la rigenerazione tissutale in vitro. È stato osservato che le cellule isolate erano proliferative, rispondevano a vari fattori di crescita e conservavano la loro attività biologica quando seminate su fibre elettrofilate e scaffold25,26
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
SH riconosce il supporto dell'Institute Post-Doctoral Fellowship di IIT Kanpur e la sovvenzione SYST di DST (SEED Division) (SP / YO / 618 / 2018). AM riconosce l'Indian Institute of Technology-Kanpur (IIT-Kanpur) per una borsa di studio dell'Istituto. DSK riconosce Gireesh Jankinath Chair Professorship e Department of Biotechnology, India, per il finanziamento (BT / PR22445 / MED / 32/571 / 2016). AM, SH e DSK ringraziano il Mehta Family Centre for Engineering in Medicine di IIT-Kanpur per il loro generoso supporto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| β-glicerofosfato | Sigma-Aldrich | G9422-10G | 10 mM |
| 0,25% Tripsina- 0,02% EDTA | Hi-Media | TCL049 | |
| 15-mL provetta da centrifuga | Corning | ||
| 2-Fosfo-L-ascorbico acido trisodico sale Sigma | 49752-10G | 50 &; g/mL | |
| 2-propanolo | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonato acido (HEPES) | HiMedia | TCL021-50ml | 10 mM |
| 50-mL provetta da centrifuga | Corning | ||
| Alcian Blue | Hi-Media | RM471 | Per colorazione con gicosaminoglicani sufatti |
| Alizarin Red S | S D Fine-Chem Limited | 26048-25G | Per la deposizione di calcio |
| Amfotericina B | HiMedia | A011 | 2,5 µ g/mL |
| Fattore di crescita dei fibroblasti basici (bFGF) | Sino Biologicals | 10014-HNAE | 5 ng/mL |
| BCIP/NBT ALP Substrato | Sigma | B5655-5TAB | Per la colorazione ALP |
| Cabina | |||
| BSA | HiMedia | MB-083 | Nome lungo: Albumina sierica bovina (1,25 mg/mL |
| Filtro cellulare | HiMedia | TCP-182 | 70 µ m |
| Centrifuga | REMI | ||
| Ciprofloxacina | RANBAXY LAB. Edizione limitata | B17407T1 | 2,5 & micro; g/mL |
| Crystal Violet | S D Fine-Chem Limited | 42555 | |
| D(+)-glucosio | Merck | 1.94925.0521 | 25 mM |
| Desametasone | Sigma-Aldrich | D2915 | 1 µ M |
| DMEM LG | SIGMA | D5523 | Nome lungo: Dulbecco' s Aquila modificata' s Media Etanolo a basso contenuto di glucosio |
| Merck | 100983 | ||
| FBS | Gibco | 10270 | Nome lungo: Soluzione fetale di formaldeide sierica bovina |
| 37%-41% | Merck | 61780805001730 | |
| Indometacina | Sigma-Aldrich | I7378 | 100 &; M |
| Insulina | Sigma-Aldrich | I9278 | 10 µ g/mL |
| Microscopio invertito | Nikon Eclipse TS 100 | ||
| ITS + 1 | Sigma-Aldrich | I2521-5mL | Nome lungo: insulina, transferrina, selenito di sodio + linoleic-BSA |
| L-Prolina | HiMedia | TO-109-25G | 1 mM |
| Cloruro di magnesio | Merck | 61751605001730 | Per tampone di lisi |
| Metanolo | Meck | 1.07018.2521 | |
| Micropipette e puntali sterili (20 & micro; L, 200 & micro; L, 1000 & micro; L) | Thermoscientific | ||
| MUSE Analizzatore cellulare | Merck Millipore | Per il conteggio delle cellule | |
| OCT composto | Tissue-Tek | 4583 | Nome lungo: Temperatura di taglio ottimale |
| Olio Rosso O colorante | S D Fine-Chem Limited | 54304 | Per la colorazione del vacuolo lipidico |
| Penicillina-Streptomicina | HiMedia | A007 | 100 U/mL |
| Petri piastre (150 mm e 90 mm) | NEST | ||
| Safranin O | S D Fine-Chem Limited | 50240 | Per la colorazione con gicosaminoglicani sufatati |
| Citrato di sodio | Sigma-Aldrich | C3434 | 3,4 % (p/v) |
| Forbici, pinze e bisturi | Per l'isolamento di IFP-MSC | ||
| Saccarosio | Merck | 1.94953.0521 | 35 % (p/v) |
| TGF- β 1 | Sino Biologicals | Nome lungo: Fattore di crescita trasformante- β 1 (10 ng/mL) | |
| Incubatore per colture tissutali 37 gradi C, 5% CO2 | Thermoscientific | ||
| Tampone Tris | Merck | 61771405001730 | Per tampone di lisi |
| Triton X100 | S D Fine-Chem Limited | 40632 | Per tampone di lisi |
| Collagenasi di tipo II | Gibco | 17101015 | 1,5 mg/mL |
| Vitamina D3 | Sigma | C9756-1G | 10 pozzetti nM |
| (6 -WP e 24-WP) | nido |
Riferimenti
- Han, Y., et al. Mesenchymal stem cells for regenerative medicine. Cells. 8 (8), (2019).
- Pittenger, M. F., et al. Mesenchymal stem cell perspective: cell biology to clinical progress. NPJ Regenerative Medicine. 4 (1), 22(2019).
- Guo, Y., ....
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Ristampe e permessi
