Articolo metodologico

Formulazione e caratterizzazione di un sistema di trasporto della dopamina basato sugli esosomi

DOI:

10.3791/63624

⸱

4 aprile 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Vocational School of Health Services/İstanbul, Altinbas University, 2Chemical Metallurgy Faculty, Department of Bioengineering, Yildiz Technical University, 3Faculty of Medicine, Department of Histology & Embryology, Istinye University, 43D Bioprinting Design & Prototyping R&D Center, Istinye University, 5Stem Cell and Tissue Engineering R&D Center, Istinye University, 6Medicine Faculty, Istinye University, 7Vocational School of Health Services, Istinye University, 8The V. Akhundov National Scientific Research Medical Prophylactic Institute, 9Center for Stem Cells and Regenerative Medicine (LivMedCell), Liv Hospital

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, abbiamo mirato ad ottenere una formulazione caricando dopamina degli esosomi isolati di cellule staminali dalle cellule staminali mesenchimali gelatinose di Wharton. In questo protocollo vengono descritti l'isolamento e la caratterizzazione degli esosomi, il caricamento del farmaco negli esosomi risultanti e l'attività citotossica della formulazione sviluppata.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli esosomi di dimensioni comprese tra 40 e 200 nm costituiscono il sottogruppo più piccolo di vescicole extracellulari. Queste vescicole bioattive secrete dalle cellule svolgono un ruolo attivo nel carico e nella comunicazione intercellulare. Gli esosomi si trovano principalmente nei fluidi corporei come plasma, liquido cerebrospinale, urina, saliva, liquido amniotico, colostro, latte materno, liquido articolare, sperma e acido pleurico. Considerando le dimensioni degli esosomi, si pensa che possano svolgere un ruolo importante nelle malattie del sistema nervoso centrale perché possono passare attraverso la barriera emato-encefalica (BBB). Quindi, questo studio mirava a sviluppare un sistema di nanocarrier basato sugli esosomi incapsulando la dopamina in esosomi isolati dalle cellule staminali mesenchimali gelatinose di Wharton (WJ-MSCs). Gli esosomi che hanno superato il processo di caratterizzazione sono stati incubati con dopamina. Gli esosomi carichi di dopamina sono stati ricaratterizzati alla fine dell'incubazione. Gli esosomi carichi di dopamina sono stati studiati in saggi di rilascio di farmaci e citotossicità. I risultati hanno mostrato che la dopamina poteva essere incapsulata con successo all'interno degli esosomi e che gli esosomi carichi di dopamina non influenzavano la vitalità dei fibroblasti.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli esosomi, vescicole bioattive con caratteristiche significative, hanno dimensioni comprese tra 40 nm e 200 nm. Gli esosomi hanno origine dalla membrana cellulare e si formano a causa del rilascio degli endosomi1. Queste strutture fungono da comunicatori cellula-cellula e interagiscono con le cellule vicine per facilitare il trasferimento di molecole attive. Gli esosomi possono essere isolati da molte fonti diverse. Questi includono fluidi corporei come plasma, urina, liquido cerebrospinale, saliva e linee cellulari coltivate in condizioni di vitro . Gli esosomi hanno un ruolo importante nell'eliminazione dei danni ai nervi, grazie alle biomacromolecole che contengono, come lipidi, proteine e acidi nucleici2. La glia, che sono le cellule di supporto del sistema nervoso3, trasferisce proteine e micro RNA agli assoni dei neuroni attraverso gli esosomi4.

I lipidi che formano la guaina mielica, che sono una caratteristica della conduzione nervosa, vengono rilasciati anche dagli oligodendrociti attraverso gli esosomi 4,5. Gli esosomi sono anche coinvolti in processi come la plasticità sinaptica, la risposta allo stress neuronale, la comunicazione cellula-cellula e la neurogenesi nel cervello 6,7. Il fatto che gli esosomi possiedano dimensioni nanometriche consente loro di passare attraverso la BBB. Esiste una speciale via di transizione dal liquido interstiziale al liquido cerebrospinale dopo essere penetrata in questa membrana8. Grazie alle loro proprietà superficiali, gli esosomi possono interagire in modo efficiente con le cellule bersaglio come sistema di somministrazione dei farmaci e rilasciare attivamente i farmaci caricati.

A causa dell'espressione di varie proteine adesive (tetraspanine e integrine) sulla superficie degli esosomi, queste vescicole extracellulari possono facilmente interagire e fondersi con le membrane della cellula ospite9. Si ritiene che gli esosomi possano essere utilizzati come sistema di somministrazione di farmaci, soprattutto nel trattamento delle malattie del sistema nervoso centrale grazie alla loro capacità di penetrare nella BBB e alle loro proprietà superficiali. Gli esosomi derivati da cellule staminali mesenchimali (MSC) hanno un rischio inferiore di rigetto immunitario rispetto alle terapie cellulari allogeniche e, a questo proposito, possono essere una componente importante delle applicazioni di trattamento senza cellule10.

La dopamina è una molecola la cui carenza nel cervello è la caratteristica del morbo di Parkinson (PD), peggiorando di giorno in giorno11,12,13. È noto che la malattia di Parkinson è associata alla degenerazione dei neuroni dopaminergici nella substantia nigra del mesencefalo e alla perdita delle funzioni dei motoneuroni14,15. La morte dei neuroni dopaminergici impedisce l'apporto del neurotrasmettitore dopamina allo striato cerebrale. Questo, a sua volta, provoca l'emergere di sintomi specifici del morbo di Parkinson16. Questi sintomi della malattia di Parkinson sono la bradicinesia, l'instabilità posturale, la rigidità e soprattutto il tremore a riposo12,13. Sebbene la malattia di Parkinson sia stata descritta per la prima volta più di due secoli fa, gli studi per comprendere la patologia e l'eziologia della malattia sono ancora in corso ed è attualmente accettato che la malattia di Parkinson sia una malattia sistemica complessa17. Si prevede che si verifichi una carenza di dopamina e si osservano sintomi clinici di Parkinson quando oltre l'80% dei neuroni degenera18. Nel trattamento della malattia, l'integrazione incompleta di dopamina è preferita per ridurre i sintomi motori. Studi in vivo hanno dimostrato che l'infusione diretta di dopamina nel cervello riduce significativamente i sintomi negli animali19. I precursori della dopamina come la L-DOPA (L-3,4-diidrossifenilalanina) e i farmaci del recettore della dopamina sono utilizzati in clinica perché l'infusione diretta di dopamina nel cervello non è possibile negli esseri umani e la dopamina che entra nel sistema non può attraversare la BBB20. Questi tipi di farmaci perdono la loro efficacia nel tempo. Tuttavia, non esiste ancora un approccio terapeutico curativo per la malattia di Parkinson. Quindi, c'è un'enorme necessità di sviluppare nuove strategie terapeutiche e modalità di trattamento per rivelare la fisiopatologia della malattia e ridurre l'impatto della malattia sui pazienti.

Gli studi basati sugli esosomi hanno recentemente attirato l'attenzione per la raccolta di informazioni sia sugli approcci terapeutici che sulle patologie delle malattie del sistema nervoso. È stato dimostrato che gli esosomi derivati dalle MSC riducono l'infiammazione nel danno ai nervi e contribuiscono alla rigenerazione neuronale21,22,23. Inoltre, è stato riportato che i secretomi esosomici derivati da MSC riducono l'apoptosi mostrando effetti neurotrofici e neuroprotettivi, in particolare sui neuroni dopaminergici24,25. La ricerca sulle piattaforme in cui gli esosomi sono utilizzati come sistemi terapeutici di somministrazione di farmaci ha subito un'intensa accelerazione negli ultimi anni. In numerosi studi, è stato osservato che i farmaci rilevanti possono essere facilmente incapsulati negli esosomi e somministrati in modo sicuro nelle cellule, nei tessuti e negli organi bersaglio26,27. Diversi metodi come l'incubazione, i cicli di congelamento/scongelamento, la sonicazione e l'estrusione potrebbero essere utilizzati per il caricamento del farmaco negli esosomi28.

La coincubazione con esosomi o vescicole simili agli esosomi consente di incapsulare passivamente piccole molecole lipofile in questi sistemi di rilascio28,29,30. In particolare, varie molecole come la curcumina 31, la catalasi30, la doxorubicina32 e il paclitaxel33 sono state efficacemente caricate negli esosomi. È stato osservato che gli esosomi contenenti catalasi, che hanno attività antiossidante, si accumulavano in modo efficiente nei neuroni e nelle cellule microgliali del cervello e mostravano forti attività neuroprotettive30. Nello stesso studio, è stato riscontrato che la saponina, aggiunta al complesso per aumentare l'efficienza di caricamento, aumenta la percentuale di carico del farmaco durante l'incubazione30,34. Tuttavia, sono necessari ulteriori studi per stabilire gli standard per il caricamento del farmaco negli esosomi.

Questo articolo descrive lo sviluppo di un sistema di nanocarrier mediante incapsulamento della dopamina in esosomi che sono stati isolati da WJ-MSCs. Tutte le fasi, tra cui la coltivazione di WJ-MSC, l'isolamento e la caratterizzazione degli esosomi, gli esperimenti di carico farmacologico, la caratterizzazione degli esosomi carichi di dopamina con varie tecniche e l'analisi della citotossicità in vitro sono spiegate in dettaglio.

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Protocollo

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NOTA: Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali e le attrezzature utilizzati in questo protocollo.

1. Coltura e crioconservazione di cellule staminali mesenchimali gelatinose di Wharton

  1. Rimuovere i WJ-MSC (dall'ATCC) dal congelatore a -80 °C. Seminare le cellule in un matraccio contenente terreno DMEM-F12 integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS). Incubarli a 37 °C in un incubatore contenente il 5% di CO2 .
  2. Cambiare il terreno di coltura ogni 2 giorni. Far passare le cellule quando raggiungono l'80% di confluenza. Lavare le cellule da far passare con 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
    NOTA: Il lavaggio con PBS prima dell'aggiunta di tripsina garantisce una facile separazione delle cellule dalla superficie del pallone.
  3. Rimuovere il PBS e aggiungere 5 mL di soluzione di tripsina-EDTA nel pallone. Incubare il matraccio per 5 minuti a 37 °C in un incubatore contenente il 5% di CO2 .
  4. Raccogliere il surnatante nella provetta e centrifugare a 1.500 x g per 5 minuti. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e aggiungere 1 mL di DMEM-F12 + 10% FBS alla provetta mediante pipettaggio.
  5. Trasferire le cellule in un matraccio più grande e continuare la coltura aggiungendo DMEM-F12 + 10% FBS fino a ottenere un numero sufficiente di esosomi35.
    NOTA: Le cellule coltivate vengono congelate a una densità di 1 milione/mL con il 10% di dimetilsolfossido (DMSO) e conservate a -80 °C.

2. Produzione di esosomi da cellule staminali mesenchimali di Wharton's Jelly

NOTA: Gli esosomi sono isolati da WJ-MSC in coltura. L'isolamento degli esosomi viene eseguito quando le cellule coprono la superficie del pallone e raggiungono circa l'80% di densità.

  1. Rimuovere il terreno surnatante contenente il 10% di FBS dal matraccio e lavare le cellule con 5 mL di PBS. Aggiungere alle cellule un terreno DMEM-F12 privo di siero dopo il risciacquo con PBS. Incubare i palloni per 48 ore a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 . Dopo l'incubazione, raccogliere il terreno privo di siero nella provetta e conservare a -20 °C.
    NOTA: Nella fase 2.1, 180 mL di terreno privo di siero vengono raccolti e conservati a -20 °C. Dopo lo scongelamento, viene avviato un processo di centrifugazione discontinuo, come descritto di seguito.
  2. Isolamento degli esosomi
    1. Centrifugare il terreno privo di siero raccolto a 300 x g per 10 minuti a +4 °C. Prelevare con cautela il surnatante e trasferirlo in un'altra provetta.
    2. Centrifugare il surnatante raccolto a 2.000 × g per 10 minuti a +4 °C. Prelevare con cautela il surnatante e trasferirlo in un'altra provetta.
    3. Centrifugare il surnatante raccolto a 10.000 × g per 30 minuti a +4 °C. Prelevare con cautela il surnatante e trasferirlo in un'altra provetta.
    4. Trasferire il surnatante raccolto in provette per ultracentrifuga e ultracentrifugare a 110.000 × g per 130 min. Rimuovere lentamente il surnatante e aggiungere 1 mL di PBS al pellet.
    5. Vorticare il pellet e l'ultracentrifuga a 110.000 × g per 70 minuti a +4 °C36 (Figura 1). Rimuovere lentamente il surnatante e aggiungere 1 mL di PBS al pellet.
      NOTA: Al termine delle fasi di ultracentrifugazione, gli esosomi ottenuti possono essere conservati a -80 °C. Il pellet ottenuto è ora pronto per la caratterizzazione.

figure-protocol-1
Figura 1: Isolamento degli esosomi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Caratterizzazione degli esosomi

  1. Analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA)
    NOTA: L'analisi di tracciamento delle nanoparticelle viene eseguita per determinare le dimensioni e la concentrazione degli esosomi isolati. Le compresse utilizzate per la soluzione PBS 1x devono essere comprese nell'intervallo di pH 7,3-7,5. 1x soluzione PBS contiene 10 mM di tampone fosfato, 137 mM di cloruro di sodio e 2,7 mM di cloruro di potassio. La soluzione si prepara aggiungendo 1 compressa di PBS in 100 mL di acqua distillata. Questa soluzione preparata viene sterilizzata in autoclave.
    1. Diluire gli esosomi di 100 volte aggiungendo 990 μL di PBS a 10 μL di esosomi. Assumere la sospensione diluita in una siringa monouso.
    2. Accendere il dispositivo NTA e collegare il computer. Aprire il software.
    3. Iniettare il campione nella siringa nel tubo nella sezione della cassetta del dispositivo. Chiudere il coperchio della cassetta del dispositivo.
    4. Nel software che si apre, fare clic sul pulsante Avvia analisi . Salvare i risultati ottenuti premendo il pulsante Registra .
  2. Analisi dinamica della diffusione della luce
    NOTA: Anche gli esosomi isolati per la misurazione del potenziale zeta e delle dimensioni vengono diluiti allo stesso modo dell'analisi NTA.
    1. Aggiungere 980 μL di PBS a 20 μL degli esosomi.
    2. Aprire il dispositivo di dimensionamento zeta e il computer connesso. Aprire il software.
    3. Aggiungere la sospensione del punto 3.2.1 alla cuvetta monouso. Aprire il coperchio del dispositivo, posizionare la cuvetta nella cassetta e chiudere il coperchio.
    4. Selezionare il tipo di cuvetta nel software del dispositivo. Fare clic sul pulsante Avvia analisi per l'analisi dimensionale e del potenziale zeta.
      NOTA: Le analisi vengono eseguite separatamente per l'analisi dimensionale e il potenziale zeta.

4. Carico di dopamina negli esosomi

NOTA: Dopo aver completato la caratterizzazione degli esosomi WJ-MSCs, gli esosomi carichi di dopamina sono stati ottenuti come sistema di somministrazione del farmaco. Il caricamento del farmaco negli esosomi viene eseguito utilizzando il metodo dell'incubazione.

  1. Aggiungere 3 mL di PBS alla sospensione dell'esosoma del passaggio 2.2.5. Sterilizzare la sospensione diluita mediante filtrazione utilizzando filtri da 0,22 μm. Trasferire 500 μL della sospensione dell'esosoma sterilizzata in un'altra provetta.
  2. Preparare una soluzione di dopamina (0,5 mg/ml) con acqua distillata. Aggiungere 500 μL di soluzione di dopamina nelle provette contenenti gli esosomi.
  3. Aggiungere saponina alla sospensione nella fase 4.2. Incubare la sospensione esosoma-dopamina preparata per 24 ore a 37 °C.
    NOTA: La concentrazione di saponina non deve superare lo 0,002% della soluzione totale.
  4. Ultracentrifugare la sospensione a 90.000 × g per 70 minuti per rimuovere la dopamina libera e la saponina dal terreno. Conservare gli esosomi isolati a -20 °C fino all'uso per ulteriori analisi37.
    NOTA: Aggiungere acido ascorbico allo 0,02% per la stabilità della soluzione di dopamina preparata.

5. Caratterizzazione di esosomi carichi di dopamina

  1. Analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA)
    NOTA: L'analisi di tracciamento delle nanoparticelle viene eseguita per determinare le dimensioni e la concentrazione degli esosomi isolati.
    1. Seguire i passaggi da 3.1.1 a 3.1.4 per diluire gli esosomi ed eseguire l'NTA.
  2. Analisi dinamica della diffusione della luce
    NOTA: Anche gli esosomi isolati per la misurazione del potenziale zeta e delle dimensioni vengono diluiti in modo simile all'analisi NTA.
    1. Seguire i passaggi da 3.2.1 a 3.2.4 per diluire gli esosomi ed eseguire l'analisi dinamica della diffusione della luce.
      NOTA: Le dimensioni e i potenziali zeta per ciascuna soluzione (saponina, dopamina, esosoma-dopamina) vengono analizzati separatamente.

6. Cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC)

NOTA: Le quantità di dopamina caricate negli esosomi sono misurate con il metodo della cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC). Per rilevare la presenza di dopamina all'interno della formulazione ottenuta, gli esosomi vengono fatti esplodere con un processo speciale.

  1. Mettere la formulazione in una stufa a 75 °C per far evaporare. Aggiungere acetonitrile (rapporto 50:50) alla sospensione e al vortice. Sonicare la soluzione per 10 min.
  2. Centrifugare la soluzione per 10 minuti a 10.000 × g. Filtrare il surnatante attraverso un filtro da 0,22 μm.
  3. Analizzare tutti gli analiti utilizzando una colonna C18 a 30 °C a una velocità di flusso di 1 mL/min (la fase mobile H2O/acetonitrile). Misurare l'assorbanza a 230 nm38.

7. Misurazione della capacità di carico del farmaco (DL) e cinetica di rilascio del farmaco in vitro

  1. Capacità di carico del farmaco (DL)
    NOTA: La quantità di dopamina caricata negli esosomi viene quantificata utilizzando la spettroscopia UV-Vis. L'assorbanza viene letta a 280 nm. I surnatanti raccolti durante la sintesi vengono utilizzati per misurare la quantità di farmaco scaricato. La concentrazione di dopamina nel surnatante viene determinata tramite una curva di calibrazione standard per la dopamina.
    1. Preparare una soluzione madre di 1 mg/mL di dopamina. Preparare concentrazioni di 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 e 0,5 mg/mL dalla soluzione madre utilizzando acqua distillata.
      NOTA: Aggiungere acido ascorbico allo 0,02% per la stabilità della soluzione di dopamina preparata.
    2. Generare una curva di calibrazione standard misurando l'assorbanza di ciascuna diluizione di dopamina a 280 nm in uno spettrofotometro UV.
    3. Misurare l'assorbanza del surnatante a 280 nm.
    4. Calcolare la capacità di carico del farmaco per la dopamina usando l'Eq (1)39.
      DL (%) = figure-protocol-2 100 (1)
      NOTA: L'analisi viene eseguita in triplice copia.
  2. Cinetica di rilascio del farmaco in vitro
    NOTA: La cinetica di rilascio del farmaco degli esosomi carichi di dopamina viene eseguita utilizzando una membrana di dialisi. Il PBS, pH 7,4, viene utilizzato come mezzo di rilascio per simulare un microambiente fisiologico.
    1. Aggiungere 1 mL di esosomi carichi di dopamina alla membrana di dialisi. Mettere la membrana in un bicchiere. Aggiungere 15 ml di PBS nel becher.
    2. Campionare 1 mL di terreno distaccante in un becher a 0,5, 1, 2, 4, 6 e 8 ore. Ad ogni punto temporale, sostituire il volume del campione con PBS fresco. Analizzare i campioni prelevati a intervalli specificati a 280 nm utilizzando uno spettrometro UV-Vis.
    3. Calcolare i risultati utilizzando l'Eq (2)40.
      Rilascio (%) = figure-protocol-3 100 (2)
      NOTA: Viene preparata una curva di calibrazione per la determinazione della cinetica di rilascio del farmaco in vitro . La soluzione di dopamina viene preparata a concentrazioni di 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 e 5,0 mg/mL. Il valore di assorbanza UV di ciascuna concentrazione viene determinato a 280 nm con uno spettrofotometro UV-Vis.

8. Test di citotossicità in vitro

  1. Rivitalizzazione e coltura dei fibroblasti
    1. Togliere i fibroblasti dal congelatore a -80 °C. Seminare le cellule in un pallone contenente DMEM-F12 + 10% FBS.
    2. Incubare le cellule a 37 °C in un incubatore contenente il 5% di CO2 . Cambiare il terreno di coltura ogni 2 giorni.
    3. Far passare le cellule fino a raggiungere l'80% di confluenza. Seguire i passaggi 1.3-1.5. Dopo la centrifugazione a 1.500 × g per 5 minuti, rimuovere il surnatante, aggiungere 1 mL di DMEM-F12 + 10% FBS e seminare 10.000 cellule per pozzetto in una piastra da 96 pozzetti.
      1. Aggiungere il terreno DMEM-F12 + 10% FBS e incubare le cellule a 37 °C per 18 ore in un incubatore contenente il 5% di CO2 . Cambiare il mezzo dei pozzetti alla fine dell'incubazione.
    4. Preparare la scorta di sospensione di esosomi carica di dopamina. Diluire la formulazione dell'esosoma carica di dopamina con un terreno per ottenere concentrazioni di 100 μL/mL, 250 μL/mL, 500 μL/mL e 1.000 μL/mL.
    5. Aggiungere le concentrazioni preparate sulle cellule all'interno di ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti. Incubare le piastre a 37 °C per 18 ore in un incubatore contenente il 5% di CO241.
  2. Saggio di vitalità cellulare MTT
    NOTA: Al termine dell'incubazione, i rapporti di vitalità delle cellule sono determinati dal test MTT.
    1. Preparare la soluzione di MTT (5 mg/mL) con PBS. Aggiungere 10 μL di soluzione di MTT a ciascun pozzetto. Incubare per 4 ore a 37 °C.
    2. Al termine dell'incubazione, aggiungere 100 μL di DMSO a ciascun pozzetto. Incubare le piastre per 30 minuti a temperatura ambiente al buio. Misurare i valori di assorbanza nel lettore ELISA a 570 nm42,43.
      NOTA: Il test di vitalità MTT viene eseguito in triplice copia.

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Risultati

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Isolamento e caratterizzazione degli esosomi
Le cellule staminali della gelatina Wharton vengono coltivate e incubate in un terreno privo di siero per 48 ore quando la coltura raggiunge una densità sufficiente. Al termine dell'incubazione, il surnatante viene conservato a -20 °C. I surnatanti raccolti vengono diluiti con PBS e sottoposti a ultracentrifugazione (Figura 1). La soluzione ottenuta viene analizzata mediante analisi NTA e DLS. Gli esosomi vengono sterilizzati ...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli esosomi sono piccole vescicole di membrana con dimensioni di 40-200 nm secrete dalla maggior parte dei tipi di cellule, ad esempio le MSC1. In grado di consentire la comunicazione tra le cellule, gli esosomi possono entrare nelle cellule in diversi modi come l'endocitosi, la fagocitosi, la micropinocitosi, l'internalizzazione mediata dai lipidi e la fusione33,44. Rispetto ad altri sistemi di nanocarrier, i lipidi e il colesterolo prese...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il lavoro è stato sostenuto principalmente dai finanziamenti per la ricerca forniti dai progetti di ricerca scientifica dell'Università tecnica di Yıldız (TSA-2021-4713).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,22 µ m filtro a membranaAisimoUtilizzato per il processo di sterilizzazione
0,45 & micro; m filtro per siringheAisimoUtilizzato per il processo di sterilizzazione
15 mL Provetta FalconNidoUtilizzato nella fase di coltura cellulare
25 cm2 palloni per colture cellulari (Falcon, palloni per coltura tissutale TPPNidoUtilizzato nella fase di coltura cellulare
50 mL Provetta FalconNidoUtilizzato nella fase
di coltura cellularePalloni per colture cellulari da 75 cm2 (Falcon, palloni per colture tissutali TPPNidoUtilizzato nella fase di coltura cellulare
Piastre a 96 pozzetti (Falcon, micropiastre TPP)Merck MilliporeUtilizzato nella fase di coltura cellulare
AcetonitrileSigma271004-1LUtilizzato per l'analisi HPLC
AutoclaveNUVE-OT 90LUtilizzato per il processo di sterilizzazione
Cella Cabina di colturaHera Safe KSUtilizzato per il processo di coltura cellulare
CentrifugoHitachiCF16RNUtilizzato nella fase di isolamento degli esosomi
Incubatore CO2 con Safe Cell UVPanasonicUtilizzato per il processo di coltura cellulare
Dopamina cloridrato H8502-10GSigmaH8502-10GUtilizzato nel caricamento
di dopamina degli esosomiMiscela di mezzi/nutrienti Dulbecco's Modified Eagle-F12SigmaRNBJ7249Utilizzato come terreno di coltura cellulare
Siero fetale bovino-FBSCapricornFBS-16AÈ stato utilizzato aggiungendo al terreno di coltura cellulare.
Congelatore -80 ° CPanasonicMDF-U5386S-PEPer conservare le cellule e gli esosomi risultanti
FrigoriferoPanasonicMPR-215-PEUtilizzato per conservare colture cellulari e altri materiali
Cromatografia liquida ad alte prestazioni-HPLCTecnologie Agilent Èstata studiata la presenza di dopamina dal contenuto della formulazione ottenuta.
Microscopio - PrimovertZeissUtilizzato per osservare le cellule in coltura cellulare.
Saggio MTTBiomatikUtilizzato per misurare la vitalità cellulare
NanoSight NS300Malvern panalyticalMalvern panalyticalUtilizzato per la caratterizzazione degli esosomi
Optima XPN-100 UltracentrifugaBeckman CoulterUtilizzato nella fase di isolamento degli esosomi
Compressa PBSBiomatik43602Nella preparazione della soluzione PBS
Penicilina/ Soluzione di streptomicinaCapricornPB-SÈ stato aggiunto al terreno per prevenire la contaminazione in coltura cellulare.
Pipetta AidIsolab
Bilancia di precisione-KernKern-ABJ220-4NMUtilizzato nella preparazione di soluzioni
Sonicatore Q500Qsonica, LLCUtilizzato per digerire gli esosomi nell'analisi HPLC
SaponinaSigma47036-50G-FÈ stato utilizzato aggiungendolo alla soluzione totale nel processo di caricamento della dopamina dell'esosoma.
Spettrostar-Nano-SpettrofotometriaBMG LABTECHUtilizzato per l'MTT e le analisi del rilascio di farmaci Programma
di pacchetto statisticoSPSS 22
Vorteks-FinePCRFinePCR-FineVortexUtilizzato per miscelare soluzioni in modo omogeneo
Bagno d'acqua 37 ° C-SenovaSenovaUtilizzato nella fase di coltura cellulare
Wharton' s gelatina cellule staminali mesenchimaliATCC
ZetaSizerMalvern Nano ZSMalvern Nano ZSUtilizzato per la caratterizzazione degli esosomi

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ingato, D., Lee, J. U., Sim, S. L., Kwon, Y. L. Good things come in small packages: Overcoming challenges to harness extracellular vesicles for therapeutic delivery. Journal of Controlled Release. 241, 174-185 (2016).
  2. Riazifar, M., et al. Stem cell-derived exosomes as nanotherapeutics for autoimmune and neurodegenerative disorders. ACS Nano. 13 (6), 6670-6688 (2019).
  3. Ursavaş, S., Darıci, H., Karaoz, E. Olfactory ensheathing cells: Unique glial cells promising for treatments of spinal cord injury. Journal of Neuroscience Research. 99 (6), 1579-1597 (2021).
  4. Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nature Cell Biology. 10 (12), 1470-1476 (2008).
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