Questo studio fornisce una procedura sistematicamente ottimizzata di costruzione basata sulla ribonucleasi CRISPR / Cas9 di mutanti di locuste omozigoti, nonché un metodo dettagliato per la crioconservazione e la rianimazione delle uova di locuste.
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Articolo metodologico
Costruzione di mutanti omozigoti di locuste migratorie utilizzando la tecnologia CRISPR/Cas9
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La locusta migratrice, Locusta migratoria, non è solo una delle locuste della peste in tutto il mondo che ha causato enormi perdite economiche agli esseri umani, ma anche un importante modello di ricerca per la metamorfosi degli insetti. Il sistema CRISPR / Cas9 può localizzare con precisione un locus specifico del DNA e fendere all'interno del sito bersaglio, introducendo in modo efficiente rotture a doppio filamento per indurre il knockout del gene bersaglio o integrare nuovi frammenti di geni nel locus specifico. L'editing del genoma mediato da CRISPR / Cas9 è un potente strumento per affrontare le domande incontrate nella ricerca sulle locuste e una tecnologia promettente per il controllo delle locuste. Questo studio fornisce un protocollo sistematico per il knockout genico mediato da CRISPR / Cas9 con il complesso della proteina Cas9 e RNA guida singola (sgRNA) nelle locuste migratorie. La selezione dei siti target e la progettazione degli sgRNA sono descritte in dettaglio, seguite dalla sintesi in vitro e dalla verifica degli sgRNA. Le procedure successive includono la raccolta della zattera delle uova e la separazione delle uova conciate per ottenere una microiniezione di successo con basso tasso di mortalità, coltura delle uova, stima preliminare del tasso di mutazione, allevamento delle locuste, nonché rilevamento, conservazione e passaggio dei mutanti per garantire la stabilità della popolazione delle locuste modificate. Questo metodo può essere utilizzato come riferimento per applicazioni di editing genetico basate su CRISPR / Cas9 nelle locuste migratorie e in altri insetti.
Introduzione
Le tecnologie di modifica genetica potrebbero essere utilizzate per introdurre inserzioni o delezioni in uno specifico locus del genoma per modificare artificialmente il gene bersaglio sullo scopo1. Negli ultimi anni, la tecnologia CRISPR / Cas9 si è sviluppata rapidamente e ha un crescente ambito di applicazioni in vari campi delle scienze della vita 2,3,4,5,6. Il sistema CRISPR / Cas9 è stato scoperto nel 19877 e ampiamente trovato in batteri e archei. Ulter....
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Protocollo
1. Selezione del sito target e progettazione degli sgRNA
- Raccogliere quante più informazioni possibili sulla sequenza per il gene di interesse attraverso la ricerca della letteratura e / o la ricerca dell'mRNA o della sequenza di DNA codificante (CDS) del gene presso NCBI e database di locuste24.
- Confrontare la sequenza del gene interessato con la sua sequenza di DNA genomico per distinguere le regioni dell'esone e dell'introne.
- Selezionare una regione candidata per la progettazione del sito di destinazione in base allo scopo della ricerca. Progettare coppie di primer per amplificare il frammento d....
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Risultati
Questo protocollo contiene i passaggi dettagliati per generare mutanti omozigoti delle locuste migratorie con l'RNP costituito dalla proteina Cas9 e sgRNA sintetizzato in vitro . I seguenti sono alcuni risultati rappresentativi del knockout del gene bersaglio mediato da CRISPR / Cas9 nelle locuste, tra cui selezione del bersaglio, sintesi e verifica dell'sgRNA (Figura 1A), raccolta e iniezione di ovociti, screening mutante e passaggio, crioconservazione e rianimazione delle uova omo.......
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Discussione
Le locuste sono state tra i parassiti più devastanti per l'agricoltura dalla civiltà degli esseri umani23. La tecnologia di modifica del genoma basata su CRISPR / Cas9 è un potente strumento per fornire una migliore conoscenza dei meccanismi biologici nelle locuste e una promettente strategia di controllo dei parassiti. Pertanto, è di grande beneficio sviluppare un metodo efficiente e facile da usare per la costruzione mediata da CRISPR / Cas9 di mutanti di locuste omozigoti. Sebbene alcuni grandi.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (32070502, 31601697, 32072419 e dalla China Postdoctoral Science Foundation (2020M672205).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 10&volte; NEBuffer r3.1 | New England Biolabs | B7030S | Il tampone di in vitro Saggi di scissione Cas9 |
| 2xEs Taq MasterMix (Dye) | Cwbio | CW0690 | Per l'amplificazione genica |
| 2xPfu MasterMix (Dye) | Cwbio | CW0686 | Per l'amplificazione genica |
| CHOPCHOP | Sito web online per la progettazione di sgRNA, http://chopchop.cbu.uib.no/. | ||
| Sito web CRISPOR | Online per la progettazione di sgRNA, http://crispor.org. | ||
| Sito web online CRISPRdirect | per la progettazione di sgRNA, http://crispr.dbcls.jp/. | ||
| Alimentatore per elettroforesi | LIUYI BIOLOGY | DYY-6D | Separazione di molecole di acido nucleico di diverse dimensioni |
| Eppendorf Tube | Eppendorf | 30125177 | Per la raccolta di campioni, ecc. |
| Spazzole fini | Annigoni | 1235 | Per la pulizia e l'isolamento delle uova. Acquistato online. |
| Estrattore per micropipette fiammeggiante/marrone | Strumento Sutter | P97 | Per realizzare gli aghi per microiniezione |
| Kit di estrazione del gel | Cwbio | CW2302 | Recupero e purificazione del DNA |
| Sistema di analisi dell'imaging su gel | OLYMPUS | Gel Doc XR | Osservare i risultati dell'elettroforesi |
| GeneTouch Plus | Bioer | B-48DA | Per l'amplificazione genica |
| Vetro elettrodo capillare | Gairdner | GD-102 | Per la fabbricazione aghi per iniezione con a micropipetta Puller |
| Incubatore | MEMMERT | INplus55 | Per la coltura di embrioni di locuste migratorie |
| Bagno metallico | TIANGEN | AJ-800 | Per il riscaldamento del campione |
| Micro autoiniettore | Eppendorf | 5253000068 | Microiniezione di embrioni all'inizio dello sviluppo |
| Microcentrifuga | Allsheng | MTV-1 | Utilizzato per miscelare i reagenti |
| Microgrinder | NARISHIGE | EG-401 | Per mettere a terra la punta dell'ago per iniezione |
| Microloader | Eppendorf 5242956003 | Per caricare le soluzioni negli aghi per iniezione. | |
| Sistema di micromanipolazione | Eppendorf | TransferMan 4r | Un sistema di manipolazione altinativa per microiniezione |
| Microscopio | cnoptec | SZ780 | Per microiniezione |
| Manipolatore a motore | NARISHIGE | MM-94 | Per il controllo della posizione della micropipetta durante la procedura di microiniezione |
| Macinatore di tessuti multicampione | jingxin | Tissuelyser-64 | Macinare e omogeneizzare la |
| pentola per l'ovipisizione | delle uova ChangShengYuanYi | CS-11 | Riempito con sabbia sterile bagnata per la deposizione delle locuste in esso. Le oocisti vengono raccolte da questo contenitore. Acquistato online. |
| Parafilm | ParafilmM | PM996 | Per avvolgere le piastre di Petri. |
| Kit di clonazione pEASY-T3 | TransGen Biotech | CT301-01 | Per la clonazione TA |
| Piastra di Petri | NEST | 752001 | Per la coltura e la conservazione degli ovuli. |
| Pipettor, | Eppendorf | Research plus | Per il caricamento del campione |
| , bicchiere | in plastica Per l'allevamento separato delle locuste e qualsiasi bicchiere di plastica abbastanza grande (non meno di 1000 ml di volume) andrà bene. Acquistato online. | ||
| Kit di sintesi di gRNA di precisione | Thermo | A29377 | Per la sintesi di sgRNA |
| Primer Premier | PREMIER Biosoft | Primer Premier 5.00 | Per la progettazione di primer |
| SnapGene | Scienza perspicace | SnapGene® 4.2.4 | Per l'analisi delle sequenze Sfere d'acciaio |
| HuaXinGangQiu | HXGQ60 | Per la macinazione dei campioni. Acquistato online. | |
| Punte | bioleaf | D781349 | Per il caricamento dei campioni |
| Trans DNA Marker II | TransGen Biotech | BM411-01 | Utilizzato per determinare la dimensione del gene |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo | A36496 | Cas9 protein |
| UniversalGen DNA Kit | Cwbio | CWY004 | Per l'estrazione del DNA genomico |
| VANNAS Forbici | Microscopia elettronica Scienze | 72932-01 | Per tagliare le antenne |
| Grano | Per generare piantine di grano come cibo per le locuste. Acquistato da agricoltori locali. | ||
| Sito web ZiFiT | Online per la progettazione di sgRNA, http://zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx. |
Riferimenti
- Doudna, J. A. The promise and challenge of therapeutic genome editing. Nature. 578 (7794), 229-236 (2020).
- van Haasteren, J., Li, J., Scheideler, O. J., Murthy, N., Schaffer, D. V. The delivery challenge: fulfilling the promise of therapeutic genome editing. Nature Biotechn....
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Ristampe e permessi
