Costruzione di mutanti omozigoti di locuste migratorie utilizzando la tecnologia CRISPR/Cas9

Sommario

Questo studio fornisce una procedura sistematicamente ottimizzata di costruzione basata sulla ribonucleasi CRISPR / Cas9 di mutanti di locuste omozigoti, nonché un metodo dettagliato per la crioconservazione e la rianimazione delle uova di locuste.

Abstract

La locusta migratrice, Locusta migratoria, non è solo una delle locuste della peste in tutto il mondo che ha causato enormi perdite economiche agli esseri umani, ma anche un importante modello di ricerca per la metamorfosi degli insetti. Il sistema CRISPR / Cas9 può localizzare con precisione un locus specifico del DNA e fendere all'interno del sito bersaglio, introducendo in modo efficiente rotture a doppio filamento per indurre il knockout del gene bersaglio o integrare nuovi frammenti di geni nel locus specifico. L'editing del genoma mediato da CRISPR / Cas9 è un potente strumento per affrontare le domande incontrate nella ricerca sulle locuste e una tecnologia promettente per il controllo delle locuste. Questo studio fornisce un protocollo sistematico per il knockout genico mediato da CRISPR / Cas9 con il complesso della proteina Cas9 e RNA guida singola (sgRNA) nelle locuste migratorie. La selezione dei siti target e la progettazione degli sgRNA sono descritte in dettaglio, seguite dalla sintesi in vitro e dalla verifica degli sgRNA. Le procedure successive includono la raccolta della zattera delle uova e la separazione delle uova conciate per ottenere una microiniezione di successo con basso tasso di mortalità, coltura delle uova, stima preliminare del tasso di mutazione, allevamento delle locuste, nonché rilevamento, conservazione e passaggio dei mutanti per garantire la stabilità della popolazione delle locuste modificate. Questo metodo può essere utilizzato come riferimento per applicazioni di editing genetico basate su CRISPR / Cas9 nelle locuste migratorie e in altri insetti.

Introduzione

Le tecnologie di modifica genetica potrebbero essere utilizzate per introdurre inserzioni o delezioni in uno specifico locus del genoma per modificare artificialmente il gene bersaglio sullo scopo¹. Negli ultimi anni, la tecnologia CRISPR / Cas9 si è sviluppata rapidamente e ha un crescente ambito di applicazioni in vari campi delle scienze della vita 2,3,4,5,6. Il sistema CRISPR / Cas9 è stato scoperto nel 1987⁷ e ampiamente trovato in batteri e archei. Ulteriori ricerche hanno indicato che si trattava di un sistema immunitario adattativo procariotico che dipende dalla nucleasi guidata dall'RNA Cas9 per combattere i fagi⁸. Il sistema CRISPR/Cas9 modificato artificialmente consiste principalmente di due componenti, un singolo RNA guida (sgRNA) e la proteina Cas9. Lo sgRNA è costituito da un RNA CRISPR (crRNA) complementare alla sequenza bersaglio e da un crRNA transattivante ausiliario (tracrRNA), che è relativamente conservato. Quando il sistema CRISPR/Cas9 viene attivato, l'sgRNA forma una ribonucleoproteina (RNP) con la proteina Cas9 e guida Cas9 al suo sito bersaglio attraverso l'accoppiamento di basi delle interazioni RNA-DNA. Quindi, il DNA a doppio filamento può essere scisso dalla proteina Cas9 e, di conseguenza, la rottura del doppio filamento (DSB) emerge vicino al motivo adiacente del protospaziatore (PAM) del sito bersaglio 9,10,11,12. Per mitigare il danno causato dalle DSB, le cellule attiverebbero risposte complete al danno del DNA per rilevare in modo efficiente i danni genomici e avviare la procedura di riparazione. Ci sono due distinti meccanismi di riparazione nella cellula: non-homologous end joining (NHEJ) e homology-directed repair (HDR). NHEJ è la via di riparazione più comune che può riparare rapidamente le rotture del doppio filamento del DNA e prevenire l'apoptosi cellulare. Tuttavia, è soggetto a errori a causa del fatto che lascia piccoli frammenti di inserzioni e delezioni (indel) vicino ai DSB, che di solito si traduce in uno spostamento del frame di lettura aperto e quindi può portare al knock-out genico. Al contrario, la riparazione omologa è un evento piuttosto raro. A condizione che ci sia un modello di riparazione con sequenze omologhe al contesto del DSB, le cellule occasionalmente riparano la rottura genomica secondo il modello vicino. Il risultato dell'HDR è che il DSB viene riparato con precisione. In particolare, se c'è una sequenza aggiuntiva tra le sequenze omologhe nel modello, verrebbero integrate nel genoma tramite HDR, e in questo modo, le inserzioni geniche specifiche potrebbero essere realizzate¹³.

Con l'ottimizzazione e lo sviluppo delle strutture sgRNA e delle varianti proteiche Cas9, il sistema di editing genetico basato su CRISPR / Cas9 è stato applicato con successo anche nella ricerca di insetti, inclusi ma non limitati a Drosophila melanogaster, Aedes aegypti, Bombyx mori, Helicoverpa Armigera, Plutella xylostella e Locusta migratoria 14,15,16,17,18 ^,19. Per quanto a conoscenza degli autori, sebbene RNP costituiti dalla proteina Cas9 e sgRNA trascritti in vitro siano stati utilizzati per l'editing del genoma delle locuste^20,21,22, manca ancora un protocollo sistematico e dettagliato per la costruzione mediata dalla ribonucleasi CRISPR / Cas9 di mutanti omozigoti della locusta migratoria.

La locusta migratrice è un importante parassita agricolo che ha una distribuzione globale e pone minacce sostanziali alla produzione alimentare, essendo particolarmente dannoso per le piante graminose, come grano, mais, riso e miglio²³. L'analisi della funzione genica basata su tecnologie di modifica del genoma può fornire nuovi obiettivi e nuove strategie per il controllo delle locuste migratorie. Questo studio propone un metodo dettagliato per eliminare i geni delle locuste migratorie attraverso il sistema CRISPR / Cas9, compresa la selezione dei siti bersaglio e la progettazione di sgRNA, la sintesi in vitro e la verifica degli sgRNA, la microiniezione e la coltura di uova, la stima del tasso di mutazione allo stadio embrionale, l'individuazione dei mutanti e il passaggio e la conservazione dei mutanti. Questo protocollo potrebbe essere usato come riferimento basale per la manipolazione della stragrande maggioranza dei geni delle locuste e può fornire preziosi riferimenti per l'editing del genoma di altri insetti.

Protocollo

1. Selezione del sito target e progettazione degli sgRNA

1. Raccogliere quante più informazioni possibili sulla sequenza per il gene di interesse attraverso la ricerca della letteratura e / o la ricerca dell'mRNA o della sequenza di DNA codificante (CDS) del gene presso NCBI e database di locuste²⁴.
2. Confrontare la sequenza del gene interessato con la sua sequenza di DNA genomico per distinguere le regioni dell'esone e dell'introne.
3. Selezionare una regione candidata per la progettazione del sito di destinazione in base allo scopo della ricerca. Progettare coppie di primer per amplificare il frammento della regione candidata e verificare la sua sequenza wild-type mediante l'analisi sequenziale del prodotto PCR.
   NOTA: Esistono diverse strategie per la selezione della regione target candidata. Ad esempio, nella maggior parte delle ricerche sulla funzione genica / proteina, utilizzare il frammento di esone vicino al suo codone iniziale come regione candidata per garantire che l'intera funzione proteina / RNA venga persa dopo l'editing del genoma (cioè il knock-out del gene). Mentre per l'analisi delle funzioni di un dominio specifico, selezionare la regione candidata all'inizio (o entrambe le estremità) del dominio.
4. Utilizza risorse online come E-CRISP Design²⁵ per cercare potenziali siti target nella regione di destinazione candidata.
   1. Seleziona "Drosophila melanogaster BDGP6" (o qualsiasi altro insetto) nell'elenco a discesa dei genomi di riferimento e scegli "Input is FASTA sequence" seguito incollando la sequenza della regione target nella casella di testo (in formato FASTA).
   2. Avviare l'applicazione premendo "Start sgRNA search" con "medium" e "single design" per ottenere i possibili siti target. Selezionare 1-3 potenziali bersagli dai risultati in base ai loro punteggi previsti e progettare gli sgRNA corrispondenti di conseguenza.
      NOTA: Ci sono molte altre piattaforme online per la progettazione CRISPR, come CRISPOR, CHOPCHOP, CRISPRdirect, ZiFiT e così via (vedi Tabella dei materiali). Alcuni di essi hanno la funzione di controllo della specificità per le specie i cui dati di sequenza genomica sono nei loro database. Tuttavia, la sequenza genomica delle locuste non è stata trovata su nessun sito web online. È meglio usare più di uno strumento online per il design CRISPR nelle locuste. In modo completo, considerare i risultati di diversi siti Web e selezionare l'sgRNA dai risultati in base al principio della massima specificità, massima efficienza e minor tasso di mancata corrispondenza (Figura 1A, B).

2. Sintesi e verifica dello sgRNA in vitro

1. Sintetizzare l'sgRNA utilizzando kit di sintesi di sgRNA secondo il manuale del produttore (Table of Materials). Questa procedura di solito include tre fasi: amplificazione del modello di DNA, trascrizione in vitro e purificazione dell'sgRNA²¹. Diluire lo sgRNA sintetizzato con acqua priva di nucleasi a una concentrazione di stoccaggio di 300 ng/μL per un ulteriore utilizzo.
2. Amplificare e purificare il frammento di gene bersaglio per fungere da substrato del test di scissione in vitro del sistema CRISPR / Cas9. Eseguire questi passaggi seguendo le istruzioni del produttore.
3. Diluire la proteina Cas9 acquistata a 300 ng/μL con acqua priva di nucleasi. Incubare 1 μL di sgRNA (300 ng/μL) e 1 μL di proteina Cas9 (300 ng/μL) con 200 ng di frammento bersaglio purificato nel tampone di scissione a 37 °C per 1 ora (10 μL del volume totale; vedere Tabella 1). Stimare l'efficienza della scissione Cas9 indotta da sgRNA mediante elettroforesi su gel di agarosio (Figura 1C). Selezionare gli sgRNA ad alta attività per la successiva microiniezione.
   NOTA: I risultati dell'elettroforesi su gel di agarosio possono essere convertiti in immagini in scala di grigi con software di elaborazione delle immagini e l'efficienza di scissione è stimata in base alla scala di grigi delle bande di dimensioni ipotizzate.

3. Microiniezione e coltura delle uova

1. Preparare gli aghi per iniezione tirando capillari di vetro con un estrattore di micropipette (Tabella dei materiali). Impostate i parametri come segue: Calore su 588, Tira su 90, Velocità su 60 e Tempo su 40. Macinare la punta dell'ago per iniezione con una micro smerigliatrice (Tabella dei materiali).
   NOTA: Le punte ideali degli aghi sono aperte e affilate (Figura 2A). Si raccomanda vivamente di preparare aghi aggiuntivi per gli esperimenti perché a volte gli aghi sono bloccati o accidentalmente rotti durante le iniezioni.
2. Mescolare 1 μL di proteina Cas9 (300 ng/μL) con 1 μL di sgRNA verificato (300 ng/μL) insieme per ottenere gli RNP per iniezione. Aggiungere 8 μL di acqua sterile priva di RNasi per portare il volume finale della miscela a 10 μL. Mescolare accuratamente la soluzione e tenerla in ghiaccio.
   NOTA: Le concentrazioni finali della proteina Cas9 e degli sgRNA possono essere ottimizzate in base ai risultati dell'editing. Evitare il congelamento e lo scongelamento ripetuti della soluzione di RNP preparata e si raccomanda l'uso immediato.
3. Allevare insieme le locuste adulte maschio e femmina a 30 °C con un fotoperiodo di 16 (chiaro):8 (scuro) e fornire loro sufficienti piantine di grano fresco come cibo. Osserva queste locuste ogni giorno e metti un vaso di ovodeposizione (un vaso di plastica o una tazza piena di sabbia sterile bagnata) nella gabbia di allevamento per la deposizione delle uova una volta che le locuste si sono accoppiate.
   NOTA: Di solito, 100 coppie di locuste adulte allevate in una gabbia di allevamento (40 cm x 40 cm x 40 cm) sono sufficienti per generare uova per eliminare un singolo gene. Colture ulteriori coppie di locuste se sono necessarie più uova.
4. Raccogliere i baccelli appena deposti dalla pentola di deposizione delle uova e attendere circa 30 minuti per la concia delle uova. Isolare delicatamente le uova dai baccelli in acqua usando un pennello fine e lavarle con acqua sterile tre volte. Conservare le uova in una capsula di Petri e aggiungere acqua sterile per mantenerle umide.
   NOTA: La concia delle uova appena deposte può migliorare significativamente l'efficienza mutante²¹.
5. Riempire un ago per iniezione con la soluzione di RNP preparata e caricarlo sul micromanipolatore (Tabella dei materiali).
   1. Impostare i parametri di microiniezione come segue: 300 hPa della pressione di iniezione (pi), 0,5 s del tempo di iniezione (ti) e 25 hPa della pressione di compensazione (pc).
   2. Premere il pedale per valutare il volume della soluzione iniettata. Regolare la pressione di iniezione e il tempo di iniezione per assicurarsi che il volume di iniezione sia di circa 50-100 nL.
      NOTA: Scaricare l'aria residua nell'ago per rendere la soluzione di iniezione continua e controllabile il più possibile. La connessione dell'ago e del micromanipolatore deve essere stretta.
6. Disporre regolarmente le uova sterili sul tampone di iniezione (Figura 2B,C) e posizionare il tampone sul tavolo degli oggetti del microscopio (Figura 3A). Regolare l'ingrandimento del microscopio fino a quando non si osservano le uova. Regolare l'ago per microiniezione al microscopio fino a quando non è visibile la punta dell'iniezione e posizionarlo vicino all'uovo da iniettare.
7. Iniziare l'iniezione ad un'altezza adeguata e con un angolo di 30-45 gradi. Inserire la punta nell'uovo con attenzione vicino ai micropili dell'uovo (Figura 3B) e premere il pedale per effettuare l'iniezione. Ritrarre rapidamente l'ago e spostare il tampone di iniezione per l'iniezione dell'uovo successivo.
   NOTA: Deve essere osservata una leggera espansione dell'uovo durante la microiniezione. Una piccola quantità di perdita citoplasmatica al foro stenopeico è accettabile. Sostituire l'ago per iniezione con uno nuovo o regolare l'angolo di iniezione se il deflusso del fluido è eccessivo.
8. Trasferire le uova iniettate in un piatto di coltura (una capsula di Petri con un pezzo di carta da filtro umida) e metterle in un'incubatrice a 30 °C.
   NOTA: Ci vorranno circa 13-14 giorni prima che le ninfe si schiudano da queste uova iniettate (a condizione che la mutazione del gene bersaglio non influenzi lo sviluppo degli embrioni) (Figura 3C). Iniettare almeno 100 uova per garantire una quantità sufficiente di schiusa ed eclosione per eliminare un gene specifico.

4. Stima del tasso di mutazione e screening dei mutanti

1. Controllare lo sviluppo delle uova iniettate ogni giorno dopo l'iniezione. Trasferire le uova iniettate in un nuovo piatto di coltura ogni 24 ore nei primi 5 giorni.
2. Il 6^° giorno (o più tardi) dopo l'iniezione, prelevare e trasferire a caso 10 uova in un tubo e macinare adeguatamente le uova con due sfere di acciaio a 60 Hz per 6 minuti usando un macinino (vedi Tabella dei materiali). Risospendere i detriti con 1 mL di PBS. Trasferire 5 μL della miscela in 45 μL di 50 mM NaOH e lisare a 95 °C per 5 minuti. Aggiungere 5 μL di 1 M Tris-HCl (pH=8,0) nel sistema di lisi per terminare la reazione di lisi alcalina.
   NOTA: Le uova possono essere selezionate per la lisi alcalina in qualsiasi giorno dopo l'ultimo trasferimento e più uova possono essere utilizzate come un campione a seconda della loro situazione di sviluppo (ad esempio, cinque embrioni di 6 giorni possono essere utilizzati come un campione e due embrioni di 10 giorni possono essere utilizzati come un campione). A volte, non è possibile ottenere il DNA genomico delle uova usando il metodo di lisi alcalina. I kit di estrazione del DNA genomico commerciale possono essere utilizzati come metodo alternativo per isolare il DNA genomico dalle uova.
3. Prendere 1 μL del prodotto di lisi come modello PCR per amplificare il frammento del gene bersaglio (Tabella 2 e Tabella 3) e inviare i prodotti PCR per il sequenziamento. Confrontare i risultati del sequenziamento con la sequenza wild-type per valutare preliminarmente se il sistema CRISPR / Cas9 ha scisso il gene bersaglio in vivo (Figura 4A). Consentire il resto delle uova per lo sviluppo successivo a condizione che gli indels vengano rilevati nella fase embrionale.
   NOTA: In questo modo, il tasso di mutazione può essere preventivamente stimato allo stadio embrionale. Se non si trovano indels in questa fase, preparare alcuni nuovi sgRNA per il gene bersaglio e ripetere il protocollo knock-out dal punto 2.1.
4. Trasferire le ninfe tratteggiate in una gabbia di allevamento e coltivarle come descritto al punto 3.3. Quando le ninfe si sono sviluppate fino al quinto stadio instar, separarle con bicchieri di coltura di plastica (1 ninfa / tazza).
   NOTA: Di solito ci vogliono circa 25-35 giorni perché le ninfe si sviluppino fino al loro quinto stadio e il fenotipo più evidente è che le gemme alari si estendono fino al quarto o quinto segmento addominale. Inoltre, si raccomanda di registrare i fenotipi delle ninfe morte per prevedere la relazione tra il gene bersaglio e i fenotipi in ulteriori ricerche.
5. Tagliare circa 2 mm di lunghezza delle antenne con le forbici da dissezione e lisarlo con il metodo della lisi alcalina (fase 4.2). Analizzare la sequenza di frammenti di gene bersaglio di queste ninfe come descritto sopra (passo 4.3) per identificare i mutanti G₀ (Figura 4B).
   NOTA: Le antenne tagliate per la lisi possono essere un po 'più lunghe e macinare o tritare le antenne è utile per la lisi anche se le antenne possono essere direttamente digerite. Gli individui con picchi multipli vicino al sito bersaglio nel risultato del sequenziamento vengono identificati come mutanti positivi e consentiti per il successivo sviluppo e accoppiamento.

5. Istituzione e passaggio delle linee mutanti

1. Eseguire incroci utilizzando i mutanti G₀ e le locuste wild-type (Figura 4B). Raccogliere le oocisti e incubarle separatamente a 30 °C. Utilizzare 3-6 uova sviluppate in ciascuna oocisti per rilevare le mutazioni descritte nei punti 4.2 e 4.3. Mantenere le oocisti positive alla mutazione per lo sviluppo successivo e abbandonare le oocisti negative alla mutazione.
   NOTA: La stima del tasso di mutazione allo stadio embrionale può accelerare notevolmente lo screening dei mutanti G₁ . Di solito, 3-6 uova sviluppate possono essere mescolate come un campione per la genotipizzazione mediata dalla PCR come descritto sopra.
2. Sollevare le ninfe G₁ come descritto al punto 4.4. Tagliare circa 2 mm di lunghezza delle antenne per eseguire la genotipizzazione basata sulla PCR come descritto nella fase 4.5 per rilevare gli eterozigoti G₁ . Eseguire la clonazione di TA secondo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali) per identificare le loro mutazioni. Eseguire in-cross utilizzando eterozigoti G₁ con le stesse mutazioni per ottenere ninfe G₂ .
   NOTA: Il sequenziamento con metodo Sanger dei prodotti PCR può fornire solo informazioni per scoprire gli eterozigoti, ma non informazioni sufficienti per identificare le mutazioni esatte. Pertanto, la clonazione di TA utilizzando i prodotti PCR è necessaria per identificare chiaramente le mutazioni e può promuovere la creazione di linee mutanti stabili.
3. Alleva le ninfe G₂ fino al loro quinto instar. Utilizzare la genotipizzazione basata sulla PCR descritta nella fase 5.2 per identificare gli omozigoti e/o gli eterozigoti che sono adatti per ulteriori ricerche e passaggi stabili (Figura 4B).
   NOTA: Prestare attenzione ad evitare la mescolanza di omozigoti ed eterozigoti. Si raccomanda di eseguire la genotipizzazione basata sulla PCR in ogni generazione per confermare l'omozigosi e/o l'eterozigosi di ciascuna popolazione. Il numero di locuste utilizzate per questo controllo dipende dalla dimensione della popolazione. Inoltre, la popolazione di locuste può essere ampliata dalla strategia in-cross.

6. Crioconservazione e rianimazione degli ovociti

1. Lavare le uova da crioconservare con acqua sterile e incubarle in un piatto di coltura come descritto sopra (fase 3.8) per 5-6 giorni. Raccogli queste uova insieme nel piatto di coltura e coprile con frammenti di carta da filtro. Avvolgere l'intero piatto di cultura con una pellicola di paraffina.
2. Conservare il piatto a 25 °C per 2 giorni seguiti da altri 2 giorni ad una temperatura relativamente più bassa (13-16 °C). Quindi, trasferire il piatto in un frigorifero a 6 °C. Aggiungere acqua ogni 2 settimane per fornire un ambiente umido per le uova (Figura 5A).
   NOTA: Si ipotizza che gli embrioni siano allo stadio di katatrepsi dopo essere stati sviluppati per 5-6 giorni a 30 °C²⁶. Il raffreddamento a gradiente è utile per la crioconservazione delle uova (Tabella 5).
3. Per rianimare gli ovuli crioconservati, estrarre la capsula di Petri dal frigorifero e mantenerla a 25 °C per 2 giorni. Porre queste uova in un'incubatrice a 30 °C fino alla schiusa delle ninfe (Figura 5B).
   NOTA: È necessario mettere gli ovuli crioconservati a 25 °C prima di trasferirli in un'incubatrice a 30 °C. Gli embrioni possono essere crioconservati per almeno cinque mesi, anche se il tasso di schiusa e il tasso di eclosione possono diminuire a causa della crioconservazione (Tabella 5).

Risultati

Questo protocollo contiene i passaggi dettagliati per generare mutanti omozigoti delle locuste migratorie con l'RNP costituito dalla proteina Cas9 e sgRNA sintetizzato in vitro . I seguenti sono alcuni risultati rappresentativi del knockout del gene bersaglio mediato da CRISPR / Cas9 nelle locuste, tra cui selezione del bersaglio, sintesi e verifica dell'sgRNA (Figura 1A), raccolta e iniezione di ovociti, screening mutante e passaggio, crioconservazione e rianimazione delle uova omo...

Discussione

Le locuste sono state tra i parassiti più devastanti per l'agricoltura dalla civiltà degli esseri umani²³. La tecnologia di modifica del genoma basata su CRISPR / Cas9 è un potente strumento per fornire una migliore conoscenza dei meccanismi biologici nelle locuste e una promettente strategia di controllo dei parassiti. Pertanto, è di grande beneficio sviluppare un metodo efficiente e facile da usare per la costruzione mediata da CRISPR / Cas9 di mutanti di locuste omozigoti. Sebbene alcuni grandi...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
10&volte; NEBuffer r3.1	New England Biolabs	B7030S	Il tampone di   in vitro Saggi di scissione Cas9
2xEs Taq MasterMix (Dye)	Cwbio	CW0690	Per l'amplificazione genica
2xPfu MasterMix (Dye)	Cwbio	CW0686	Per l'amplificazione genica
CHOPCHOP			Sito web online per la progettazione di sgRNA, http://chopchop.cbu.uib.no/.
Sito web CRISPOR			Online per la progettazione di sgRNA, http://crispor.org.
Sito web online CRISPRdirect			per la progettazione di sgRNA, http://crispr.dbcls.jp/.
Alimentatore per elettroforesi	LIUYI BIOLOGY	DYY-6D	Separazione di molecole di acido nucleico di diverse dimensioni
Eppendorf Tube	Eppendorf	30125177	Per la raccolta di campioni, ecc.
Spazzole fini	Annigoni	1235	Per la pulizia e l'isolamento delle uova. Acquistato online.
Estrattore per micropipette fiammeggiante/marrone	Strumento Sutter	P97	Per realizzare gli aghi per microiniezione
Kit di estrazione del gel	Cwbio	CW2302	Recupero e purificazione del DNA
Sistema di analisi dell'imaging su gel	OLYMPUS	Gel Doc XR	Osservare i risultati dell'elettroforesi
GeneTouch Plus	Bioer	B-48DA	Per l'amplificazione genica
Vetro elettrodo capillare	Gairdner	GD-102	Per la fabbricazione  aghi per iniezione con  a  micropipetta Puller
Incubatore	MEMMERT	INplus55	Per la coltura di embrioni di locuste migratorie
Bagno metallico	TIANGEN	AJ-800	Per il riscaldamento del campione
Micro autoiniettore	Eppendorf	5253000068	Microiniezione di embrioni all'inizio dello sviluppo
Microcentrifuga	Allsheng	MTV-1	Utilizzato per miscelare i reagenti
Microgrinder	NARISHIGE	EG-401	Per mettere a terra la punta dell'ago per iniezione
Microloader	Eppendorf 5242956003		Per caricare le soluzioni negli aghi per iniezione.
Sistema di micromanipolazione	Eppendorf	TransferMan 4r	Un sistema di manipolazione altinativa per microiniezione
Microscopio	cnoptec	SZ780	Per microiniezione
Manipolatore a motore	NARISHIGE	MM-94	Per il controllo della posizione della micropipetta durante la procedura di microiniezione
Macinatore di tessuti multicampione	jingxin	Tissuelyser-64	Macinare e omogeneizzare la
pentola per l'ovipisizione	delle uova ChangShengYuanYi	CS-11	Riempito con sabbia sterile bagnata per la deposizione delle locuste in esso. Le oocisti vengono raccolte da questo contenitore. Acquistato online.
Parafilm	ParafilmM	PM996	Per avvolgere le piastre di Petri.
Kit di clonazione pEASY-T3	TransGen Biotech	CT301-01	Per la clonazione TA
Piastra di Petri	NEST	752001	Per la coltura e la conservazione degli ovuli.
Pipettor,	Eppendorf	Research plus	Per il caricamento del campione
, bicchiere			in plastica Per l'allevamento separato delle locuste e qualsiasi bicchiere di plastica abbastanza grande (non meno di 1000 ml di volume) andrà bene. Acquistato online.
Kit di sintesi di gRNA di precisione	Thermo	A29377	Per la sintesi di sgRNA
Primer Premier	PREMIER Biosoft	Primer Premier 5.00	Per la progettazione di primer
SnapGene	Scienza perspicace	SnapGene® 4.2.4	Per l'analisi delle sequenze Sfere d'acciaio
	HuaXinGangQiu	HXGQ60	Per la macinazione dei campioni. Acquistato online.
Punte	bioleaf	D781349	Per il caricamento dei campioni
Trans DNA Marker II	TransGen Biotech	BM411-01	Utilizzato per determinare la dimensione del gene
TrueCut Cas9 Protein v2	Thermo	A36496	Cas9 protein
UniversalGen DNA Kit	Cwbio	CWY004	Per l'estrazione del DNA genomico
VANNAS Forbici	Microscopia elettronica Scienze	72932-01	Per tagliare le antenne
Grano			Per generare piantine di grano come cibo per le locuste. Acquistato da agricoltori locali.
Sito web ZiFiT			Online per la progettazione di sgRNA, http://zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx.