Articolo metodologico

Identificazione dell'attività emolitica e fosfolipasi in estratti grezzi di anemoni di mare mediante saggi biologici semplici

DOI:

10.3791/63630

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29 marzo 2022

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1Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México, 2Departamento de Micro y Nanotecnologías, Instituto de Ciencias Aplicadas y Tecnología, Universidad Nacional Autónoma de México

In questo articolo

Sommario

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Qui, descriviamo un protocollo per ottenere l'estratto di veleno grezzo dall'anemone di mare e rilevare la sua attività emolitica e fosfolipasi.

Abstract

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La composizione del veleno di anemone di mare comprende molecole polipeptidiche e non proteiche. I componenti citolitici hanno un elevato potenziale biotecnologico e biomedico per la progettazione di nuovi strumenti molecolari. Il veleno di anemoni di mare si trova nelle cellule ghiandolari dell'ectoderma e delle strutture subcellulari chiamate nematocisti, entrambe distribuite in tutto il corpo dell'anemone marino. Questa caratteristica implica sfide perché le cellule e la nematocisti devono essere lisate per rilasciare i componenti del veleno con altre molecole non tossiche. Pertanto, in primo luogo, il veleno è derivato da un estratto grezzo (miscela di molecole diverse e diverse e detriti tissutali). Il prossimo passo è rilevare polipeptidi con bioattività specifiche. Qui, descriviamo una strategia efficiente per ottenere l'estratto grezzo di anemone di mare e il biotest per identificare la presenza di citolisine. Il primo passo prevede tecniche economiche e semplici (ciclo agitato e congelamento-disgelo) per rilasciare citolisine. Abbiamo ottenuto la più alta attività citolitica e proteina (~ 500 mg di proteine da 20 g di peso secco). Successivamente, la complessità polipeptidica dell'estratto è stata analizzata dal gel SDS-PAGE rilevando proteine con pesi molecolari compresi tra 10 kDa e 250 kDa. Nel test emolitico, abbiamo utilizzato globuli rossi di pecora e determinato HU50 (11,1 ± 0,3 μg / mL). Al contrario, la presenza di fosfolipasi nell'estratto grezzo è stata determinata utilizzando il tuorlo d'uovo come substrato in un mezzo solido con agarosio. Nel complesso, questo studio utilizza un protocollo efficiente ed economico per preparare l'estratto grezzo e applica biotest replicabili per identificare citolisine, molecole con interessi biotecnologici e biomedici.

Introduzione

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Gli animali marini sono una ricca fonte di composti biologicamente attivi. Negli ultimi decenni, la composizione del veleno di anemone di mare ha attirato l'attenzione scientifica poiché comprende una varietà di polipeptidi con attività emolitica, citotossica, enzimatica (fosfolipasi, proteasi, chitinasi) e neurotossica ed effetti inibitori sull'attività proteolitica1. Inoltre, questi polipeptidi sono potenziali fonti per lo sviluppo di strumenti molecolari nell'uso biotecnologico e terapeutico 2,3.

Ci sono poche segnalazioni sul veleno di anemone di mare e s....

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Protocollo

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Gli anemoni di mare sono stati raccolti secondo le linee guida della Commissione nazionale per l'acquacoltura, la pesca e l'alimentazione del governo federale del Messico (numero di permesso PPF / DGOPTA 07332.250810.4060). Il Comitato di Bioetica dell'Istituto di Biotecnologia, Università Nazionale Autonoma del Messico ha approvato tutti gli esperimenti con gli anemoni di mare. Il campione di sangue di pecora è stato acquistato presso il Centro per l'insegnamento pratico e la ricerca nella produzione e la salute animale (CEPIPSA, Università Nazionale Autonoma del Messico).

1. Raccolta di organismi

  1. Raccogli l'anem....

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Risultati

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I risultati rappresentativi del protocollo utilizzato per ottenere l'estratto grezzo di anemone di mare hanno mostrato che la combinazione di due tecniche (agitazione e cicli di congelamento e scongelamento) produceva uno scarico efficiente di nematocisti e la quantità totale di proteine era di 500 mg (8 mg / mL) (Figura 3).

La complessità proteica dell'estratto grezzo potrebbe essere osservata da 10 kDa e superiore a 250 kDa attraverso l'elettroforesi SDS-PAGE. I.......

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Discussione

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L'elevata domanda di nuovi composti con applicazioni in diversi campi della scienza e dell'industria ha portato allo studio del veleno. Il veleno rappresenta una ricca fonte di molecole che funge da modello per la generazione di nuovi strumenti molecolari. Tuttavia, la complessità di questi veleni richiede l'implementazione e la combinazione di vari metodi per ottenerli e studiarli.

Qui, mostriamo un metodo per ottenere e analizzare il veleno dell'anemone di mare Anthopleura dowii, Ve.......

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere alcun interesse concorrente in relazione alla pubblicazione di questo articolo.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto da Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), con un numero di sovvenzione IT200819. Gli autori riconoscono a Tom Musselman, Rock Paper Editing, LLC, di aver controllato la grammatica inglese di questo manoscritto; e l'assistenza tecnica di Samanta Jiménez (CICESE, Ensenada) e Juan Manuel Barbosa Castillo (Instituto de Fisiología Celular, UNAM). Ringraziamo anche il Dr. Augusto César Lizarazo Chaparro (CEPIPSA) per aver ottenuto sangue di pecora. Ringraziamo in particolare il Dr. José Saniger Blesa, ICAT-UNAM, per le strutture nel suo laboratorio per la registrazione video.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provetta da centrifuga conica da 15 mLCorning430766
2-Bromofenolo bluSigmaB75808
2-mercaptoetanoloSigma-AldrichM6250-100ML
Provette da centrifuga coniche da 50 mLCorning430828
Acido acetico glacialeJ.T. Baker9515-03
AcrilammidePromegaV3115
AgarosioPromegaV3125
BisacrilammidePromegaV3143
Frazione di albumina sierica bovina VSigmaA3059-100G
Saggi proteicidi Bradford Bio-Rad5000006
Cloruro di calcioSigma-AldrichC3306
Piastre per colture cellulari 96 pozzetti, V-bottomCorning3894
CentrifugaEppendorf5804R
Provette da centrifugaCorningCLS430829
ChemiDoc MP systemBio-Rad1708280
Acido citricoSigma-Aldrich251275
Clear flat.bottom 96-Well PlatesThermo Scientific3855
Coomassie blu brillante G-250Bio-Rad#1610406
Coomassie blu brillante R-250Bio-Rad1610400
DestrosioJ.T. Baker1916-01
Recinzione senza condottoLabconcohttps://imagej.nih.gov/ij verticaleImageJ 1.53c
Gel Doc EZBio Rad.Sistema di documentazione su gel
GliceroloSigma-AldrichG5516-4L
EmocitometroMarienfeld650030
ImageJ (Software)NIH, USAVersione 1.53c
Incubatore 211LabnetI5211 DS
MetanoloJ.T. Baker9049-03
Tetra cellaMini-PROTEANBio-Rad1658000EDU
Na2HPO4J.T. Baker3824-01
NaClJ.T. Baker3624-01
NaH2PO4. H2OJ.T. Baker3818-05
Origin softwareversione 9Per progettare la trama con regolazioni sigmoidali
PetridishFalcon351007
Pipetman kitGilsonF167380
Mini gel prefabbricatoBioRad1658004
Prestained Protein LadderThermo Scientific26620
Cocktail di inibitori della proteasiRoche11836153001
Protein Assay Dye Reagent ConcentrateBio-Rad5000006
Rodamina 6GSigma-Aldrich252433
SDSSigma-AldrichL4509
Citrato di sodio diidratoJT Baker3646-01
SpettrofotometroTHERMO SCIENTIFICG10S UV-VIS
Tris BaseSigma-Aldrich77-86-1
Volt AlimentatoreHoeferPS300B

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Frazão, B., Vasconcelos, V., Antunes, A. Sea anemone (Cnidaria, Anthozoa, Actiniaria) toxins: an overview. Marine Drugs. 10 (8), 1812-1851 (2012).
  2. Jayathilake, J. M. N. J., Gunathilake, K. V. K. Cnidarian toxins: recent evidences for potential therapeutic u....

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