Il presente protocollo descrive un test per valutare la capacità di ossidazione degli acidi grassi in colture di cellule ossee primarie o di linee cellulari rilevanti.
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Articolo metodologico
Il presente protocollo descrive un test per valutare la capacità di ossidazione degli acidi grassi in colture di cellule ossee primarie o di linee cellulari rilevanti.
Si prevede che la formazione ossea da parte degli osteoblasti differenzianti richieda un significativo input energetico poiché queste cellule specializzate devono sintetizzare grandi proteine della matrice extracellulare che compongono il tessuto osseo e quindi concentrare gli ioni necessari per la sua mineralizzazione. I dati sulle esigenze metaboliche della formazione ossea stanno emergendo rapidamente. Anche se c'è ancora molto da imparare, si prevede che gli squilibri nel metabolismo intermedio contribuiscano alla malattia scheletrica. Qui, viene delineato un protocollo per valutare la capacità delle cellule osteoblastiche di ossidare 14acidi grassi marcati con C a 14CO2 e metaboliti solubili in acido. Gli acidi grassi rappresentano una riserva ricca di energia che può essere prelevata dalla circolazione dopo l'alimentazione o dopo la loro liberazione dalle riserve di tessuto adiposo. Il test, eseguito in fiasche di coltura tissutale T-25, è utile per lo studio dell'aumento o della perdita di funzione genica sull'utilizzo degli acidi grassi e dell'effetto dei segnali anabolizzanti sotto forma di fattori di crescita o morfogeni necessari per il mantenimento della massa ossea. Vengono inoltre forniti dettagli sulla capacità di adattare il protocollo per valutare l'ossidazione del glucosio o di aminoacidi come la glutammina.
L'osteoblasto, derivato dalle cellule progenitrici presenti nel midollo osseo e nel periostio, è responsabile della sintesi e della secrezione della matrice mineralizzata ricca di collagene che compone il tessuto osseo. Per realizzare questo sforzo energicamente costoso e contribuire al mantenimento per tutta la vita dell'integrità scheletrica, queste cellule specializzate mantengono un abbondante reticolo endoplasmatico ruvido essenziale per sintetizzare le proteine della matrice extracellulare 1,2 e numerosi mitocondri ad alto potenziale di membrana per raccogliere l'energia....
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Questo protocollo utilizza la conversione dell'acido [1-14C]-oleico in 14CO2 come indicatore della capacità di ossidazione degli acidi grassi. L'ufficio locale per la sicurezza dalle radiazioni ha approvato il protocollo per l'utilizzo di materiali radioattivi prima di iniziare gli esperimenti. Tutte le procedure di radiazione sono state eseguite dietro uno schermo di plexiglass utilizzando adeguati dispositivi di protezione individuale. Il Comitato locale per la cura e l'uso degli animali ha approvato il protocollo prima di utilizzare le cellule primarie.
1. Ossidazio....
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L'attività enzimatica sia della carnitina palmitoiltransferasi-1 (Cpt1) che della carnitina palmitoiltransferasi-2 (Cpt2) è necessaria per l'ossidazione mitocondriale degli acidi grassi a catena lunga. Cpt1 è l'enzima limitante la velocità nella via metabolica, ma tre isoforme (Cpt-1a, Cpt-1b e Cpt-1c) sono codificate nei genomi dei mammiferi e la distruzione genetica di un'isoforma può portare alla sovraregolazione della compensazione di un'altra isoforma13. Al contrario, Cpt2 è codificato da un .......
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La procedura sopra descritta consente la valutazione diretta dell'ossidazione degli acidi grassi, poiché i risultati misurati sono 14CO2 raccolti sulla carta da filtro imbevuta di NaOH e metaboliti solubili in acido raccolti dopo l'acidificazione della coltura con acido perclorico. I kit di saggi disponibili in commercio che utilizzano molecole lipidiche marcate in fluorescenza o analoghi lipidici possono misurare l'assorbimento dei lipidi, ma non determinano il cat.......
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Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.
Questo lavoro è stato supportato da un Merit Review Award dal Biomedical Laboratory Research and Development Service del Veterans Affairs Office of Research and Development (BX003724) e da una sovvenzione del National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (DK099134).
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| [1-14C]-Acido oleico | Perkin Elmer | NEC317050UC | |
| 15 x 30 mm tappi a manicotto in gomma | VWR | 89097-542 | |
| Siringa da 1 mL | di precisione BD | da | |
| 25 G (25 G x 1 1/2 in) | 305127 | di precisione BD | |
| Acido ascorbico | Sigma Aldrich | A4403 | |
| BCA Kit per il dosaggio delle proteine | Thermo Fisher | 23225 | Sono adatti anche altri kit |
| Contatore a scintillazione Beckman, o equivalente | Beckman Coulter | LS6000SC | |
| Beta-glicerolo fosfato | Sigma Aldrich | G6626 | |
| Albumina sierica bovina | Sigma Aldrich | 126609 | |
| Carnitina | Sigma Aldrich | C0283 | |
| Tampone di lisi cellulare | Il protocollo è compatibile con i tipici tamponi di lisi (ad es. RIPA) | ||
| s Soluzione salina tamponata con fosfato | Corning | 20-030-CV | |
| fetale bovino | Disponibile da più fonti | ||
| Provette per microcentrifuga, 1,5 mL | Disponibile da più fonti | ||
| Terreno essensibile minimo, modifica alfa | Corning | 10-022-CV | |
| Penicillina-streptomicina | Gibco | 15140122 | |
| Acido perclorico | Sigma Aldrich | 50439 | |
| Pozzetti centrali in polipropilene | VWR | 72760-048 | |
| Idrossido di sodio | Sigma | Aldrich S5881 | |
| T-25 pallone inclinato per coltura tissutale | del collo Corning | 430639 | |
| Incubatore | |||
| Tripsina (0,25%)-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| Ultima Gold (soluzione di scintillazione) | PerkinElmer | 6013329 | |
| Whatman Carta per cromatografia | Sigma Aldrich | WHA3030917 |
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