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Articolo metodologico
* These authors contributed equally
Questo protocollo presenta un approccio metodologico graduale all'esposizione di linee cellulari metastatiche ossee e tumori ossei primari alla terapia fotodinamica mediata dall'acido 5-aminolevulinico (PDT). Vengono analizzati anche gli effetti sul potenziale/invasività della migrazione cellulare, sulla vitalità, sull'apoptosi e sul potenziale di senescenza in seguito all'esposizione alla PDT.
Le metastasi ossee sono associate a una prognosi infausta e a una bassa qualità di vita per i pazienti affetti. La terapia fotodinamica (PDT) emerge come una terapia non invasiva in grado di colpire le lesioni ossee metastatiche locali. Questo articolo presenta un metodo in vitro per studiare l'effetto della PDT in linee cellulari aderenti. A tal fine, dimostriamo un approccio passo-passo per sottoporre sia linee cellulari di cancro metastatico primario (tumore osseo a cellule giganti) che umane (derivate da un carcinoma mammario duttale invasivo primario e da un carcinoma renale) a PDT mediata da acido 5-aminolevulinico (5-ALA).
Dopo 24 ore dopo l'irradiazione 5-ALA-PDT (lunghezza d'onda della luce blu 436 nm), l'effetto terapeutico è stato valutato in termini di potenziale di migrazione cellulare, vitalità, caratteristiche apoptotiche e arresto della crescita cellulare (senescenza). Dopo l'irradiazione con 5-ALA-PDT, le linee cellulari di derivazione muscoloscheletrica rispondono in modo diverso alle stesse dosi ed esposizione di PDT. A seconda dell'entità del danno cellulare innescato dall'esposizione alla PDT, sono stati osservati due diversi destini cellulari: l'apoptosi e la senescenza. La sensibilità variabile alla terapia con PDT tra diverse linee cellulari di cancro osseo fornisce informazioni utili per selezionare impostazioni PDT più appropriate in ambito clinico. Questo protocollo è progettato per esemplificare l'uso della PDT nel contesto delle linee cellulari neoplastiche muscoloscheletriche. Può essere regolato per studiare l'effetto terapeutico della PDT su varie linee cellulari tumorali e vari fotosensibilizzatori e sorgenti luminose.
Le opzioni terapeutiche per le metastasi ossee sono ancora limitate e impegnative, nonostante i continui sviluppi nel trattamento oncologico. L'attuale metodo standard è la radioterapia, che è associata a complicanze come eritema locale, tossicità per gli organi interni1 e fratture insufficienti2. C'è bisogno di terapie antineoplastiche alternative poiché i pazienti con metastasi ossee spesso soffrono di dolore, ipercalcemia e sintomi neurologici che si traducono in mobilità ridotta e ridotta qualità della vita3. Recenti scoperte dimostrano che la PDT fornisce un'....
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Sono stati impiegati tre diversi tipi di linee cellulari: "MAM" - una linea cellulare originata da metastasi ossee di carcinoma a cellule renali, "MAC" - metastasi ossee di un carcinoma mammario duttale invasivo e "17-1012" - un tumore osseo a cellule giganti. Le cellule staminali mesenchimali (MSC) derivate dal midollo sono state utilizzate come gruppo di controllo. L'approvazione istituzionale ed etica è stata ottenuta prima dell'inizio dello studio (numero di progetto: 008/2014BO2 per le linee cellulari tumorali e numero di progetto: 401/2013 BO2 per le MSC).
1. Coltura cellulare
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Dopo l'esposizione a 5-ALA PDT, il gruppo di controllo MSC non ha mostrato alcun effetto notevole in termini di migrazione dopo l'irradiazione con 5-ALA PDT (Figura 2A, i, v, ix). Al contrario, le cellule MAC (Figura 1B e Figura 2A, iii, vii, xi) e le cellule 17-1012 (Figura 1B e Figura 2A, ii, vi, x) hanno mostrato una dim.......
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Nonostante le attuali opzioni di trattamento, la risposta terapeutica del cancro è variabile, deponendo a favore di nuovi approcci o addirittura terapie combinate per trattare le metastasi ossee preservando la struttura tissutale iniziale. In questo contesto, la PDT è un'alternativa promettente. Da un punto di vista semplicistico, la PDT è composta da due componenti di base: (1) un colorante sensibile alla luce non tossico chiamato fotosensibilizzatore (PS) e (2) una sorgente luminosa es.......
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Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamo i nostri co-autori delle pubblicazioni originali per il loro aiuto e supporto.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Scheda dosata da 300 s per PDT | IlluminOss Medical Inc., East Providence, Rhode Insland, USA | n/a | http://www.illuminoss.com |
| fotosensibilizzatore per acido 5-aminolevulinico (5-ALA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | A7793 | 10 mg |
| piastre a 6 pozzetti | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germania | 657160 | |
| Vetrini per camera a 8 pozzetti | SARSTEDT AG & Co. KG, Monaco di Baviera, Germania | 94.6140.802 | |
| Piastre a 96 pozzetti (F-buttom) | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germania | 655180 | |
| CellTiter 96 Soluzione acquosa One Saggio di proliferazione cellulare (MTS-Assay) | Promega, Fitchburg, Wisconsin, USA | G3580 | |
| Saggio di senescenza cellulare | Biotrend Chemikalien GmbH, Kö ln, Germania | CBA-231 | Saggio quantitativo della ß-galattosidasi associata alla senescenza |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA | 35055 | 0,5% (p/v) |
| Inserti di coltura 2Well | ibidi GmbH, Grä felfing, Germania | 80209 | |
| DMEM (1x) + GlutaMax-I | Life Technologies, Carlsbad, Kalifornien, USA | 31966-021 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA | F7524 | |
| Lettore di micropiastre a fluorescenza | Promega, Madison, Wisconsin, USA | GlowMAx®, GM3510 | |
| Emocitometro | Hecht Assistent, Sondheim, Deutschland | 4042 | |
| ImageJ | National Institutes of Health, Be-thesda, Maryland, USA | ImageJ (versione: 1.53a) | Software per l'elaborazione e l'analisi di immagini scientifiche; https://imagej.net/ |
| Microscopio a contrasto di fase inversa | Leica, Wetzlar, Germania | DM IMBRE 100 | |
| Metanolo AnulaR Normapur | VWR, Fontenay-Sous-Bois, Francia | 20847.307 | |
| Paraformaldeide | Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA | 158127 | Polvere, dispositivo PDT di purezza 95% |
| (light box e accessori) | IlluminOss Medical Inc., East Providence, Rhode Insland, USA | n/a | Luce blu 436 nm, 36 J/cm2 http://www.illuminoss.com |
| Penicillina-Streptomicina | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 15140-122 | 10.000 U/mL Penicillina 10.000 μ g/mL |
| Soluzione salina tamponata con fosfato di streptomicina (PBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 10010-015 | |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 21875034 | |
| spettrofotometri/micropiastre | BioTek Instruments GmbH, Bad Friedrichshall, Germania | EL800 | |
| Colorante blu di tripano 0,4% | Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, Stati Uniti | T8154 | |
| Tripsina-EDTA 10x | Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, Stati Uniti | T4174 |
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