Sono stati utilizzati quattro metodi per rilevare Wolbachia intracellulare, che si sono completati a vicenda e hanno migliorato l'accuratezza del rilevamento dell'infezione da Wolbachia di Aa23 derivato da Aedes albopictus e Aa23-T curato dall'infezione nativa di Wolbachia utilizzando antibiotici.
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Articolo metodologico
Rilevamento del ceppo Wolbachia wAlbB nelle linee cellulari Aedes albopictus
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Come endosimbionte materno, Wolbachia infetta grandi proporzioni di popolazioni di insetti. Gli studi hanno recentemente riportato il successo della regolazione della trasmissione del virus a RNA utilizzando zanzare trasfettate da Wolbachia. Le strategie chiave per controllare i virus includono la manipolazione della riproduzione dell'ospite attraverso l'incompatibilità citoplasmatica e l'inibizione dei trascritti virali attraverso l'innesco immunitario e la competizione per le risorse derivate dall'ospite. Tuttavia, i meccanismi alla base delle risposte delle zanzare trasfettate da Wolbachia all'infezione virale sono poco compresi. Questo documento presenta un protocollo per l'identificazione in vitro dell'infezione da Wolbachia a livello di acido nucleico e proteine nelle cellule Aa23 di Aedes albopictus (Ditteri: Culicidae) per migliorare la comprensione delle interazioni tra Wolbachia e i suoi insetti vettori. Attraverso l'uso combinato di reazione a catena della polimerasi (PCR), PCR quantitativa, western blot e metodi analitici immunologici, è stato descritto un protocollo morfologico standard per il rilevamento di cellule infette da Wolbachia che è più accurato dell'uso di un singolo metodo. Questo approccio può anche essere applicato alla rilevazione dell'infezione da Wolbachia in altri taxa di insetti.
Introduzione
La zanzara tigre asiatica Aedes albopictus (Skuse) (Ditteri: Culicidae), che è un vettore chiave del virus della dengue (DENV) in Asia e in altre parti del mondo1, è un ospite naturale di due tipi di batteri intracellulari, Wolbachia (wAlbA e wAlbB), che sono distribuiti in tutta la linea germinale e nel tessuto somatico 2,3. La linea cellulare Aa23 derivata da embrioni di A. albopictus è costituita da almeno due tipi di cellule morfologiche, entrambe supportano l'infezione4 e possono essere curate dall'infezione nativ....
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Protocollo
1. Materiali e reagenti
- Utilizzare soluzioni e mezzi privi di pirogeni per la coltura cellulare (vedere la Tabella dei materiali).
- Utilizzare acqua ultrapura per preparare tutte le soluzioni.
- Fare attenzione nella selezione del siero bovino fetale (FBS) per la coltura cellulare, seguendo un processo di controllo dei lotti.
NOTA: poiché i lotti FBS sono soggetti a modifiche regolari, è impossibile indicare il catalogo e i numeri di lotto pertinenti in questo protocollo. - Selezionare ceppi cellulari Aa23 derivati da uova di A. albopictus , corrispondenti ad Aa23-T senza Wolbachia
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Risultati
Prima che Wolbachia fosse rilevata , le cellule Aa23 e Aa23-T sono state osservate al microscopio ottico per determinare eventuali differenze morfologiche tra le due linee cellulari. Le cellule Aa23 e Aa23-T hanno almeno due morfologie cellulari ma nessuna evidente differenza morfologica tra i due tipi di cellule (Figura 1). Qui, le cellule Aa23 sono state utilizzate come sistema modello per rilevare l'infezione da Wolbachia utilizzando quattro metodi. L'am.......
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Discussione
Il rilevamento dell'infezione intracellulare da Wolbachia è essenziale per lo studio delle interazioni Wolbachia-ospite e la conferma del successo della trasfezione di cellule con nuovi ceppi. In questo protocollo, sono stati utilizzati quattro metodi per rilevare con successo l'infezione intracellulare da Wolbachia a livello di acido nucleico e proteine. Questi quattro metodi sperimentali hanno corroborato e migliorato l'accuratezza del rilevamento dell'infezione delle cellule da Wolbachia.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Dr. Xin-Ru Wang dell'Università del Minnesota per suggerimenti e indicazioni approfondite. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione della National Natural Science Foundation of China (No.81760374).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Microscopio | Zeiss | SteREO Discovery V8 | |
| Petri Pipetta | Fisher Scietific | FB0875713 | |
| Pipetman | F167380 | P10 | |
| inSituX | |||
| Software di analisi | Granato | ||
| MSE Supplies | Ce:Y3Al5O12, substrati monocristallini YAG | ||
| Portachip | Sviluppato | ||
| Software di controllo | Olio da immersione sviluppato | ||
| Cargille Laboratories | 16482 | Tipo A bassa viscosità 150 cSt | |
| piattaforma inSituX | Sorgente | ||
| internamente | Thorlabs Incorporated | LED1085L | LED con lente in vetro, 1085 nm, 5 mW, anello esterno TO-18 |
| a pompa sviluppati | |||
| internamente | Thorlabs Incorporated | LD785-SE400 | 785 nm, 400 mW, Ø 9 mm, codice pin E, diodo laser |
| Raspberry Pi | Raspberry Pi Anello | ||
| Thorlabs Incorporated | SM1RR | SM1 Anello di ritenzione per Ø 1" tubi per lenti e supporti | |
| in cristallo di quarzo senza semi | University Wafers, Inc. | U01-W2-L-190514 | 25,4 mm di diametro Z-cut 0,05 mm di spessore doppia lucidatura laterale 8 mm su -X |
| Shim | |||
Riferimenti
- Wiwatanaratanabutr, I., Kittayapong, P. I. Effects of crowding and temperature on Wolbachia infection density among life cycle stages of Aedes albopictus. Journal of Invertebrate Patholology. 102 (3), 220-224 (2009).
- Sinkins, S. P., Braig, H. R., O'Neill, S. L.
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Ristampe e permessi
