Articolo metodologico

Valutazione della sensibilità meccanica nel ratto per l'indagine meccanicistica del mal di schiena cronico

DOI:

10.3791/63667

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30 agosto 2022

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1Department of Anatomy, Université du Québec à Trois-Rivières, 2CogNAC Research Group, Université du Québec à Trois-Rivières, 3Division of Physiology, Department of Basic Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, University of Tabriz

In questo articolo

Sommario

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Per sviluppare nuovi interventi terapeutici per la prevenzione e la gestione del mal di schiena, sono necessari modelli animali per esaminare i meccanismi e l'efficacia di queste terapie da una prospettiva traslazionale. Il presente protocollo descrive il test BMS, un metodo standardizzato per valutare la sensibilità meccanica posteriore nel ratto.

Abstract

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La lombalgia è la principale causa di disabilità in tutto il mondo, con drammatiche conseguenze personali, economiche e sociali. Per sviluppare nuove terapie, sono necessari modelli animali per esaminare i meccanismi e l'efficacia delle nuove terapie da una prospettiva traslazionale. Diversi modelli di roditori di mal di schiena sono utilizzati nelle indagini attuali. Sorprendentemente, tuttavia, nessun test comportamentale standardizzato è stato convalidato per valutare la sensibilità meccanica nei modelli di mal di schiena. Questo è fondamentale per confermare che gli animali con presunto mal di schiena presentano ipersensibilità locale agli stimoli nocicettivi e per monitorare la sensibilità durante gli interventi progettati per alleviare il mal di schiena. L'obiettivo di questo studio è quello di stabilire un test semplice e accessibile per valutare la sensibilità meccanica nella parte posteriore dei ratti. Una gabbia di prova è stata fabbricata appositamente per questo metodo; lunghezza x larghezza x altezza: 50 x 20 x 7 cm, con una rete in acciaio inossidabile sulla parte superiore. Questa gabbia di prova consente l'applicazione di stimoli meccanici sulla schiena. Per eseguire il test, la parte posteriore dell'animale viene rasata nella regione di interesse e l'area di test è contrassegnata per ripetere il test in giorni diversi, se necessario. La soglia meccanica viene determinata con filamenti di Von Frey applicati ai muscoli paraspinali, utilizzando il metodo up-down descritto in precedenza. Le risposte positive includono (1) contrazioni muscolari, (2) inarcamento (estensione della schiena), (3) rotazione del collo (4) grattarsi o leccare la schiena e (5) fuggire. Questo test comportamentale (Back Mechanical Sensitivity (BMS) test) è utile per la ricerca meccanicistica con modelli di roditori di mal di schiena per lo sviluppo di interventi terapeutici per la prevenzione e la gestione del mal di schiena.

Introduzione

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La lombalgia (LBP) è la principale causa di disabilità in tutto il mondo, che ha conseguenze personali, economiche e sociali drammatiche 1,2,3,4. Ogni anno, circa il 37% della popolazione è affetta da LBP5. Il LBP di solito si risolve entro poche settimane, ma si ripresenta nel 24% -33% degli individui, diventando cronico nel 5% -10% dei casi2. Per comprendere i meccanismi e gli impatti del LBP e gli effetti di diversi interventi terapeutici, sono stati utilizzati diversi modelli animali di LBP, imitando condizioni cliniche o alcuni componenti del LBP6. Questi modelli murini e di ratto possono essere classificati in una o più delle seguenti categorie: (1) LBP discogenico7,8,, (2) LBP radicolare 8,9,10,11, (3) osteoartrosi articolare12 e (4) LBP13,14 indotto dal muscolo . Poiché il dolore non può essere misurato direttamente nelle specie non umane, sono stati sviluppati numerosi test per quantificare i comportamenti simili al dolore in questi modelli8. Questi test valutano comportamenti evocati da uno stimolo nocivo (forza meccanica 15,16,17, stimolazione termica 18,19,20,21,22,23,24,25) o prodotti spontaneamente26,27,28,29.

I metodi che utilizzano stimoli meccanici includono il test di Von Frey 15,16 e il test di Randall-Selitto17. I metodi che utilizzano gli stimoli termici includono il test di flick di coda18, il test della piastra calda19, il test di Hargreaves20 e il test della sonda termica21. I metodi che utilizzano stimoli freddi includono il test della piastra fredda22, il test di evaporazione dell'acetone 23 e il saggio plantare freddo24. I metodi per i comportamenti spontanei includono la bilancia delle smorfie 26, la scavatura 27, l'analisi del peso e dell'andatura28, nonché un'analisi comportamentale automatizzata29. Nonostante questi numerosi test disponibili, nessuno di essi è progettato specificamente per i modelli di mal di schiena.

L'obiettivo di questo studio è quello di stabilire un test semplice e accessibile per valutare la sensibilità meccanica nella parte posteriore dei ratti. La tecnica si basa in gran parte sul test di Von Frey applicato alla superficie plantare della zampa posteriore15,16. Il principio di base del test di Von Frey è quello di utilizzare una serie di monofilamenti nella regione di interesse, fornendo forze predeterminate costanti. Una risposta è considerata positiva se il ratto mostra un comportamento nocifensivo. La soglia meccanica può quindi essere calcolata in base ai filamenti che hanno evocato le risposte. Nel presente studio, viene fornito un metodo semplice e accessibile adattato dal test di Von Frey per determinare la sensibilità meccanica nella parte posteriore dei ratti.

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Protocollo

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Il protocollo sperimentale è stato approvato dal comitato per la cura degli animali dell'Université du Québec à Trois-Rivières ed è conforme alle linee guida del Canadian Council on Animal Care e alle linee guida del Committee for Research and Ethical Issues dell'International Association for the Study of Pain (IASP). Il presente studio ha utilizzato sei ratti Wistar maschi (peso corporeo: 320-450 g; età: 18-22 settimane). Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali). I dati di questi ratti provengono dal campione più ampio di uno studio precedente30.

1. Preparazione sperimentale

  1. Ospitare gli animali in una stanza a temperatura controllata in strutture standard per animali con accesso a cibo e acqua ad libitum e un ciclo luce-buio di 14 h-10 h. Assicurarsi che tutti gli animali siano in buona salute il giorno degli esperimenti.
  2. Generare il modello animale per il mal di schiena cronico seguendo i passaggi seguenti.
    1. Per indurre mal di schiena cronico, eseguire un'iniezione intramuscolare di Complete Freund Adjuvant (CFA) nei muscoli della schiena seguendo i precedenti rapporti 14,30,31.
    2. Anestetizzare l'animale usando l'isoflurano (4% per l'induzione e 2% -2,5% per il mantenimento).
    3. Utilizzando un ago da 27 G, iniettare 150 μL di un'emulsione acqua-in-olio pronta all'uso di CFA (vedi Tabella dei materiali) nei muscoli paraspinali unilateralmente o bilateralmente, a seconda delle esigenze del protocollo.
    4. Tenere l'ago per iniezione in posizione per almeno 3 minuti dopo aver completato l'iniezione. Per gli animali del gruppo di controllo, utilizzare le stesse procedure30, ma iniettare una soluzione di soluzione salina fisiologica sterile (150 μL, 0,9%) invece di CFA.
  3. Fabbricare la gabbia di prova.
    1. Crea una gabbia di prova per due animali che comprende una camera per ciascun animale.
      NOTA: Per il presente studio, ogni camera ha le seguenti dimensioni: lunghezza x larghezza x altezza: 50 x 20 x 7 cm (vedi Tabella dei materiali).
    2. Montare le due camere contigue su quattro gambe in plexiglass lunghe 33 cm. Usa plexiglass trasparente per le pareti delle camere, ma usa plexiglass nero per separare le camere per impedire agli animali di vedersi.
    3. Utilizzare una rete in acciaio inossidabile di filo di 1 mm con una distanza di interfilo di 8 mm per realizzare il pavimento e il soffitto della gabbia di prova (Figura 1).

2. Test di sensibilità meccanica posteriore (BMS)

  1. Familiarizzare l'animale con la gabbia di prova 30 minuti / giorno per 5-7 giorni consecutivi prima del primo test. Ripetere il test secondo necessità.
  2. Anestetizzare gli animali usando il 2% di isoflurano31 (vedi tabella dei materiali).
  3. In posizione prona in anestesia con isoflurano, radere i peli posteriori dell'area di interesse (da T6 a L6 livelli vertebrali) utilizzando un tagliacapelli animale (vedi Tabella dei materiali). Per misure ripetute, radersi i peli posteriori ogni 3 giorni in un giorno senza valutazione comportamentale per garantire che gli stimoli vengano sempre applicati direttamente sulla pelle. Disegna un segno nero sulla pelle con un pennarello permanente per assicurarti che i filamenti vengano sempre applicati alla stessa area quando si ripete il test in giorni diversi.
  4. Il giorno del test, mettere gli animali nella gabbia di prova per 15-30 minuti prima del test fino a quando l'animale non è calmo.
  5. Durante la prova, applicare i filamenti di Von Frey (0,07, 0,16, 0,4, 0,6, 1, 2, 4, 6, 10, 15 e 26 g) perpendicolarmente sul retro, iniziando sempre con il filamento da 2 g e utilizzando il metodo up-down15 (vedi Tabella dei materiali). Avvicinati lentamente alla parte posteriore dell'animale con il filamento da dietro l'animale.
    1. Applicare il filamento solo quando l'animale è sveglio, in piedi sulle sue quattro zampe e non si muove. Applicare il filamento per 2 s bilateralmente all'area di interesse, a 10 mm dal processo spinoso (Figura 2), ogni 15-30 s.
      NOTA: Una risposta è considerata positiva se l'animale mostra uno o più dei seguenti comportamenti durante o immediatamente dopo l'applicazione del filamento: (1) contrazioni muscolari, (2) inarcamento (estensione della schiena), (3) rotazione del collo per guardare la schiena, (4) grattarsi o leccare la schiena e (5) fuggire.
  6. Come descritto in precedenza15, se non si osserva alcuna risposta con l'applicazione di un filamento, applicare il filamento successivo con una forza maggiore nella serie. Se si osserva una risposta, utilizzare il filamento successivo con una forza inferiore nella serie. Continuare questa procedura fino a quando non si ottengono quattro letture dopo il primo cambiamento comportamentale (risposta dopo una serie di "nessuna risposta" o nessuna risposta dopo una serie di "risposta").
  7. Una volta completata la raccolta dei dati, calcolare il valore che rappresenta il 50% della soglia meccanica, come descritto da Chaplan et al.15, utilizzando questa formula:
    Soglia del 50% (g) = 10(Xf+kδ)/10 000
    NOTA: In questa formula, "Xf" è il marchio di maniglia dell'ultimo filamento di von Frey utilizzato. "k" è il valore tabellare basato sul modello di risposta dell'animale15 e "δ" è la media degli incrementi di Handle Mark tra i filamenti di Von Frey. A seconda del disegno sperimentale e delle esigenze sperimentali, solo un lato della colonna vertebrale può essere valutato per segnalare una soglia, o due lati possono essere valutati, e le soglie sono riportate separatamente o come media. Fare riferimento alla tabella supplementare 1 per il modello di calcolo32.

3. Recupero degli animali

  1. Dopo aver completato l'iniezione intramuscolare, interrompere l'anestesia e posizionare l'animale da solo in una gabbia standard per il recupero.
  2. Durante il periodo di recupero, esaminare il comportamento dell'animale e non lasciarlo incustodito.
  3. Confermare che l'animale si riprenda dall'anestesia e si muova normalmente entro 5 minuti. Quindi, riporta l'animale nella sua solita gabbia abitativa con gli altri animali.
    NOTA: Alla fine dell'esperimento, l'animale viene perfuso attraverso il cuore con una soluzione di formalina al 10%, in anestesia profonda con isoflurano (5%). I muscoli della schiena nell'area iniettata vengono quindi estratti per l'istologia e la conferma dei cambiamenti infiammatori.

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Risultati

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Il metodo è stato utilizzato in uno studio precedente, in cui sono stati presentati dati completi e statistiche per confrontare la sensibilità meccanica tra CFA e ratti di controllo30. I dati individuali rappresentativi (media delle soglie sinistra e destra) di sei ratti inclusi nello studio precedente sono presentati nella Figura 3 e nella Tabella 1. Al basale, la sensibilità meccanica era simile tra i gruppi. L'iniezione intramuscolare di CFA nei mu...

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Discussione

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Passaggi critici
Il test BMS è un metodo semplice per valutare la sensibilità meccanica nella parte posteriore dei ratti, in un momento o ripetutamente nel corso di giorni o settimane, quando si prevedono cambiamenti (modelli di dolore) o dopo un intervento farmacologico o non farmacologico. I problemi critici del metodo includono la gabbia di prova, le cui dimensioni devono garantire che il ratto sia comodo ma non si muova troppo. La schiena dell'animale deve rimanere accessibile attraverso il soffit...

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Dichiarazioni

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Gli autori non dichiarano interessi o relazioni concorrenti che possano portare a conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione della Fondation Chiropratique du Québec e del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (MP: grant #06659). Il contributo di HK è stato sostenuto dall'Université du Québec à Trois-Rivières (programma PAIR). Il contributo di BP è stato sostenuto dal Fonds de recherche du Québec en Santé (FRQS) e dalla Fondation Chiropratique du Québec. Il contributo di TP è stato sostenuto dal Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada. Il contributo di NE ed EK è stato sostenuto dalla Fondation Chiropratique du Québec. Il contributo di MP è stato sostenuto dalla FRQS.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Aerrano (isoflurano, USP) - Solo per uso veterinarioBaxterNDC 10019-773-60Anestetico per inalazione ; DIN 02225875, per indurre l'anestesia
Coadiuvante di Freund completo (CFA)Fisher Scientific#77140Emulsione acqua-in-olio di adiuvante di Freund completo (CFA) con cellule uccise di Mycobacterium butyricum.
Peso corporeo maschile Wistar RatsCharles River Laboratories320– 450 g; Età: 18-22 settimane.
Penlon Sigma Delta VaporizzatorePenlon990-VI5K-SVEEKPenlon Sigma Delta Vaporizzatore utilizzato per anestesia
Sharpie Pennarello indelebileSharpieBC23636Pennarello indelebile, Fine Point, nero
Gabbia di provaSu misuraLarghezza: 20 cm;  Lunghezza: 50 cm; Altezza dal basso verso l'alto: 40 cm; Altezza dalla maglia inferiore alla parte superiore della gabbia: 7 cm; Spessore della parete: 5 mm; Maglia: filo da 1 mm con una distanza tra i fili di 8 mm     
Von Frey FilamentsAesthesio, Valutatore sensoriale tattile preciso514000-20CFilamenti da 0,07 g a 26 g
Wahl Professional Animal, Tosatrice per animali domestici senza fili ARCO, Trimmer Grooming WahlKit #8786-1201Rifinitore per peli di animali, per la rasatura, lama zero 
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Riferimenti

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