Quantificare le interazioni di legame tra Cu(II) e residui peptidici in presenza e assenza di cromofori

Sommario

Questo articolo si concentra sull'uso della spettroscopia di assorbimento elettronica e della calorimetria di titolazione isotermica per sondare e quantificare la termodinamica del legame di Cu(II) a peptidi e proteine.

Abstract

Il rame (II) è un metallo essenziale nei sistemi biologici, conferendo proprietà chimiche uniche alle biomolecole con cui interagisce. È stato riportato che si lega direttamente a una varietà di peptidi e svolge ruoli sia necessari che patologici che vanno dalla struttura mediatrice alle proprietà di trasferimento degli elettroni all'impartire la funzione catalitica. Quantificare l'affinità di legame e la termodinamica di questi complessi peptidici Cu(II) in vitro fornisce informazioni sulla forza motrice termodinamica del legame, sulle potenziali competizioni tra diversi ioni metallici per il peptide o tra diversi peptidi per Cu(II) e sulla prevalenza del complesso Cu(II)-peptide in vivo. Tuttavia, quantificare la termodinamica di legame può essere difficile a causa di una miriade di fattori, tra cui la contabilità di tutti gli equilibri concorrenti all'interno di un esperimento di titolazione, specialmente nei casi in cui vi è una mancanza di maniglie spettroscopiche discrete che rappresentano il peptide, lo ione metallico d-block e le loro interazioni.

Qui, viene fornita una robusta serie di esperimenti per la quantificazione accurata della termodinamica del peptide Cu(II). Questo articolo si concentra sull'uso della spettroscopia di assorbimento elettronico in presenza e assenza di ligandi cromoforici per fornire la necessaria maniglia spettroscopica su Cu (II) e l'uso della calorimetria isotermica a titolazione senza etichetta. In entrambe le tecniche sperimentali, viene descritto un processo per tenere conto di tutti gli equilibri concorrenti. Mentre il focus di questo articolo è su Cu(II), l'insieme descritto di esperimenti può applicarsi oltre le interazioni Cu(II)-peptide e fornire un quadro per una quantificazione accurata di altri sistemi metallo-peptidi in condizioni fisiologicamente rilevanti.

Introduzione

La biologia si è evoluta per utilizzare la diversa chimica degli ioni metallici necessari alla vita per adattarsi e sopravvivere nell'ambiente circostante. Si stima che il 25%-50% delle proteine utilizzi ioni metallici per la struttura e la funzione¹. Il particolare ruolo e stato redox dello ione metallico è direttamente correlato alla composizione e alla geometria dei ligandi biologici che lo coordinano. Inoltre, gli ioni metallici redox-attivi come Cu(II) devono essere strettamente regolati per timore che interagiscano con agenti ossidanti attraverso la chimica simile a Fenton per formare specie reattive dell'ossigeno (ROS)^2,3,4....

Protocollo

1. Spettroscopia elettronica di assorbimento: titolazione diretta con competizione tampone

1. Preparazione del campione
   1. Preparare una soluzione tamponata di 50 mM 2-[bis(2-idrossietil)ammino]-2-(idrossimetil)propano-1,3-diolo (bisTris) a pH 7,4 utilizzando acqua ultrapura (resistenza >18 MΩ). Rimuovere gli ioni metallici in traccia incubandoli con una resina ad alta affinità per almeno 2 ore con successiva filtrazione.
   2. Sciogliere o diluire una quantità nota del peptide nel tampone privo di metalli.
      NOTA: Quando si monitorano bande d-d con piccoli coefficienti di estinzione²¹, è necessario utilizzare....

Risultati

L'obiettivo era quello di quantificare e corroborare la termodinamica del legame di Cu(II) al peptide C utilizzando le tecniche complementari della spettroscopia elettronica di assorbimento e dell'ITC. A causa della natura robusta della spettroscopia elettronica di assorbimento, è stata eseguita una titolazione diretta di Cu(II) in 300 μM di peptide C (Figura 1). L'aggiunta di 150 μM di Cu(II) ha causato un immediato aumento della banda a 600 nm, attribuito alla banda d-d di Cu(II), e ha con.......

Discussione

Questo articolo fornisce un metodo robusto per quantificare l'affinità e la termodinamica del legame di Cu(II) ai peptidi. I complessi con Cu(II) sono ideali per monitorare la banda di assorbimento d-d nel sito metallico grazie alla sua configurazione di elettroni d⁹ . Sebbene il coefficiente di estinzione sia piccolo, richiedendo quindi concentrazioni maggiori del complesso per produrre un segnale affidabile, le titolazioni di Cu(II) in peptide possono fornire rapidamente informazioni sulla stechiometria di l.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1,10-fenantrolina	Sigma Aldrich	131377-25G
bis-Tris tampone	Fisher	BP301-100
Membrana da 0,45 micron	Nalgene	296-4545	Qualsiasi sistema di filtrazione che rimuova la resina senza introdurre contaminanti è accettabile
Cloruro di rame (II)	Alfa Aesar	12458
EDTA	Sigma Aldrich	EDS-500G
Spettrofotometro elettronico ad assorbimento	Varian	Cary 5000	Un altro spettrofotometro sensibile adatto è accettabile
resina ad alta affinità	Sigma	Aldrich C7901-25G
Calorimetro di titolazione isotermica (ITC)	TA Instruments	Nano ITC Software
	TA Instruments	NanoAnalyze	SEDPHAT (Metodi. 2015, 76: 137– 148) può essere utilizzato anche
il software ITC	TA Instruments	ITCRun
tergicristallo delicato per impieghi leggeri	Kimwipe	34155
siringa di caricamento	Hamilton	Syr 500 uL, 1750 cuvette abbinate TLL-SAL
	Starna Cells, Inc	16.100-Q-10/Z20	Assicurarsi che la finestra per la cuvetta di piccolo volume corrisponda all'altezza del fascio dello spettrofotometro
tampone MOPS	Alfa Aesar	A12914
	Cary	WinUV Scan
Spreadsheet Program	Microsoft	Excel	Qualsiasi programma di foglio di calcolo adatto funzionerà
siringa di titolazione	TA Instruments	5346
acqua ultrapura	Millipore Sigma	Milli-Q	Qualsiasi acqua va bene purché >18 MΩ resistenza

di analisi ITC a basso volume Software per spettrofotometro