Questo protocollo descrive l'induzione della sepsi monobatterica Gram-negativa in un sistema di modelli murini. Il modello è utile per studiare le risposte infiammatorie e letali dell'ospite durante la sepsi.
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Articolo metodologico
Caratterizzazione della peritonite settica indotta da Salmonella Typhimurium nei topi
In questo articolo
Sommario
Abstract
La sepsi è una risposta immunitaria dell'ospite disregolata all'invasione microbica o al danno tissutale, che porta a lesioni d'organo in un sito distante da quello dell'infezione o del danno. Attualmente, i modelli murini ampiamente utilizzati di sepsi includono endotossiemia indotta da lipopolisaccaride (LPS), legatura e puntura cecale (CLP) e sistemi modello di infezione monobatterica. Questo protocollo descrive un metodo per studiare le risposte dell'ospite durante la peritonite settica indotta da Salmonella Typhimurium nei topi. S. Il typhimurium, un agente patogeno intracellulare Gram-negativo, causa la malattia simile al tifo nei topi.
Questo protocollo elabora la preparazione della coltura, l'induzione della peritonite settica nei topi attraverso l'iniezione intraperitoneale e i metodi per studiare le risposte sistemiche dell'ospite. Inoltre, viene presentata la valutazione della carica batterica in diversi organi e l'analisi citometrica a flusso dell'aumento del numero di neutrofili nel lavaggio peritoneale. Salmonella La sepsi indotta da typhimurium nei topi porta ad un aumento delle citochine proinfiammatorie e alla rapida infiltrazione di neutrofili nella cavità peritoneale, portando a una minore sopravvivenza.
Ogni fase di questo protocollo è stata ottimizzata, con conseguente elevata riproducibilità della patogenesi della peritonite settica. Questo modello è utile per studiare le risposte immunologiche durante la sepsi batterica, i ruoli dei diversi geni nella progressione della malattia e gli effetti dei farmaci per attenuare la sepsi.
Introduzione
La sepsi è definita come una risposta infiammatoria e immunitaria sistemica disregolata all'invasione microbica o al danno tissutale, che porta a lesioni d'organo distanti dal sito di infezione o danno. Lo shock settico è un sottogruppo di sepsi caratterizzata da ipotensione persistente durante la rianimazione di volume, con un rischio sostanzialmente aumentato di mortalità1. Il pubblico in generale è diventato più consapevole di questo disturbo durante la pandemia di COVID-19. Nonostante la sua elevata mortalità associata, mancano dati epidemiologici completi sul carico globale della sepsi a causa della complessità della sua diagnosi. Nel 2017....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti con Salmonella Typhimurium sono stati condotti in strutture di livello di sicurezza biologica 2 (BSL-2). È necessario prestare attenzione all'uso di adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI), garantire la sicurezza e seguire i metodi standard di smaltimento a rischio biologico BSL-2. Tutti gli esperimenti sui topi sono stati condotti seguendo le linee guida stabilite dal Comitato etico animale istituzionale, IISc. I topi sono stati allevati e mantenuti presso la Central Animal Facility di IISc (numero di registrazione: 48/1999 / CPCSEA, datato 1/3/1999), approvato dal Ministero dell'Ambiente e delle Foreste, Governo dell'India....
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Risultati
Una caratterizzazione dettagliata della risposta immunitaria dell'ospite utilizzando questo particolare modello è mostrata nelle precedenti pubblicazioni 8,9. In questa sezione sono riportati alcuni risultati rappresentativi del protocollo descritto. Questo modello mira a indurre l'infezione sistemica di S. Typhimurium mediante iniezione intraperitoneale della coltura batterica per indurre la sepsi. Per confermare l'infezione, i lisati del fegato e della.......
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Discussione
Questo articolo descrive un metodo per indurre una forma grave di sepsi batterica mediante iniezione intraperitoneale di Salmonella Typhimurium. Questo modello è vantaggioso rispetto ad altri in quanto la Salmonella Typhimurium è un patogeno intracellulare e, quindi, altamente patogeno, imitando la condizione clinicamente rilevante della sepsi Gram-negativa. L'esito della sepsi da peritonite in questo modello è sistemico, con una mortalità del 100% entro 96 ore dall'infezione. Pertanto, questo modello è.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Ringraziamenti
Ringraziamo la Central Animal Facility, IISc per averci fornito topi per la ricerca. Questo studio è stato finanziato da sovvenzioni a DpN dal Dipartimento di Biotecnologia e Scienza e Ingegneria Research Board, Governo dell'India. Il sostegno infrastrutturale del programma DBT-IISc e le sovvenzioni DST-FIST sono ampiamente riconosciuti. Ringraziamo tutti i membri precedenti e attuali del laboratorio DpN per il loro supporto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Materiali di consumo | |||
| mL Siringa sterile con ago da 26 G | Beckton Dickinson, Singapore | 303060 | |
| 1,5 mL Provetta per microcentrifuga | Tarsons, USA | 500010 | |
| Siringa sterile da 10 mL con ago da 21 G | Beckton Dickinson, Spagna | 307758 | |
| 50 mL Conical Flask | Tarsons, USA | 441150 | |
| Provetta per centrifuga graduata da 50 mL | Tarsons, USA | 546041 | |
| Provetta per centrifuga graduata da 50 mL | Tarsons, USA | 546021 | |
| Divaricatore per celle | VWR, USA | VWRU60828-680 | |
| Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato | HiMedia, Mumbai, India | TS1006 | |
| Etanolo | Merck | 100983 | |
| bloccante FcR | BD Biosciences | 553142 | |
| Siero fetale bovino | Gibco | 10270-106 | |
| FITC Rat anti-mouse Ly6G (clone 1A8) | BD Pharmingen | 551460 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Omogeneizzatore a mano | - | ||
| Emocitometro (camera di conteggio Neubauer) | Rohem, India | I.S. 10269 | |
| Luria Bertani Brodo | HiMedia, Mumbai, India | M1245 | |
| Paraformaldeide | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petriplates | Tarsons, USA | 460091 | |
| RPMI | Himedia, Mumbai, India | AT060-10X1L | |
| Salmonella-Shigella Agar | HiMedia, Mumbai, India | M108 | |
| Sodio azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Equipments | |||
| Centrifuga | Kubota | ||
| Citometro a flusso | BD FACSverse | ||
| Incubatrice | N-biotek | ||
| Spettrofotometro | Shimadzu | ||
| Pesatrice | Sartorius |
Riferimenti
- Hotchkiss, R. S., et al. Sepsis and septic shock. Nature Reviews Disease Primers. 2 (1), 1-21 (2016).
- Rudd, K. E., et al. regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990-2017: Analysis for the Global Burden of Disease Study. ....
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Ristampe e permessi
