Strumento di editing genetico CRISPR per l'analisi della rete di cluster microRNA

Sommario

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro di editing genico CRISPR (Short Palindromic Repeats) ad alto rendimento per l'analisi della rete di cluster di microRNA che consente la rapida generazione di un pannello di linee cellulari geneticamente modificate che trasportano combinazioni uniche di delezione dei membri del cluster di miRNA fino a 35 kb all'interno di un singolo esperimento.

Abstract

I microRNA (miRNA) sono emersi come importanti regolatori cellulari (soppressori tumorali, fattori pro-oncogeni) del cancro e delle metastasi. La maggior parte degli studi pubblicati si concentra su un singolo miRNA quando caratterizza il ruolo dei piccoli RNA nel cancro. Tuttavia, circa il 30% dei geni dei miRNA umani sono organizzati in unità raggruppate che sono spesso co-espresse, indicando un sistema complesso e coordinato di regolazione dell'RNA non codificante. Una sottovalutazione più chiara di come le reti di miRNA raggruppate funzionino in modo cooperativo per regolare la crescita del tumore, l'aggressività del cancro e la resistenza ai farmaci è necessaria prima di tradurre piccoli RNA non codificanti in clinica.

L'uso di una procedura di editing genico mediata da brevi ripetizioni palindrome raggruppate regolarmente intervallate (CRISPR) ad alto rendimento è stato impiegato per studiare il ruolo oncogenico di un cluster genomico di sette geni miRNA situati all'interno di un locus che copre ~ 35.000 bp di lunghezza nel contesto del cancro alla prostata. Per questo approccio, le linee cellulari tumorali umane sono state infettate da un vettore di lentivirus per la nucleasi Cas9 inducibile da doxiciclina (DOX) coltivata in mezzo contenente DOX per 48 ore. Le cellule sono state successivamente co-trasfettate con RNA CRISPR trans-attivante sintetico (tracrRNA) complessato con oligonucleotidi CRISPR RNA (crRNA) sito-specifici genomici per consentire la rapida generazione di linee cellulari tumorali che trasportano l'intera delezione del cluster di miRNA e delezioni di cluster di geni miRNA individuali o combinati all'interno di un singolo esperimento.

I vantaggi di questo sistema di editing genetico ad alto rendimento sono la capacità di evitare la sottoclonazione del vettore del DNA che richiede tempo, la flessibilità nel trasfettare le cellule con combinazioni uniche di RNA guida in un formato a 24 pozzetti e la genotipizzazione PCR a basso costo utilizzando lisati di cellule grezze. Gli studi che utilizzano questo approccio semplificato promettono di scoprire ridondanze funzionali e interazioni sinergiche / antagoniste tra i membri del cluster di miRNA, che aiuteranno a caratterizzare le complesse piccole reti di RNA non codificanti coinvolte nella malattia umana e informeranno meglio la futura progettazione terapeutica.

Introduzione

Sono necessari migliori strumenti di ricerca per studiare il contributo degli RNA non codificanti nelle malattie umane. La disregolazione dei miRNA è spesso osservata in disturbi umani come il cancro quando si confrontano i profili di espressione di questi piccoli RNA non codificanti nei tessuti e nei fluidi corporei (ad esempio, sangue, urina) di pazienti oncologici rispetto a individui sani non cancerogeni, che impiegano microarray, PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR) e tecnologie di sequenziamento profondo di prossima generazione ^1,2 . Lavori recenti hanno caratterizzato un ampio sottoinsieme di questi miRNA come fattori oncosoppressori, oncogeni e metastasi che controllano la formazione del tumore, la progressione della malattia e la resistenza ai farmaci. La sovraespressione sperimentale e/o la downregulation/perdita di miRNA provocano conseguenze funzionali e pleiotropiche nella cellula, riflettendo l'ampia gamma di attività associate al cancro coordinate da questi RNA non codificanti- crescita, apoptosi, differenziazione, rimodellamento della cromatina, angiogenesi, transizioni da epiteliale a mesenchimale (EMT) e MET, metabolismo e risposta immunitaria³.

I miRNA sono codificati come singoli geni o risiedono in cluster genomici, che vengono trascritti nel nucleo e ampiamente elaborati prima di generare le specie di miRNA biologicamente mature, a singolo filamento ~ 22 nucleotide (nt) localizzate nel citoplasma⁴. Questi piccoli RNA esercitano i loro effetti post-trascrizionalmente e agiscono come regolatori genici negativi che si legano ai bersagli dell'RNA messaggero (mRNA) in modo specifico per sequenza per portare il complesso di silenziamento indotto dall'RNA catalitico (RISC) al sito dell'mRNA, con conseguente degradazione dell'mRNA e / o un blocco nella traduzione delle proteine. I miRNA sono una classe estremamente abbondante di RNA non codificanti nei sistemi animali e nel genoma umano esistono 2.654 miRNA maturi (miRBase release 22.1)⁵. I miRNA si associano tipicamente a una complementarità incompleta ai loro bersagli mRNA⁴. Pertanto, un singolo miRNA può regolare da decine a centinaia di bersagli mRNA distinti e avere un impatto funzionale su una vasta gamma di percorsi biologici. Per aumentare la complessità dei meccanismi basati sui miRNA, un singolo mRNA può essere regolato da miRNA multipli e distinti. È quindi difficile indagare su come la disregolazione del miRNA interrompa l'equilibrio omeostatico del corpo e porti alla malignità umana.

La maggior parte degli studi pubblicati si sono concentrati su un singolo miRNA quando caratterizzano il loro ruolo negli eventi di malattia. Tuttavia, ~ 30% dei geni miRNA umani sono organizzati in unità raggruppate (tipicamente ~ 10 kilobasi [kb]) che sono spesso trascritte nello stesso orientamento e co-espresse, indicando un sistema coordinato e complesso di regolazione dell'RNA non codificante⁶. Il più grande cluster di miRNA umani policistronici è l'ammasso 14q32 che comprende 54 precursori di miRNA. Una delle unità di miRNA cluster più ben studiate associate ai tumori umani è il cluster policistronico miR-17-92 composto da miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20a, miR-19b-1 e miR-92-1 residenti all'interno dell'introne 3 dell'RNA non codificante, c13orf25. Il cluster miR-17-92 è frequentemente amplificato nelle neoplasie ematopoietiche e sovraespresso nei tumori solidi e ha stabilito ruoli oncogeni nel promuovere la progressione del ciclo cellulare, l'apoptosi e l'angiogenesi⁷. Inoltre, il cluster soppressivo del tumore miR-15a e miR-16-1 situato all'interno dell'introne del gene non codificante Leu2 viene spesso eliminato nelle leucemie e sottoregolato in una vasta gamma di tumori, funzionando per bloccare la crescita tumorale prendendo di mira il gene antiapoptotico BCL2 e ulteriori geni di progressione del ciclo cellulare⁸. Il cluster miR-888 è elevato nei pazienti con carcinoma prostatico di alto grado ed è costituito da sette geni miRNA (miR-892c, -890, -888, -892a, -892b, -891b e -891a) situati sul cromosoma umano Xq27.3 ^9,10.

Il cluster miR-888 mappa all'interno del locus HPCX1 (Hereditary Prostate Cancer, X-linked 1) che copre Xq27-2, che è stato identificato dall'analisi di linkage dei pedigree ereditari della famiglia del cancro alla prostata ^{11,12,13,14,15,29}. La caratterizzazione funzionale dei singoli membri raggruppati di miR-888 utilizzando strumenti convenzionali di errata espressione del miRNA - imitazioni di miRNA e inibitori antisenso - ha indicato che questi miRNA svolgono ruoli sovrapposti nella regolazione della crescita e dell'invasione del tumore alla prostata ^9,10. Tuttavia, questi metodi sperimentali non si prestano facilmente a studiare come più membri raggruppati di miR-888 agiscono sinergicamente o antagonisticamente in una rete di RNA non codificante per controllare l'omeostasi tissutale e la progressione del cancro. Questo protocollo semplificato descritto che utilizza la tecnologia di editing genico CRISPR ad alto rendimento viene modificato per sezionare molecolarmente i cluster di miRNA associati ai tumori umani (ad esempio, cluster miR-888) per colmare questa lacuna di conoscenza.

I geni batterici CRISPR e CRISPR-associated (cas) mediano l'immunità adattativa contro i batteriofagi¹⁶. La scoperta di questo antico sistema di sorveglianza procariotica è stata rapidamente adattata come un efficace strumento scientifico per colpire facilmente qualsiasi luogo genomico desiderato e apportare alterazioni della sequenza del DNA all'interno di una vasta gamma di sistemi animali e tipi di cellule sia in vitro che in vivo^16,17. Questa tecnica è molto promettente come metodo efficace per interrogare le reti di miRNA nel contesto della malattia umana. A tal fine, questo protocollo di editing genetico CRISPR ad alto rendimento per studiare il cluster miR-888 che copre ~ 35 kb sul cromosoma X umano in linee cellulari di cancro alla prostata umano immortalizzato (LNCaP, PC3-ML) è costruito per interrogare come i membri del cluster coordinano i percorsi di progressione del cancro. Questo approccio può essere applicato alla caratterizzazione di qualsiasi cluster di miRNA e consente ai ricercatori di generare rapidamente linee cellulari umane che trasportano l'intera delezione del cluster di miRNA e delezioni di cluster di miRNA individuali e combinate all'interno di un singolo esperimento.

In questa procedura, vengono stabilite linee cellulari stabili che trasportano un sistema di espressione lentivirale inducibile da doxiciclina (DOX) che consente allo sperimentatore di controllare l'espressione genica dell'endonucleasi Cas9 (csn1) associata a Streptococcus pyogenes CRISPR attraverso il promotore costitutivo inducibile DOX TRE3G. Il sistema bipartito Tet-On 3G coinvolge un promotore costitutivo del fattore di allungamento umano 1 alfa (hEF1alpha) per guidare la trascrizione sia del gene Tet-On 3G che del gene di resistenza alla blastidina (Blast^R) come trascrizione bicistronica. La proteina transattivante Tet-On 3G si lega al promotore TRE3G solo in presenza di DOX, con conseguente robusta trascrizione Cas9. In assenza di DOX, non vi è alcuna o molto minima espressione basale di Cas9. Pertanto, lo sperimentatore può indurre un'elevata produzione di proteina Cas9 in cellule cresciute in mezzi integrati con DOX durante le fasi di modifica del gene CRISPR e il controllo per una rapida clearance della proteina CAS9 al momento del ritiro di DOX.

Questo protocollo descrive anche la progettazione di oligonucleotidi sintetici crispr RNA (crRNA) mirati a regioni che fiancheggiano l'intero cluster di miRNA, singole regioni di miRNA hairpin (premiRNA) e / o sottoinsiemi di geni miRNA all'interno del cluster. Ogni crRNA progettato contiene una sequenza guida 5'-terminale da 20 nt (complementare alla sequenza genomica di interesse da prendere di mira), seguita da una sequenza di ripetizione S. pyogenes invariante da 22 nt (5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG-3') che consente l'accoppiamento di basi con gli oligonucleotidi universali trans-attivanti CRISPR RNA (tracrRNA)¹⁸. Insieme, il crRNA ricotto e il tracrRNA (rapporto misto 1:1) funzionano come RNA guida per questo protocollo (Figura 1A). In ogni esperimento, due RNA guida sintetici vengono trasfettati in cellule indotte da DOX per associare e scortare la proteina batterica Cas9 ai siti del DNA genomico (5' e 3') che fiancheggiano la regione del cluster di miRNA bersaglio per la rimozione (Figura 1B).

Una sequenza di motivo adiacente protospaziale (PAM) (5'-NGG-3' per il tipo selvaggio S. pyogenes Cas9) deve essere presente nel genoma cellulare e situata immediatamente adiacente alla sequenza di DNA da 20 nt bersaglio dell'RNA guida¹⁷. La sequenza PAM funge da segnale di legame e posiziona la regione catalitica dell'enzima Cas9 dell'endonucleasi sul sito del DNA genomico mirato, portando successivamente alla scissione diretta del DNA a doppio filamento (ds) situata ~ 3 nt a monte del PAM. Il macchinario di riparazione del DNA della cellula ripara le estremità del DNA scisso, il che può comportare una legatura perfetta, ma spesso si verifica un'unione finale non omologa (NHEJ), causando piccole inserzioni o delezioni (indels) nel sito di riparazione. Poiché i miRNA sono geni non codificanti spesso situati all'interno di regioni intergeniche e introniche, questi indel comportano un basso rischio di creare mutazioni indesiderate senza senso / missenso.

Impiegando oligonucleotidi sintetici di RNA (crRNA ricotto e tracrRNA, rapporto molare 1:1) che codificano per il complesso dell'RNA guida in questi esperimenti, questa strategia di knockout genico evita la sottoclonazione del vettore del DNA che richiede tempo e consente un'enorme flessibilità nel trasfettare combinazioni di RNA guida uniche alle cellule in un formato a 24 pozzetti. La preparazione di lisati di cellule grezze per lo screening del genotipo PCR evita anche costosi e dispendiosi in termini di tempo i metodi di purificazione del DNA, consentendo al contempo la generazione semplificata della linea cellulare a singola colonia e l'analisi fenotipica. In effetti, questo protocollo di editing genetico CRISPR ad alto rendimento è stato utilizzato con successo per trasfettare le linee cellulari del cancro alla prostata in coltura (LNCaP, PC3-ML) con 32 combinazioni di RNA guida uniche in un singolo esperimento e generare linee knockout che trasportano delezioni per l'intera regione del cluster miR-888 da ~ 35 kb; combinazioni di delezione più piccole per i membri del cluster miR-888 appartenenti alle famiglie miR-743 e miR-891a; così come delezioni per singoli membri di miRNA all'interno del cluster miR-888. Studi come questi forniranno una sottovalutazione più chiara di come i miRNA raggruppati funzionino in modo cooperativo per regolare la crescita del tumore, l'aggressività e la resistenza ai farmaci prima di tradurre i miRNA in clinica come strumenti terapeutici e diagnostici.

Protocollo

1. Preparazione per l'editing genetico CRISPR e guida la progettazione dell'RNA per generare linee cellulari knockout di cluster di miRNA

1. Creare un file di DNA contenente la sequenza genomica completa della regione di interesse del cluster di miRNA (intergenica, intronica) e almeno 1 kB di regioni genomiche circostanti utilizzando un programma software di annotazione della sequenza di DNA¹⁹.
   1. Utilizzare uno strumento di modifica delle caratteristiche nel file del DNA creato per contrassegnare il locus del cluster di miRNA mirato (intergenico, intronico) e ogni singola sequenza di forcine di miRNA appartenente al cluster di miRNA, oltre a notare altri geni codificanti e non codificanti e / o caratteristiche regolatorie^vicine 5,20,21,22.
   2. Assicurarsi che le regioni di miRNA mirate per la delezione non interrompano inavvertitamente i geni codificanti proteine vicine, i geni non codificanti o importanti elementi regolatori del DNA.
      NOTA: Considerare la complessità genomica (ad esempio, duplicazioni/fusioni cromosomiche) della linea cellulare utilizzata in questo protocollo.
2. Progettare crRNA sintetici mirati a 20 nt di sequenza genomica del DNA che fiancheggia l'intero cluster di miRNA, singole regioni di forcine di miRNA (pre-miRNA) e/o sottoinsiemi di geni miRNA all'interno del cluster utilizzando uno strumento software di progettazione di RNA guida bioinformatica (ad esempio,²³). Assicurarsi che l'enzima Cas9 appropriato sia annotato nello strumento di progettazione dell'RNA guida (ad esempio, S. pyogenes Cas9).
   NOTA: Il crRNA sintetizzato conterrà questa sequenza guida unica di 5'-terminali 20 nt (complementare al bersaglio del DNA) seguita da un invariante 22 nt S. pyogenes sequenza ripetuta per consentire l'accoppiamento di basi con l'oligonucleotide tracrRNA universale sintetizzato. Ricotti insieme, funzioneranno come RNA guida in questo protocollo.
   1. Facendo riferimento al file di DNA creato (Passo 1.1.), inserire ~150 nt di sequenza di DNA che risiede immediatamente a monte (5') o a valle (3') del locus miRNA hairpin/cluster mirato per la cancellazione nella guida bioinformatica RNA design software tool²³.
      NOTA: Lo strumento di progettazione identificherà sequenze univoche di 20 nt per la progettazione di oligonucleotidi crRNA che risiedono immediatamente adiacenti alla sequenza PAM (sul filamento di DNA non mirato) (ad esempio, S. pyogenes Cas9 PAM sequence NGG). Di seguito è riportato un esempio di progettazione di crRNA mirata a un sito immediatamente a monte (5') del locus del gene mir-891a (in particolare 5A(891a) discusso nella sezione dei risultati rappresentativi e nella Tabella 1).
      1. Aprire lo strumento software di progettazione dell'RNA guida²³.
      2. Immettere il nome 5A(891a) nella finestra Inserisci nome .
      3. Nella finestra Inserisci una sequenza di DNA , inserisci 150 nt di sequenza genomica che risiede immediatamente a monte (5') del gene precursore mir-891a : 5'-AAGAAAATATACATGCTGATAGTTACACAGG
         TTGTGAATAGTAAATTAGTATGTCATTTATTT
         TAGGTATTCAATGTTGCATAGTCATATTATA
         ATTACGTAGCTTCTTTGTTTTTTTCTAGGTT
         CCCAAAGAGTCTACAAATGTTGTCT-3'
      4. Selezionare la casella Abilita controllo specificità per escludere i siti off-targeting rilevati computazionalmente dal programma. Scegli l'organismo appropriato (cioè Umano [Homo sapiens]).
      5. Specificare il corretto enzima Cas9 PAM impiegato per gli studi, in questo caso, Streptococcus pyogenes Cas9-PAM:NGG, per generare le seguenti impostazioni predefinite: PAM rispetto al target: Dopo; Sequenza di ripetizione: GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG; Relativo alla Guida: 3; Lunghezza della sequenza target: 20; Taglio rispetto all'obiettivo 5' di partenza: Senso 17 Anti-senso 17.
      6. Fare clic sul pulsante Avanti per visualizzare i risultati per la sintesi di crRNA sintetico.
         NOTA: In questo esempio, il crRNA suggerito da sintetizzare riconoscerà il bersaglio del DNA ATACATGCTGATAGTTACAC e si troverà adiacente a PAM:AGG.
   2. Fare riferimento al file di DNA (creato nella fase 1.1.) per determinare le migliori sequenze target di crRNA 20 nt candidate che risiedono più vicine al locus miRNA da eliminare e possiedono la massima specificità per il bersaglio genomico previsto.
      1. Utilizzare strumenti di analisi computazionale off-targeting per valutare la specificità del crRNA candidato e prevedere potenziali siti di off-targeting in loci genomici non correlati alla regione di interesse del cluster di miRNA mirato (ad esempio, 24,25,26,27).
      2. Registrare i potenziali risultati di off-targeting per riferimento successivo durante la genotipizzazione di linee cellulari clonali CRISPR a colonia singola mediante PCR (Fase 4.2.6.).
         NOTA: L'estensione della complementarità di sequenza condivisa tra l'oligonucleotide crRNA progettato e la sequenza target genomica determinerà quanto selettivamente l'enzima Cas9 fende il genoma in quel luogo. Poiché l'RNA guida si ricottura al bersaglio genomico in una direzione da 3' a 5', i disallineamenti all'estremità 5' della sequenza target del DNA (le prime 8-10 basi) spesso bloccano la scissione mediata da Cas9. Se la sequenza genomica bersaglio condivide l'omologia con un altro locus genomico, tranne che all'interno delle prime otto basi della sequenza di DNA, si prevede che questo RNA guida abbia una bassa probabilità di off-targeting in questo sito.
      3. Progettare quattro crRNA unici per ogni locus miRNA mirato: due crRNA progettati per indirizzare sequenze di DNA complementari immediatamente 5' della forcina/cluster di miRNA (5'A, 5'B) e due crRNA progettati per indirizzare sequenze di DNA complementari immediatamente 3' della forcina/cluster di miRNA (3'A, 3'B).
         NOTA: Quando si eseguono le trasfezioni CRISPR (nella Sezione 3), quattro possibili combinazioni di coppie di RNA guida 5' e 3' (5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B) saranno testate per ogni locus miRNA mirato per aumentare la probabilità di generare delezioni di miRNA locus di successo in un singolo esperimento.
      4. Utilizzare uno strumento di modifica delle funzionalità nel file del DNA creato (Passo 1.1.) per contrassegnare la sequenza target del DNA (con PAM adiacente) per ogni crRNA progettato da sintetizzare.
3. Progettare e sintetizzare primer PCR (avanti, indietro) fiancheggiando le regioni del cluster di miRNA mirate per la genotipizzazione delle linee cellulari CRISPR (ed etichettare i primer nel file di DNA creato).
   1. Per la genotipizzazione di linee cellulari portatrici di piccole delezioni genomiche per miRNA strettamente raggruppati o individuali, progettare primer PCR (avanti, indietro) che risiedono a circa 150 bp su ciascun lato del sito di scissione Cas9 / regione di knockout che consentiranno il rilevamento di entrambi i frammenti di DNA wildtype (~ 600 bp) e knockout (~ 300 bp) in una singola reazione PCR tramite elettroforesi su gel.
   2. Per la genotipizzazione di linee cellulari portatrici di grandi delezioni genomiche per combinazioni di precursori di miRNA o l'intero cluster di miRNA, progettare nuovamente primer PCR (avanti, indietro) che risiedono a circa 150 bp su ciascun lato del sito di scissione / knockout Cas9. Si noti che, se la delezione mirata del cluster di miRNA si estende per >4 kb di lunghezza, la reazione PCR probabilmente rileverà solo il frammento di DNA knockout più piccolo (~ 300 bp) ma non il frammento di DNA wildtype. Pertanto, progettare ulteriori primer PCR (avanti, indietro) in grado di rilevare la presenza o l'assenza di geni interni del cluster di miRNA per aiutare il processo di screening e convalidare le linee cellulari knockout omozigoti.

2. Generazione di linee cellulari lentivirali stabili che trasportano la cassetta di espressione Cas9 inducibile da DOX

NOTA: Eseguire tutte le colture cellulari e il lavoro sui virus in una cappa di biosicurezza certificata utilizzando procedure BSL2 e tecnica asettica.

1. Determinare il tipo di linea cellulare appropriato per gli studi CRISPR e il mezzo di crescita preferito.
   NOTA: Questo protocollo è stato sviluppato per le linee cellulari di carcinoma prostatico umano LNCaP (mezzo preferito: RPMI, siero bovino fetale al 10% [FBS]) e PC3-ML (mezzo preferito: DMEM, 10% FBS).
2. Eseguire una curva di "morte" della blasticidina per determinare la concentrazione ottimale del farmaco da selezionare per le cellule infette da lentivirus che trasportano la cassetta del gene della resistenza alla blasticidina (Fase 2.3.).
   1. Le cellule a piastre in 11 pozzetti di una piastra a 24 pozzetti crescono a 37 °C, 5% CO₂ nel mezzo preferito fino a circa il 75% confluente.
   2. Diluire la blastidina (stock di lavoro 1 mg/mL) nel mezzo preferito con una concentrazione finale compresa tra 0, 1 e 10 μg/mL e diluita con incrementi di 1 μg/mL.
   3. Etichettare i pozzetti del piatto seminato a 24 pozzetti da 1 a 11. Rimuovere il terreno di coltura dai pozzetti e sostituirlo con le opportune concentrazioni di blastidina.
   4. Cambiare il mezzo con le concentrazioni appropriate di blastidina a giorni alterni per 7-10 giorni.
   5. Esaminare le cellule ogni giorno durante il corso del tempo e determinare la concentrazione minima di blasticidina necessaria per uccidere tutte le cellule entro 5-7 giorni.
      NOTA: Una curva di "uccisione" della blasticidina dovrà essere eseguita per ogni specifica linea cellulare impiegata per gli esperimenti di editing genetico CRISPR.
3. Infettare le cellule con lentivirus che trasportano la cassetta di espressione Cas9 inducibile dox ed eseguire la selezione della blasticidina utilizzando la concentrazione ottimale determinata nella fase 2.2.
   1. In tre pozzetti di un piatto a 6 pozzetti, seminare 5 × 10⁴ cellule per pozzetto e crescere nel mezzo preferito a 37 °C, 5% CO₂ durante la notte (ON).
   2. Il giorno dopo, scongelare il vettore di espressione del lentivirus per Cas9 inducibile da DOX (Lenti-iCas9) sul ghiaccio. Mescolare delicatamente (non vortex particelle virali).
      NOTA: Conservare il lentivirus in aliquote a -80 °C per evitare cicli multipli di congelamento/disgelo, che ridurranno i titoli virali e l'efficienza dell'infezione.
   3. Calcola il volume necessario per trasdurre 5 × 10⁴ cellule con virus ad una molteplicità di infezione di 0,3 (MOI = 0,3) in base alla concentrazione del titolo virale.
   4. Pipettare il volume appropriato del virus in 250 μL (per pozzetto) di mezzo preferito privo di siero e senza antibiotici integrato con 0,8 μg/mL di esadimerina bromuro. Mescolare delicatamente.
      NOTA: L'esadimerina bromuro è un polimero cationico trovato per aumentare l'adsorbimento virale e l'efficienza delle infezioni.
   5. Rimuovere il supporto. Aggiungere i 250 μL di mezzo di trasduzione preparato con il virus Lenti-iCas9 (MOI = 0,3) alle cellule e incubare ON a 37 °C, 5% CO₂. (Ridurre il tempo di incubazione a 4-6 ore se le cellule mostrano effetti tossici correlati al virus.)
   6. Sostituire il mezzo con un mezzo fresco preferito e consentire alle cellule di recuperare per 1-2 giorni.
   7. Eseguire la selezione della blasticidina sulle cellule infette per 10-14 giorni utilizzando la concentrazione ottimale di blasticidina derivata dalla curva "uccidere" descritta nella fase 2.2.
      1. In parallelo, far crescere le cellule non infette in mezzo con la concentrazione ottimale di blasticidina da utilizzare come controllo positivo per la selezione virale.
   8. Cambiare il mezzo integrato con la concentrazione ottimale di blasticidina ogni 3 giorni durante il corso del tempo di selezione per rimuovere le cellule morte.
      NOTA: Solo le cellule che sopravvivono alla selezione della blasticidina avranno integrato il vettore lentivirale.
   9. Espandi le linee cellulari Lenti-iCas9 selezionate dalla blastidina.
      NOTA: registrare il numero di passaggio della cella ad ogni espansione.
      1. Congelare una parte delle cellule Lenti-iCas9 nel mezzo preferito integrato con il 10% di dimetilsolfossido (DMSO) per la conservazione crioviale a lungo termine.
      2. Analizzare una porzione delle cellule Lenti-iCas9 mediante Western blot⁹ per identificare la linea cellulare che presenta i livelli di proteina Cas9 più robusti e inducibili da DOX (vedere Passo 2.3.).
4. Eseguire una curva di concentrazione di doxiciclina su linee cellulari Lenti-iCas9 di nuova costituzione per determinare le condizioni ottimali per l'induzione della proteina Cas9.
   1. Impostare quattro piastre indipendenti a 6 pozzetti per ogni linea cellulare testata per eseguire questo corso di concentrazione DOX. La piastra 5 × 10⁴ celle per pozzetto di ogni piastra a 6 pozzetti e cresce a 37 °C, 5% CO₂ nel mezzo preferito per 24 ore.
   2. Diluire DOX (stock di lavoro 1 mg/mL) nel mezzo preferito con una curva di concentrazione finale di DOX compresa tra 0, 50, 100, 150, 250 a 500 ng/mL.
   3. Etichettare i pozzetti di ogni piatto a 6 pozzetti seminato da 1 a 6. Rimuovere il mezzo e sostituirlo con le concentrazioni di DOX appropriate. Far crescere le piastre 1-4 fino ai seguenti punti temporali: 24 h, 48 h e 72 h induzione DOX; e 120 ore dopo il prelievo di DOX (inizialmente 72 ore indotte da DOX).
   4. Raccogliere i pozzetti del piatto in ogni punto temporale utilizzando metodi appropriati (ad esempio, tripsinizzazione). Conservare il pellet cellulare a -80 °C. Elaborare i pellet di cella nel tampone RIPA per l'isolamento del lisato e l'analisi Cas9 western blot.
      1. Eseguire 40 μg di lisato cellulare per ogni campione del corso di tempo di induzione DOX utilizzando un gel di Bis-Tris denaturante al 4%-12% e trasferire le proteine su una membrana immunoblot.
      2. Ibridare la membrana immunoblot con un anticorpo primario contro Cas9 per rilevare la proteina 160 kDa. Normalizzare i livelli di Cas9 utilizzando un gene di pulizia come GAPDH (37 kDa).
   5. Sulla base dei risultati del western blot, determinare la concentrazione ottimale di DOX per indurre Cas9 nelle linee cellulari Lenti-iCas9.
      NOTA: Questo corso di tempo rivelerà anche quanto strettamente l'espressione Cas9 è regolata su 120 h post rimozione DOX.
   6. Stabilire colonie monocellulari per le linee cellulari Lenti-iCas9 che mostrino una robusta espressione della proteina Cas9 per ottimizzare le trasfezioni CRISPR (nella Sezione 3).

3. Esecuzione di reazioni CRISPR mediante induzione Cas9 e trasfezione di RNA guida sintetico delle cellule utilizzando un formato ad alto rendimento

NOTA: nella Figura 1 viene illustrato un diagramma del flusso di lavoro.

1. Su carta, mappare le combinazioni di coppie di crRNA che saranno trasfettate in ciascun pozzetto di una placca a 24 pozzetti che mira all'intero cluster di miRNA, varie combinazioni di geni miRNA raggruppati e singoli membri del cluster di miRNA.
   1. Sulla mappa, etichettare quattro pozzetti per locus miRNA mirato. Ognuno di essi rappresenta una reazione di trasfezione, con due crRNA unici posizionati a 5' e 3' del locus genomico knockout del miRNA desiderato e del tracrRNA (rapporto molare 1:1 ricotto).
   2. Assicurarsi che ciascuno dei quattro pozzetti etichettati rappresenti una coppia di crRNA unica per la trasfezione (ad esempio, 5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B).
      NOTA: La progettazione di due crRNA da 5' e due crRNA da 3' che fiancheggiano ciascun locus miRNA mirato (Sezione 1) consente la generazione di quattro possibili coppie di RNA guida 5' e 3' nella reazione di trasfezione.
2. Placcare la linea cellulare Lenti-iCas9 a 5 x 10⁴ celle/pozzetto di una piastra a 24 pozzetti nel mezzo preferito contenente la concentrazione ottimizzata di DOX (determinata nella fase 2.4.). Far crescere le cellule per 24-48 ore a 37 °C, 5% CO₂ per indurre l'espressione della proteina Cas9.
3. Trasfettate le cellule Lenti-iCas9 con gli RNA guida da 5' e 3' preparati.
   1. Ricostituire gli oligonucleotidi di crRNA e tracrRNA sintetizzati con acqua priva di nucleasi ad una concentrazione di stock di 10 μM. Conservare a -80 °C a lungo termine.
   2. Etichettare quattro tubi microcentrifuga da 1,5 mL per locus miRNA mirato in base alla mappa sperimentale progettata nella fase 3.1., che rappresenta le quattro possibili combinazioni di coppie di crRNA 5' e 3' (5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B).
   3. In ogni tubo, mescolare un rapporto molare 1:1 di tracrRNA e crRNA unici (5' e 3') insieme per formare il complesso di RNA guida da 2 μM usando la seguente reazione (volume finale di 10 μL):
      1. Aggiungere 2,5 μL di tracrRNA (10 μM di stock), 1,25 μL del crRNA posizionato a 5' (10 μM di stock), 1,25 μL del crRNA posizionato da 3' (10 μM stock) e 5 μL di 10 mM TRIS-HCL pH 7,5 a un tubo centrifugo da 1,5 mL. Microcentrifuga per 30 s a 16.000 × g da miscelare. Incubare a temperatura ambiente (RT) per 5 min.
   4. A ciascun tubo, aggiungere 40 μL di mezzo sierico ridotto (ad esempio, Opti-MEM) ai 10 μL di reazione complessa dell'RNA guida (volume totale di 50 μL). Mescolare delicatamente pipettando su e giù.
   5. In un tubo centrifugo pulito da 1,5 mL, miscelare 2 μL del reagente di trasfezione²⁸ (vedere NOTA 3.3.5.1.) e 48 μL di mezzo sierico ridotto (ad esempio, Opti-MEM, volume finale di 50 μL) delicatamente mediante pipettatura su e giù. Incubare a RT per 5 min.
      1. Preparare una miscela principale del reagente di trasfezione moltiplicando le quantità di reagente (2 μL) e di mezzo sierico ridotto (ad esempio, Opti-MEM, 48 μL) per il numero di pozzetti da trasfettare, più il 10% di volume extra per tenere conto di lievi imprecisioni di pipettaggio.
         NOTA: Selezionare un reagente di trasfezione ottimizzato per le piccole trasfezioni di oligonucleotidi di RNA e CRISPR RNA, nonché per la linea cellulare di tipo²⁸.
   6. A ciascun tubo contenente i 50 μL di miscela di RNA guida (dal passo 3.3.4.), aggiungere i 50 μL del reagente di trasfezione diluito (dal punto 3.3.5.). Pipettare la miscela lentamente su e giù una volta per mescolare. Incubare a RT per 20 min.
   7. Aggiungere 400 μL di mezzo privo di antibiotici integrato con DOX (concentrazione ottimale) a ciascun tubo contenente i 100 μL della miscela guida RNA/trasfezione. Pipettare delicatamente per mescolare.
4. Rimuovere il mezzo dalle celle Lenti-iCas9 indotte da DOX (Passaggio 3.2.). Aggiungere 500 μL di media/DOX/RNA guida/mix di trasfezione basato sulla mappa sperimentale delle placche a 24 pozzetti (Fase 3.1.). Incubare le cellule trasfettate per 48 ore a 37 °C, 5% CO₂.
5. Sostituire il mezzo con il mezzo fresco preferito senza DOX (per eliminare la proteina Cas9 dalle cellule). Consentire alle cellule di recuperare per altre 24-48 ore a 37 °C, 5% CO₂.
6. Raccogliere le cellule trasfettate (tripsinizzazione) e prepararsi per la genotipizzazione e le diluizioni unicellulari.
   NOTA: Le cellule rappresentano una popolazione mista contenente cellule wild-type trasfettate geneticamente modificate e non trasfettate. Questo passaggio determinerà l'efficienza dell'editing CRISPR prima di investire tempo / risorse nell'espansione della colonia a singola cellula.
   1. Lavare le cellule 1x con 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Incubare le cellule in 100 μL di tripsina per 5 minuti a 37 °C, 5% CO₂ e trasferire le cellule in un tubo centrifugo pulito da 1,5 mL contenente 1 mL di mezzo.
   2. Invertire per miscelare e microcentrifificare le cellule per 5 minuti a 200 × g a 20 °C. Rimuovere il mezzo e risospescere il pellet cellulare in 1 mL di PBS.
   3. Microcentrifificare le celle lavate per 5 minuti a 200 × g a 20 °C. Rimuovere il PBS e risospesciare il pellet cellulare in 150 μL del mezzo preferito.
7. Determinare il numero di cellule per microlitro dei 150 μL di cellule risospese utilizzando un emocitometro o uno strumento automatizzato di conteggio delle cellule.
8. Separare i 150 μL di celle risospese in tre parti.
   1. Congelare 1/3 di cellule trasfettate (50 μL) in media più il 10% di DMSO (volume finale di 150 μL) in crioviali per future espansioni/conservazione a lungo termine.
   2. Trasferire 1/3 delle cellule trasfettate (50 μL) in un tubo PCR pulito da 0,2 mL per la genotipizzazione.
      1. Microcentrifugare le cellule per 5 minuti a 200 × g a 4 °C e rimuovere il mezzo.
      2. Risospendare il pellet di cella in 100 μL di PBS.
      3. Microcentrifugare le celle per 5 minuti a 200 × g a 4 °C e rimuovere il PBS. Conservare i pellet cellulari a popolazione mista a lungo termine a -80 °C.
      4. Elaborare il pellet di cella per la genotipizzazione utilizzando il flusso di lavoro di cui alla Sezione 4.
   3. Preparare l'ultimo 1/3 delle cellule (50 μL) per la diluizione e la placcatura in un formato a piastre a 96 pozzetti per generare colonie monocellulari.
      1. In base al conteggio delle cellule nel passaggio 3.7., calcolare le diluizioni necessarie per ottenere 10, 5, 2 e 1 cella(e) in 100 μL di mezzo per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
      2. Utilizzando un multi-pipettor a 12 canali e un serbatoio di reagente sterile, aggiungere 100 μL di cellule diluite per pozzetto a due file della piastra (24 pozzetti totali) per ogni diluizione (10, 5, 2 o 1 cella per pozzetto). Lasciare 4-6 settimane affinché le cellule crescano fino alla confluenza per l'espansione della colonia unicellulare. Osservare le cellule settimanalmente al microscopio ottico e notare se le colonie rappresentano colonie a cellula singola o multipla.
      3. Raccogliere ~10-15 colonie monocellulari per la genotipizzazione (Sezione 4). Identificare almeno tre linee di colonie monocellulari indipendenti, knockout, per ogni locus miRNA mirato. Mantenere le linee a cella singola di tipo wild come controlli.
         NOTA: Il numero di screening dipenderà dal tipo di linea cellulare e dall'impatto del fenotipo del knockout del miRNA sulla crescita/vitalità cellulare.

4. Genotipizzazione PCR di linee cellulari CRISPR utilizzando lisati cellulari grezzi

1. Raccogli colonie individuali unicellulari da pozzi quasi confluenti di una piastra a 96 pozzetti.
   NOTA: La rimozione del mezzo/PBS descritto in questi passaggi può essere eseguita manualmente utilizzando un aspiratore a vuoto nell'armadio di biosicurezza, ma fare attenzione ad evitare la contaminazione incrociata. Utilizzare una nuova punta sterile "gialla" da 200 μL per ogni pozzetto della piastra da 96 pozzetti durante l'aspirazione, in cui ogni punta gialla scambiata è saldamente posizionata all'estremità di una pipetta sterile di pascolo di vetro attaccata all'aspiratore sottovuoto.
   1. Lavare i pozzetti 1x con 100 μL di PBS. Aspirare il PBS.
   2. Aggiungere 50 μL di tripsina e incubare per 2-5 minuti a 37 °C, 5% CO₂.
   3. Pipettare delicatamente su e giù e trasferire le celle risospese in un tubo centrifugo da 1,5 ml contenente 1 mL di mezzo.
   4. Capovolgere per mescolare e pellettificare delicatamente le celle in una microcentrifuga per 5 minuti a 200 × g a 20 °C.
   5. Rimuovere il supporto e aggiungere 1 mL di PBS. Far scorrere delicatamente il tubo per interrompere il pellet e invertire più volte per mescolare.
   6. Microcentrifuga per 5 min a 200 × g a 20 °C per pellettificare le celle.
   7. Rimuovere il PBS e risospesciare il pellet in 300 μL di PBS fresco.
   8. Dividere il campione da 300 μL in due parti.
      1. Trasferire 200 μL delle celle (2/3 del pellet) in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti contenente 1 mL del mezzo preferito. Una volta convalidato il genotipo, utilizzare queste cellule per espandere le linee cellulari knockout mediate da CRISPR per l'analisi funzionale.
      2. Trasferire 100 μL delle celle (1/3 del pellet) in un tubo PCR da 0,2 mL. Microcentrifuga per 5 minuti a 3.000 x g a 4 °C. Rimuovere il PBS. Conservare il pellet a -80 °C.
2. Preparare lisati di cellule grezze per la genotipizzazione e l'analisi di sequenza utilizzando i primer PCR progettati nella fase 1.3. Includere i lisati cellulari preparati da cellule non trasfettate in questi esperimenti da utilizzare come controlli positivi wild-type.
   1. Risospesso il pellet cellulare in 4 μL di 5x tampone di DNA polimerasi (vedere la tabella dei materiali, concentrazione finale 1x), 1 μL di proteinasi K (20 ng/mL di stock), 1 μL di RNasi A (10 ng/mL di stock) e acqua priva di nucleasi fino a un volume totale di 20 μL.
   2. Lisare le celle in un termociclatore utilizzando un programma PCR: 56 °C per 30 min e 96 °C per 5 min. Conservare i lisati cellulari a -20 °C.
   3. Eseguire una reazione PCR utilizzando i primer PCR progettati (avanti, indietro) che fiancheggiano i siti bersaglio dell'RNA guida 5' e 3' (Tabella 1).
      NOTA: Le condizioni del tampone della DNA polimerasi e del termociclo dipenderanno dall'enzima Taq DNA polimerasi utilizzato per la reazione PCR. Questo protocollo è stato ottimizzato per una Phusion HF DNA Polimerasi.
      1. Impostare la miscela di reazione PCR su ghiaccio: 5 μL di 5x tampone di DNA polimerasi, 0,5 μL di primer PCR in avanti (10 μM di stock), 0,5 μL di primer PCR inverso (10 μM stock), 0,5 μL di 10 mM dNTPs, 0,25 μL di DNA polimerasi, 1-4 μL di lisato cellulare e acqua priva di nucleasi fino a un volume totale di 25 μL.
      2. Eseguire la reazione PCR in un termociclatore utilizzando il programma: 98 °C per 3 min e 35 cicli di 98 °C per 10 s, 62 °C per 15 s, 72 °C per 15 s e poi 72 °C per 10 min. Tenere premuto per 4 °C. Cfr. NOTA 4.2.3. sopra.
   4. Caricare i prodotti PCR su un gel di agarosio all'1% per l'analisi dell'elettroforesi.
   5. Estrarre il DNA dai frammenti isolati di PCR della dimensione molecolare prevista per i genotipi knockout (e wild-type). Preparare i campioni per il sequenziamento del DNA.
   6. Convalidare che la reazione CRISPR abbia avuto successo ed eseguire il sequenziamento del DNA dei frammenti isolati di PCR per identificare il sito di scissione Cas9 e confermare la delezione del locus miRNA.
      1. Isolare almeno tre linee cellulari knockout indipendenti per ogni locus miRNA bersaglio di CRISPR. Mantenere linee cellulari wild-type (ed eterozigoti) da utilizzare come controlli negli studi funzionali a valle.
      2. Eseguire l'analisi qRT-PCR o northern blot per confermare che le linee cellulari knockout non esprimono miRNA maturo per il locus eliminato.
         NOTA: Il sequenziamento dell'intero genoma (WGS) è il metodo più definitivo per convalidare l'editing genetico CRISPR e l'off-targeting.
      3. Test per gli effetti di off-targeting CRISPR mediante PCR, che sono stati previsti computazionalmente (Passo 1.2.3.) 24,25,26,27.
      4. Se lo screening esteso di colonie monocellulari si traduce solo in genotipi eterozigoti, ripetere la trasfezione dell'RNA guida nelle linee eterozigoti a singola cellula.
         NOTA: L'incapacità di ottenere linee cellulari knockout omozigoti potrebbe indicare effetti letali dovuti alla perdita di miRNA o alla complessità genomica intrinseca (ad esempio, duplicazioni/fusioni cromosomiche) della linea cellulare parentale che richiedono ulteriori analisi.

Risultati

Questo protocollo di delezione CRISPR ad alto rendimento è stato impiegato con successo utilizzando la trasfezione di linee cellulari tumorali umane LNCaP e PC3-ML inducibili Cas9 con RNA guida oligonucleotidica sintetici mirati al cluster miR-888, che sono stati studiati nel contesto del cancro alla prostata. Il cluster miR-888 è stato inizialmente identificato in uno screening di profilazione dell'espressione come elevato nei pazienti con cancro alla prostata con malattia di alto grado rispetto ai pazienti di basso gra...

Discussione

Questa procedura di modifica del gene CRISPR consente allo sperimentatore di generare rapidamente un intero pannello di linee cellulari che trasportano combinazioni uniche di delezione di cluster di miRNA. La trasfezione di RNA guida sintetici composti da crRNA genomici sito-specifici da 5' e 3' ricotti con tracrRNA sintetico (rapporto molare 1:1) in questo protocollo evita la sottoclonazione del vettore plasmidico dispendioso in termini di tempo e consente un design sperimentale più flessibile e ad alto rendimento utili...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Provette per PCR da 0,2 mL, tappo piatto	Fisher	14-230-225	Plasticware
Provette per microcentrifuga da 1,5 mL	Seal-Rite	1615-5500	Plasticware
Piastra per coltura tissutale a 24 pozzetti	Corning Costar	09761146	Plasticware
5x Phusion HF Buffer	Thermo Scientific	F-518L	PCR reagente, genotipizzazione
Piastra per coltura tissutale a 6 pozzetti	Fisher	FB012927	Plasticware
Piastra per coltura tissutale a 96 pozzetti	Falcon	08-772-2C	Plasticware Anticorpo
anti-CRISPR-Cas9 [7A9-3A3], Reagente Western blot monoclonale di topo	AbCam	ab191468	; 160 kDa; diluizione 1:200
Antibiotico-Antimicotico (100x)	Gibco	15240062	Reagente di coltura Tisuue
Motore di ricerca nucleotidico BLAST	National Center for Biotechnology Information	NA	Freeware; sito web: blast.ncbi.nlm.nih.gov
Blasticidin S, Cloridrato, Streptomyces griseochromogenes	Calbiochem	CAS 589205	reagente CRISPR; Sostanze chimiche, Scorte di lavoro = 1 mg/mL in acqua
Countess 3 Contatore di cellule automatizzato	Invitrogen	A50298	Apparecchiature; Contatore di cellule
Provette criogeniche	Thermo Scientific	50001012	Plasticware
Dharmacon CRISPR Design Tool	Horizon Discovery Ltd.	NA	Freeware; sito web: horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer
DharmaFECT siRNA Transfection Reagent #2	Dharmacon, Inc.	T-2002-02	Reagente di trasfezione; Linee cellulari LNCaP e PC3-ML
Dimetil solfossido (DMSO)	Fisher	BP231100	Reagente per colture Tisuue
DMEM Medium con L-Glutammina, 4,5 g/L di glucosio e Piruvato di sodio	Corning	MT10013CV	Reagente per colture Tisuue; Terreni per cellule PC3-ML
Doxiciclina cloridrato, soluzione pronta	Sigma-Aldrich	D3072-1ML	reagente CRISPR; Sostanze chimiche, Stock di lavoro = 1 mg/mL di stock in acqua
DPBS, senza calcio, senza magnesio	Gibco	14190144	Reagente di coltura Tisuue
Edit-R CRISPR-Cas9 TracrRNA sintetico, 20 nmol, progettato	Dharmacon, Inc.	U-002005-20	Reagente CRISPR; Oligonucleotidi Universal tracrRNA
Edit-R Modified Synthetic crRNA, desalino/deprotetto, 2 nmol	Dharmacon, Inc.	reagente crRNA-460XXX	CRISPR; Progettato crRNA oligonucleotidi
EditR Lentivirale inducibile hEF1aBlastCas9 particelle nucleasi, 50 μ L, 107 TU/mL	Dharmacon, Inc.	VCAS11227	reagente CRISPR; Lenti-iCas9; Sistema vettoriale lentivirale inducibile dalla doxiciclina Streptococcus pyogenes Cas9
Ensembl genomic viewer	Ensembl	NA	Freeware; sito web: [ensembl.org] Utilizzo: Browser genomico per identificare un sequenziamento nucleotidico contenente il cluster miRNA e le sequenze gene/regolatorie circostanti.
Anticorpo GAPDH (FL-335), policlonale di coniglio	Santa Cruz Biotechnology	sc25778	Reagente Western blot; 37 kDa; diluizione 1:500
Kit di estrazione di frammenti di DNA su gel/PCR	IBI Scientific	IB47010	Reagente per elettroforesi su gel di acido nucleico
Gibco Fetale Siero bovino, certificato	Gibco	16000044	Reagente per colture Tisuue
Bromuro di esadimetrina	MilliporeSigma	H9268	Reagente CRISPR; Chimico, Stock di lavoro = 0,8 mg/mL
Immobilon-FL PVDF Membrana	MilliporeSigma	IPFL10100	Reagente Western blot;
tampone bloccante nitrocellulosa Intercept (TBS)	LI-COR	927-60001	Reagente Western blot
IRDye 680RD Anticorpo secondario IgG anti-topo di capra	LI-COR	926-68070	Reagente Western blot
IRDye 800CW Anticorpo secondario IgG anti-coniglio di capra	LI-COR	926-32211	Reagente Western blot
Microcentrifuga	Eppendorf	5425 R	Plasticware
miRBase microRNA viewer	miRBase	NA	Freeware; sito web: [mirbase.org] Uso: Borowser elenca tutte le forcine di miRNA annotate, le sequenze di miRNA mature e la mappatura dei miRNA raggruppati associati entro 10 kb.
NuPAGE da 4 a 12%, Bis-Tris, 1,0 mm, Mini Protein Gel, reagente	Invitrogen	NP0321BOX	Western blot
Sistema di imaging Odyssey CLx	LI-COR	CLx	; Western blot imaging
Opti-MEM Siero ridotto Medium	Gibco	31985062	Reagente di trasfezione
Owl D2 Wide-Gel Electrophoresis	Owl	D2-BP	Equipment; Sistema di elettroforesi su gel di acidi nucleici
Primer PCR, progettati (oligonucleotidi di DNA a filamento singolo)	Tecnologia del DNA integrata	Reagente NA	PCR, genotipizzazione
Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltà (2 U/µ L)	PCR Thermo Scientific	F530S	, tampone
di lisi RIPA per genotipizzazione 10x	MilliporeReagente Western	blot	20-188
Soluzione di proteinasi K (20 mg/mL), reagente RNA grade	Invitrogen	25530049	PCR, genotipizzazione
RNasi A, DNasi e proteasi (10 mg/mL)	Thermo Scientific	EN0531	, genotipizzazione
RPMI 1640 Medium	reagente di coltura Gibco	MT10041CV	Tisuue; Media per cellule LNCaP
SnapGene Viewer	Snap Gene	NA	Freeware; sito web: [snapgene.com]  Utilizzo: programma software di annotazione della sequenza del DNA per creare un file di DNA per la progettazione di gRNA e che  evidenzia il locus del cluster di miRNA (intergenico, intronico), ogni singola sequenza di forcina di miRNA appartenente al cluster di miRNA e altri geni codificanti e non codificanti nelle vicinanze e/o caratteristiche regolatorie
TrypLE Select Enzyme (1x), nessun	Gibco	12563029	Tisuue rosso fenolo; Tripsina ricombinante
Agarosio ultrapuro	Invitrogen	16500100	Reagente per elettroforesi su gel di acido nucleico
Veriti Termociclatore rapido a 96 pozzetti	ThermoFisher Scientific	4375305
Apparecchiature XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis	Invitrogen	EI0001	; Sistema di elettroforesi su gel di proteine