Questo protocollo descrive un flusso di lavoro di editing genico CRISPR (Short Palindromic Repeats) ad alto rendimento per l'analisi della rete di cluster di microRNA che consente la rapida generazione di un pannello di linee cellulari geneticamente modificate che trasportano combinazioni uniche di delezione dei membri del cluster di miRNA fino a 35 kb all'interno di un singolo esperimento.
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Articolo metodologico
Strumento di editing genetico CRISPR per l'analisi della rete di cluster microRNA
In questo articolo
Sommario
Abstract
I microRNA (miRNA) sono emersi come importanti regolatori cellulari (soppressori tumorali, fattori pro-oncogeni) del cancro e delle metastasi. La maggior parte degli studi pubblicati si concentra su un singolo miRNA quando caratterizza il ruolo dei piccoli RNA nel cancro. Tuttavia, circa il 30% dei geni dei miRNA umani sono organizzati in unità raggruppate che sono spesso co-espresse, indicando un sistema complesso e coordinato di regolazione dell'RNA non codificante. Una sottovalutazione più chiara di come le reti di miRNA raggruppate funzionino in modo cooperativo per regolare la crescita del tumore, l'aggressività del cancro e la resistenza ai farmaci è necessaria prima di tradurre piccoli RNA non codificanti in clinica.
L'uso di una procedura di editing genico mediata da brevi ripetizioni palindrome raggruppate regolarmente intervallate (CRISPR) ad alto rendimento è stato impiegato per studiare il ruolo oncogenico di un cluster genomico di sette geni miRNA situati all'interno di un locus che copre ~ 35.000 bp di lunghezza nel contesto del cancro alla prostata. Per questo approccio, le linee cellulari tumorali umane sono state infettate da un vettore di lentivirus per la nucleasi Cas9 inducibile da doxiciclina (DOX) coltivata in mezzo contenente DOX per 48 ore. Le cellule sono state successivamente co-trasfettate con RNA CRISPR trans-attivante sintetico (tracrRNA) complessato con oligonucleotidi CRISPR RNA (crRNA) sito-specifici genomici per consentire la rapida generazione di linee cellulari tumorali che trasportano l'intera delezione del cluster di miRNA e delezioni di cluster di geni miRNA individuali o combinati all'interno di un singolo esperimento.
I vantaggi di questo sistema di editing genetico ad alto rendimento sono la capacità di evitare la sottoclonazione del vettore del DNA che richiede tempo, la flessibilità nel trasfettare le cellule con combinazioni uniche di RNA guida in un formato a 24 pozzetti e la genotipizzazione PCR a basso costo utilizzando lisati di cellule grezze. Gli studi che utilizzano questo approccio semplificato promettono di scoprire ridondanze funzionali e interazioni sinergiche / antagoniste tra i membri del cluster di miRNA, che aiuteranno a caratterizzare le complesse piccole reti di RNA non codificanti coinvolte nella malattia umana e informeranno meglio la futura progettazione terapeutica.
Introduzione
Sono necessari migliori strumenti di ricerca per studiare il contributo degli RNA non codificanti nelle malattie umane. La disregolazione dei miRNA è spesso osservata in disturbi umani come il cancro quando si confrontano i profili di espressione di questi piccoli RNA non codificanti nei tessuti e nei fluidi corporei (ad esempio, sangue, urina) di pazienti oncologici rispetto a individui sani non cancerogeni, che impiegano microarray, PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR) e tecnologie di sequenziamento profondo di prossima generazione 1,2 . Lavori recenti hanno caratterizzato un ampio sottoinsieme di quest....
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Protocollo
1. Preparazione per l'editing genetico CRISPR e guida la progettazione dell'RNA per generare linee cellulari knockout di cluster di miRNA
- Creare un file di DNA contenente la sequenza genomica completa della regione di interesse del cluster di miRNA (intergenica, intronica) e almeno 1 kB di regioni genomiche circostanti utilizzando un programma software di annotazione della sequenza di DNA19.
- Utilizzare uno strumento di modifica delle caratteristiche nel file del DNA creato per contrassegnare il locus del cluster di miRNA mirato (intergenico, intronico) e ogni singola sequenza di forcine di miRN....
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Risultati
Questo protocollo di delezione CRISPR ad alto rendimento è stato impiegato con successo utilizzando la trasfezione di linee cellulari tumorali umane LNCaP e PC3-ML inducibili Cas9 con RNA guida oligonucleotidica sintetici mirati al cluster miR-888, che sono stati studiati nel contesto del cancro alla prostata. Il cluster miR-888 è stato inizialmente identificato in uno screening di profilazione dell'espressione come elevato nei pazienti con cancro alla prostata con malattia di alto grado rispetto ai pazienti di basso gra.......
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Discussione
Questa procedura di modifica del gene CRISPR consente allo sperimentatore di generare rapidamente un intero pannello di linee cellulari che trasportano combinazioni uniche di delezione di cluster di miRNA. La trasfezione di RNA guida sintetici composti da crRNA genomici sito-specifici da 5' e 3' ricotti con tracrRNA sintetico (rapporto molare 1:1) in questo protocollo evita la sottoclonazione del vettore plasmidico dispendioso in termini di tempo e consente un design sperimentale più flessibile e ad alto rendimento utili.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Ringraziamenti
Le linee cellulari PC3-ML sono state gentilmente fornite da Mark Stearn (Drexel University College of Medicine). Justin Toxey ha aiutato nella genotipizzazione PCR. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione della Fondazione Breedan Adams, un Fondo di ricerca traslazionale Ryan e una sovvenzione del Commonwealth Health Research Board (CHRB-274-11-20) ad AE-K.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provette per PCR da 0,2 mL, tappo piatto | Fisher | 14-230-225 | Plasticware |
| Provette per microcentrifuga da 1,5 mL | Seal-Rite | 1615-5500 | Plasticware |
| Piastra per coltura tissutale a 24 pozzetti | Corning Costar | 09761146 | Plasticware |
| 5x Phusion HF Buffer | Thermo Scientific | F-518L | PCR reagente, genotipizzazione |
| Piastra per coltura tissutale a 6 pozzetti | Fisher | FB012927 | Plasticware |
| Piastra per coltura tissutale a 96 pozzetti | Falcon | 08-772-2C | Plasticware Anticorpo |
| anti-CRISPR-Cas9 [7A9-3A3], Reagente Western blot monoclonale di topo | AbCam | ab191468 | ; 160 kDa; diluizione 1:200 |
| Antibiotico-Antimicotico (100x) | Gibco | 15240062 | Reagente di coltura Tisuue |
| Motore di ricerca nucleotidico BLAST | National Center for Biotechnology Information | NA | Freeware; sito web: blast.ncbi.nlm.nih.gov |
| Blasticidin S, Cloridrato, Streptomyces griseochromogenes | Calbiochem | CAS 589205 | reagente CRISPR; Sostanze chimiche, Scorte di lavoro = 1 mg/mL in acqua |
| Countess 3 Contatore di cellule automatizzato | Invitrogen | A50298 | Apparecchiature; Contatore di cellule |
| Provette criogeniche | Thermo Scientific | 50001012 | Plasticware |
| Dharmacon CRISPR Design Tool | Horizon Discovery Ltd. | NA | Freeware; sito web: horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer |
| DharmaFECT siRNA Transfection Reagent #2 | Dharmacon, Inc. | T-2002-02 | Reagente di trasfezione; Linee cellulari LNCaP e PC3-ML |
| Dimetil solfossido (DMSO) | Fisher | BP231100 | Reagente per colture Tisuue |
| DMEM Medium con L-Glutammina, 4,5 g/L di glucosio e Piruvato di sodio | Corning | MT10013CV | Reagente per colture Tisuue; Terreni per cellule PC3-ML |
| Doxiciclina cloridrato, soluzione pronta | Sigma-Aldrich | D3072-1ML | reagente CRISPR; Sostanze chimiche, Stock di lavoro = 1 mg/mL di stock in acqua |
| DPBS, senza calcio, senza magnesio | Gibco | 14190144 | Reagente di coltura Tisuue |
| Edit-R CRISPR-Cas9 TracrRNA sintetico, 20 nmol, progettato | Dharmacon, Inc. | U-002005-20 | Reagente CRISPR; Oligonucleotidi Universal tracrRNA |
| Edit-R Modified Synthetic crRNA, desalino/deprotetto, 2 nmol | Dharmacon, Inc. | reagente crRNA-460XXX | CRISPR; Progettato crRNA oligonucleotidi |
| EditR Lentivirale inducibile hEF1aBlastCas9 particelle nucleasi, 50 μ L, 107 TU/mL | Dharmacon, Inc. | VCAS11227 | reagente CRISPR; Lenti-iCas9; Sistema vettoriale lentivirale inducibile dalla doxiciclina Streptococcus pyogenes Cas9 |
| Ensembl genomic viewer | Ensembl | NA | Freeware; sito web: [ensembl.org] Utilizzo: Browser genomico per identificare un sequenziamento nucleotidico contenente il cluster miRNA e le sequenze gene/regolatorie circostanti. |
| Anticorpo GAPDH (FL-335), policlonale di coniglio | Santa Cruz Biotechnology | sc25778 | Reagente Western blot; 37 kDa; diluizione 1:500 |
| Kit di estrazione di frammenti di DNA su gel/PCR | IBI Scientific | IB47010 | Reagente per elettroforesi su gel di acido nucleico |
| Gibco Fetale Siero bovino, certificato | Gibco | 16000044 | Reagente per colture Tisuue |
| Bromuro di esadimetrina | MilliporeSigma | H9268 | Reagente CRISPR; Chimico, Stock di lavoro = 0,8 mg/mL |
| Immobilon-FL PVDF Membrana | MilliporeSigma | IPFL10100 | Reagente Western blot; |
| tampone bloccante nitrocellulosa Intercept (TBS) | LI-COR | 927-60001 | Reagente Western blot |
| IRDye 680RD Anticorpo secondario IgG anti-topo di capra | LI-COR | 926-68070 | Reagente Western blot |
| IRDye 800CW Anticorpo secondario IgG anti-coniglio di capra | LI-COR | 926-32211 | Reagente Western blot |
| Microcentrifuga | Eppendorf | 5425 R | Plasticware |
| miRBase microRNA viewer | miRBase | NA | Freeware; sito web: [mirbase.org] Uso: Borowser elenca tutte le forcine di miRNA annotate, le sequenze di miRNA mature e la mappatura dei miRNA raggruppati associati entro 10 kb. |
| NuPAGE da 4 a 12%, Bis-Tris, 1,0 mm, Mini Protein Gel, reagente | Invitrogen | NP0321BOX | Western blot |
| Sistema di imaging Odyssey CLx | LI-COR | CLx | ; Western blot imaging |
| Opti-MEM Siero ridotto Medium | Gibco | 31985062 | Reagente di trasfezione |
| Owl D2 Wide-Gel Electrophoresis | Owl | D2-BP | Equipment; Sistema di elettroforesi su gel di acidi nucleici |
| Primer PCR, progettati (oligonucleotidi di DNA a filamento singolo) | Tecnologia del DNA integrata | Reagente NA | PCR, genotipizzazione |
| Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltà (2 U/µ L) | PCR Thermo Scientific | F530S | , tampone |
| di lisi RIPA per genotipizzazione 10x | MilliporeReagente Western | blot | 20-188 |
| Soluzione di proteinasi K (20 mg/mL), reagente RNA grade | Invitrogen | 25530049 | PCR, genotipizzazione |
| RNasi A, DNasi e proteasi (10 mg/mL) | Thermo Scientific | EN0531 | , genotipizzazione |
| RPMI 1640 Medium | reagente di coltura Gibco | MT10041CV | Tisuue; Media per cellule LNCaP |
| SnapGene Viewer | Snap Gene | NA | Freeware; sito web: [snapgene.com] Utilizzo: programma software di annotazione della sequenza del DNA per creare un file di DNA per la progettazione di gRNA e che evidenzia il locus del cluster di miRNA (intergenico, intronico), ogni singola sequenza di forcina di miRNA appartenente al cluster di miRNA e altri geni codificanti e non codificanti nelle vicinanze e/o caratteristiche regolatorie |
| TrypLE Select Enzyme (1x), nessun | Gibco | 12563029 | Tisuue rosso fenolo; Tripsina ricombinante |
| Agarosio ultrapuro | Invitrogen | 16500100 | Reagente per elettroforesi su gel di acido nucleico |
| Veriti Termociclatore rapido a 96 pozzetti | ThermoFisher Scientific | 4375305 | |
| Apparecchiature XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis | Invitrogen | EI0001 | ; Sistema di elettroforesi su gel di proteine |
Riferimenti
- Hasegawa, T., Lewis, H., Esquela-Kerscher, A. Translating MicroRNAs to the Clinic. Laurence, J. , Academic Press. 329-369 (2017).
- Lewis, H., Esquela-Kerscher, A. Systems Biology of Cancer. Thiagalingam, S. , Cambridge University Press. Ch. 9 134-153 (2015).
- Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J.
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Ristampe e permessi
