Purificazione e identificazione di proteine specifiche per tipo cellulare da tessuti complessi utilizzando una linea murina di topo di metionina tRNA sintetasi mutante

Summary

Questo protocollo descrive come eseguire la marcatura proteica specifica del tipo di cellula con azidonorleucina (ANL) utilizzando una linea murina che esprime una sintetasi tRNA mutante L274G-Metionina (MetRS*) e i passaggi necessari per l'isolamento delle proteine marcate specifiche del tipo di cellula. Descriviamo due possibili vie di somministrazione di ANL in topi vivi mediante (1) acqua potabile e (2) iniezioni intraperitoneali.

Abstract

Comprendere l'omeostasi proteica in vivo è la chiave per sapere come funzionano le cellule sia in condizioni fisiologiche che di malattia. Il presente protocollo descrive la marcatura in vivo e la successiva purificazione di proteine di nuova sintesi utilizzando una linea di topi ingegnerizzata per indirizzare l'etichettatura delle proteine a specifiche popolazioni cellulari. È una linea inducibile dall'espressione di Cre ricombinasi della L274G-Metionina tRNA sintetasi (MetRS*), che consente l'incorporazione dell'azidonorleucina (ANL) nelle proteine, che altrimenti non si verificherebbe. Utilizzando il metodo qui descritto, è possibile purificare proteomi specifici del tipo di cellula marcati in vivo e rilevare sottili cambiamenti nel contenuto proteico dovuti alla riduzione della complessità del campione.

Introduction

L'omeostasi delle proteine aberranti è causata da uno squilibrio nella sintesi e nella degradazione delle proteine. Diverse malattie sono correlate ad alterazioni nell'omeostasi proteica. Il segno distintivo di alcune malattie è la presenza di aggregati in diverse posizioni subcellulari e aree cerebrali. L'omeostasi proteica non è importante solo nella malattia, ma svolge anche un ruolo cruciale nella normale funzione degli organi e delle cellule¹. Ad esempio, la sintesi proteica è necessaria per molte forme di plasticità neuronale^2,3, come determinato dall'uso di inibitori chimici che ....

Protocol

Tutti gli esperimenti con gli animali sono stati eseguiti con il permesso degli uffici governativi locali in Germania (RP Darmstadt; protocolli: V54-19c20/15-F122/14, V54-19c20/15-F126/1012) o Spagna (Comitato di esperimenti sugli animali presso l'UCM e consulenza ambientale della Comunidad de Madrid, numero di protocollo: PROEX 005.0/21) e sono conformi alle regole della Max Planck Society e ai regolamenti spagnoli e seguono le linee guida dell'UE per il benessere degli animali.

1. Marcatura metabolica in vivo con ANL

1. Acqua potabile:
   1. Sciogliere ANL e maltosio nella normale acqua potabile dei topi.....

Results

Seguendo il protocollo descritto (riassunto nella Figura 1), l'ANL è stato somministrato ai topi mediante iniezioni intraperitoneali giornaliere (400 mM ANL 10 mL/kg, Nex-Cre::MetRS*) per 7 giorni, o tramite acqua potabile (0,7% Maltosio, 1% ANL, CamkII-Cre::MetRS*) per 21 giorni. Dopo l'etichettatura, le aree cerebrali corrispondenti sono state sezionate, lisate, alchilate e cliccate. Le reazioni di clic sono state analizzate da SDS-PAGE e Western Immunoblot. Le im.......

Discussion

Gli aspetti critici del protocollo sono; l'inclusione di controlli negativi, avere abbastanza repliche biologiche, via di somministrazione di ANL, quantità e durata, alchilazione dei campioni, concentrazione di alchine ed eliminazione del β-mercaptoetanolo quando si utilizza DST-alchini.

È fondamentale includere campioni di controllo negativi provenienti da animali marcati con ANL senza driver Cre e quindi senza espressione MetRS*. Questi campioni devono essere sottoposti a ogni fase descritta.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
12% Gel di acrilammide	GenScript	SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12%
β-Mercaptoetanolo	Sigma	M6250	Tossico; utilizzare un camice da laboratorio, guanti e una cappa aspirante.
Bicarbonato di ammonio	Sigma	9830	Tossico; utilizzare un camice da laboratorio, guanti e una cappa aspirante
ANL			Sintetizzato come descritto in precedenza per AHA (vedi riferimenti 5 e 11)
ANL-HCl	IrishBotech	HAA1625.0500
Benzonasi	Sigma	E1014
Biotina alchino	Thermo,B10185
Anticorpo di pollo anti-GFP	Aves	1020
Inibitore completo della proteasi senza EDTA	Roche	4693132001	Toxic; utilizzare un camice da laboratorio e guanti.
Bromuro di rame (I)	Sigma	254185	99,999% (wt/wt)
Etichetta disolfuro (DST)-alchino			Sintetizzato come riportato nel numero di riferimento 15, in cui è indicato come sonda 20
DMSO	Sigma	276855
Filtri	Merk	SCGP00525
Iodo acetamide (IAA)	Sigma	I1149
IR anti pollo 800	LI-COR	IRDye 800CW	Asino anti-Pollo Anticorpo Secondario
IR anti rabit 680	LI-COR	IRDye 680RD	Capra anti-Coniglio IgG Anticorpo Secondario
Maltosio	Sigma	M9171
Miscelatore Manuale	BioSpec Prodotti	1083
NaCl		Sigma S9888
N-etilmaleimmide	Sigma	4259	Tossico; Utilizzare un camice da laboratorio, guanti e una cappa aspirante.
Perle di NeutrAvidin	Pierce	29200
Membrana in nitrocellulosa	Bio-rad	1620112
PBS 1X	Thermo	J62036.K2
PBS 1X pH 7.8			Preparazione descritta nel numero di riferimento 5
colonne PD SpinTrap G-25	GE Healthcare		Scambio di tamponi
Pierce Kit di dosaggio delle proteine BCA	Thermo,	23225	I reagenti nel kit di analisi delle proteine Pierce BCA sono tossici per la vita acquatica.
Anticorpo anti-biotina policlonale di coniglio	Segnalazione cellulare	5597
Membrana PVDF	Millipore	IPVH00010
SDS 10%	Sigma	71736
SDS-PAGE  Tampone in esecuzione MOPS	GenScript	M00138
SYPRO Colorazione rubino	Sigma	S4942
Tavolo automatico Vortexer	Eppendorf	Mixmate
Triazole ligando	Sigma	678937
Triton X-100	Sigma	T9284
Acqua	Sigma	W4502	Grado di biologia molecolare