Identificazione di frammenti di RNA risultanti dalla degradazione enzimatica mediante spettrometria di massa MALDI-TOF

Shawn W. Schowe; Conner J. Langeberg; Erich G. Chapman; Kitty Brown; Marino  J. E. Resendiz

doi:10.3791/63720

È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Identificazione di frammenti di RNA risultanti dalla degradazione enzimatica mediante spettrometria di massa MALDI-TOF

3.1K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/63720

⸱

11 aprile 2022

Shawn W. Schowe¹ , Conner J. Langeberg² , Erich G. Chapman² , Kitty Brown³ , Marino J. E. Resendiz¹

¹Department of Chemistry, University of Colorado, Denver, ²Department of Chemistry & Biochemistry, University of Denver, ³Analytical Resources Core Bioanalysis & Omics, Colorado State University

In questo articolo

Sommario

MALDI-TOF è stato utilizzato per caratterizzare frammenti ottenuti dalla reattività tra RNA ossidato ed esoribonucleasi Xrn-1. Il presente protocollo descrive una metodologia che può essere applicata ad altri processi che coinvolgono RNA e/o DNA.

Abstract

L'RNA è un biopolimero presente in tutti i domini della vita e le sue interazioni con altre molecole e / o specie reattive, ad esempio DNA, proteine, ioni, farmaci e radicali liberi, sono onnipresenti. Di conseguenza, l'RNA subisce varie reazioni che includono la sua scissione, degradazione o modifica, portando a specie biologicamente rilevanti con funzioni e implicazioni distinte. Un esempio è l'ossidazione della guanina a 7,8-diidro-8-ossoguanina (8-oxoG), che può verificarsi in presenza di specie reattive dell'ossigeno (ROS). Nel complesso, le procedure che caratterizzano tali prodotti e trasformazioni sono in gran parte preziose per la comunità scientifica. A tal fine, la spettrometria di massa a ionizzazione a desorbimento laser assistita da matrice (MALDI-TOF) è un metodo ampiamente utilizzato. Il presente protocollo descrive come caratterizzare i frammenti di RNA formatisi dopo il trattamento enzimatico. Il modello scelto utilizza una reazione tra l'RNA e l'esoribonucleasi Xrn-1, in cui la digestione enzimatica viene interrotta in siti ossidati. Due sequenze di RNA lungo 20 nucleotidi [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] e [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] sono state ottenute tramite sintesi in fase solida, quantificate mediante spettroscopia UV-vis e caratterizzate tramite MALDI-TOF. I fili ottenuti sono stati poi (1) fosforilati 5' e caratterizzati tramite MALDI-TOF; (2) trattati con Xrn-1; (3) filtrati e dissalati; (4) analizzato tramite MALDI-TOF. Questa configurazione sperimentale ha portato all'identificazione inequivocabile dei frammenti associati allo stallo di Xrn-1: [5'-H₂PO₄-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H₂PO₄-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] e [5'-H₂PO₄-(8-oxoG) CUA AAA GU]. Gli esperimenti descritti sono stati condotti con 200 picomoli di RNA (20 pmol utilizzati per le analisi MALDI); tuttavia, quantità inferiori possono comportare picchi rilevabili con spettrometri che utilizzano sorgenti laser con più potenza di quella utilizzata in questo lavoro. È importante sottolineare che la metodologia descritta può essere generalizzata e potenzialmente estesa all'identificazione del prodotto per altri processi che coinvolgono RNA e DNA e può aiutare nella caratterizzazione / delucidazione di altri percorsi biochimici.

Introduzione

MALDI-TOF ^1,2,3 è una tecnica ampiamente utilizzata per la caratterizzazione e/o la rilevazione di molecole di varie dimensioni e caratteristiche. Alcuni dei suoi usi includono diverse applicazioni come il rilevamento di tannini dalle risorse naturali⁴, l'imaging di metaboliti negli alimenti⁵, la scoperta o il monitoraggio di bersagli o marcatori di farmaci cellulari⁶ e la diagnostica clinica⁷, per citarne alcuni. Di rilevanza per il presente lavoro è l'uso di MALDI-TOF con DNA o R....