Utilizzo della bassa tensione di ossigeno per ridurre le cellule ematopoietiche nelle colture di cellule stromali del midollo osseo murino

Sommario

Una coltura di routine di cellule stromali del midollo osseo (BMSC) porta all'isolamento di popolazioni cellulari eterogenee, molte delle quali di origine ematopoietica. Qui, descriviamo un metodo che utilizza una bassa tensione di ossigeno per ridurre notevolmente i contaminanti ematopoietici nelle colture BMSC murine.

Abstract

Attualmente, rimane una mancanza di marcatori universalmente accettati per isolare in modo prospettico una popolazione omogenea di cellule staminali scheletriche (SSC). Per questo motivo, le BMSC, che supportano l'emopoiesi e contribuiscono a tutte le funzioni dello scheletro, continuano ad essere ampiamente utilizzate per studiare i progenitori mesenchimali multipotenti (MMP) e per dedurre la funzione delle SSC. Inoltre, data l'ampiezza dei modelli murini transgenici utilizzati per studiare le malattie muscoloscheletriche, l'uso delle BMSC funge anche da potente strumento per esaminare i meccanismi molecolari che regolano le MMP e le SSC. Tuttavia, le comuni procedure di isolamento per le BMSC murine fanno sì che oltre il 50% delle cellule recuperate siano di origine ematopoietica, ostacolando potenzialmente l'interpretazione dei dati generati durante questi studi. Qui, descriviamo un metodo che utilizza una bassa tensione di ossigeno o ipossia per l'eliminazione selettiva di cellule CD45⁺ in colture BMSC. È importante sottolineare che questo metodo può essere facilmente implementato non solo per ridurre i contaminanti emopoietici, ma anche per aumentare la percentuale di MMP e SSC putativi nelle colture BMSC.

Introduzione

Simili alle cellule staminali ematopoietiche (HSC), le SSC sono alloggiate all'interno del microambiente osseo; tuttavia, a differenza delle HSC, attualmente mancano marcatori di superficie cellulare universalmente accettati che possano essere utilizzati per identificare in modo prospettico le SSC ^1,2,3. Tuttavia, i sistemi di coltura in vitro e i saggi di ricostituzione in vivo dimostrano che una percentuale di BMSC ha la capacità di supportare l'emopoiesi, nonché la capacità di differenziarsi in tutte le cellule delle linee mesenchimali ^4,5. Pertanto, mentre le BMSC rappresentano una popolazione altamente eterogenea, una percentuale di queste cellule ha le caratteristiche delle cellule staminali autentiche, definite dalla loro capacità di auto-rinnovarsi e ricostituire tutte le cellule del loro tessuto di origine. Inoltre, a differenza dell'uso di marcatori di superficie cellulare, le BMSC possono essere rapidamente isolate in base alla loro rapida aderenza alla plastica per colture tissutali ^6,7. Per questi motivi, le BMSC sono spesso utilizzate come surrogato delle SSC⁵.

Mentre l'aderenza preferenziale alla plastica per colture tissutali (TC) è stata utilizzata per isolare con successo le BMSC dal tessuto umano, i modelli murini presentano ulteriori sfide per questo metodo. In particolare, poiché le cellule ematopoietiche murine hanno la capacità di aderire sia alla plastica TC che alle BMSC, in questo sistema modello si verifica un'elevata contaminazione ematopoietica, ostacolando così l'interpretazione dei dati generati utilizzando questo metodo di isolamento⁶.

In particolare, le BMSC risiedono nel microambiente osseo dove le tensioni di ossigeno variano dall'1% al 4%⁸. Tuttavia, in condizioni standard di coltura tissutale, gli incubatori per colture cellulari vengono mantenuti a livelli di ossigeno atmosferico del 21%, che rappresentano livelli sovrafisiologici. Evidenziando il significato funzionale di queste differenze, la coltura di cellule di origine mesenchimale al 21% di ossigeno è associata ad un aumento della morte cellulare ^9,10. Inoltre, abbiamo recentemente dimostrato che le cellule ematologiche e le cellule mesenchimali rispondono in modo differenziale a basse tensioni di ossigeno. In particolare, si verifica una sostanziale diminuzione del numero di cellule ematopoietiche CD45⁺ quando le colture di BMSC vengono mantenute a basse tensioni di ossigeno. Infatti, abbiamo notato una riduzione del 90% delle cellule ematopoietiche CD45⁺ utilizzando questa tecnica¹¹.

Qui, condividiamo un protocollo che può essere facilmente implementato per i laboratori per ridurre significativamente la contaminazione ematopoietica e per migliorare la purezza delle cellule mesenchimali durante la coltura di routine di BMSC.

Protocollo

Tutti i metodi descritti utilizzando modelli murini sono stati eseguiti in conformità con i protocolli approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC) (A187-19-08).

1. Dissezione delle ossa degli arti posteriori

1. Eutanasia di topi maschi o femmine di C57BL/6 di 10-12 settimane mediante asfissia da CO₂ utilizzando una portata di 2-4 L/min seguita dalla conferma della morte per decapitazione. In questo test possono essere utilizzati sia topi femmina che maschi senza differenze attese nei risultati. Spruzzare il pelo con il 70% di etanolo.
2. Usa pinze chirurgiche sterili e forbici per praticare una piccola incisione nella pelle sotto lo sterno. Usa le mani per strappare la pelle attorno alla circonferenza del corpo e poi tira la pelle distalmente verso gli arti posteriori per esporre il tessuto sottostante.
3. Utilizzare pinze e forbici chirurgiche sterilizzate per rimuovere delicatamente l'arto posteriore separando la testa del femore (sfera) dall'acetabolo (presa) del bacino (anca). Usa una pinza sterile e un bisturi per raschiare delicatamente lungo le ossa per rimuovere quanto più tessuto molle possibile.
4. Utilizzare un bisturi sterile per separare il femore e la tibia usando una resistenza minima per tagliare i legamenti (collaterale laterale e mediale, crociato anteriore e posteriore e tendine rotuleo [legamento]) che collegano le due ossa. È importante sottolineare che, dopo la separazione, mantenere intatti i condili sia sul femore distale che sulla tibia prossimale.
5. Per i femori distali, praticare un taglio tra la testa del femore e il terzo trocantere e un taglio all'epifisi prossimale alla cartilagine di accrescimento, riducendo al minimo i danni alla cartilagine di accrescimento.
6. Per le tibie prossimali, fare un taglio prossimale al malleolo laterale e un taglio distale del piatto tibiale appena prossimale alla cartilagine di crescita.
7. Posizionare i femori e le tibie con il lato tagliato verso il basso in provette da microcentrifuga da 1,5 mL.

2. Isolamento di BMSC da femori e tibie

1. Inserire provette per microcentrifuga da 1,5 mL in una centrifuga da banco e centrifugare a 10.000 x g a 4 °C per 1 s.
2. Utilizzare una pinzetta sterile per rimuovere con cura le ossa dalle provette della microcentrifuga, lasciando un tappo rosso di midollo osseo sul fondo della provetta della microcentrifuga. Se rimane del midollo nell'asta dell'osso, trasferire l'osso in un nuovo tubo, ripetere la rotazione rapida e combinare i pellet in un tubo durante la fase di risospensione 2.3.
3. Utilizzare una pipetta P1000 per risospendere delicatamente il pellet di midollo in 500 μL di terreno di crescita, MEMa integrato con il 20% di siero fetale bovino e 1.000 U/ml di penicillina-streptomicina. Trasferire le cellule stromali del midollo osseo in una provetta conica da 15 mL contenente 4,5 mL di terreno di coltura.

3. Lisi dei globuli rossi

1. Centrifugare le celle a 300 x g a 4 °C per 5 minuti. Aspirare il terreno di coltura e risospendere delicatamente il pellet in 1,5 mL di tampone di lisi dei globuli rossi.
2. Incubare a temperatura ambiente per 75-90 s. Spegnere immediatamente con 10 mL di terreno di coltura.
3. Centrifugare le celle a 300 x g a 4 °C per 5 minuti. Aspirare il terreno e risospendere il pellet in 10 mL di terreno di coltura per il conteggio (vedere la fase 4).
   NOTA: Il pellet cellulare non dovrebbe più essere rosso ma bianco, indicando che la lisi dei globuli rossi è riuscita. Se il pellet è ancora rosso, è possibile eseguire un ulteriore ciclo di tampone di lisi dei globuli rossi.

4. Placcatura dei BMSC

1. Per contare le cellule vive per la piastratura, rimuovere 10 μl di sospensione cellulare e aggiungere a 10 μl di soluzione di Trypan Blue.
2. Porre 10 μL di soluzione cell:Trypan Blue su un emocitometro e contare le cellule vitali (non blu). La maggior parte delle celle dovrebbe escludere il blu di tripano.
3. Per i saggi di colonia, piastrate le cellule a una densità di 60.000 cellule/^cm2 in fiasche di coltura tissutale T-25 cm² . Per le colture BMSC ad alta densità, piastre di cellule a una densità di 130.000 cellule/cm² in piastre di coltura tissutale da 100 mm² . Utilizzare un volume totale di 5 ml^{per 2} fiasche T-25 cm e un volume totale di 10 ml^{per 2 piastre} da 100 cm.
4. Incubare le cellule per 3 ore all'1%-2% (ipossia) o al 21% di ossigeno (normossia) e al 5% di CO₂. Per la coltura di routine di BMSC a basse tensioni di ossigeno, è possibile utilizzare un incubatore cellulare ipossico o una camera per ipossia. Impostare ogni strumento secondo le istruzioni del produttore in modo che il flusso di gas di azoto e anidride carbonica risulti nell'intervallo desiderato di ossigeno e CO₂.
5. Dopo 3 ore, sciacquare accuratamente le piastre 3 volte con 1 PBS. Per evitare di disgregare le cellule che hanno iniziato ad attaccarsi, sciacquare delicatamente aspirando lentamente e pipettando sul lato delle piastre di coltura tissutale.
6. Dopo l'ultimo risciacquo con 1 PBS, sostituire il PBS con 10 ml di terreno di coltura se si utilizzano piastre da 100 cm² o 5 ml di terreno di coltura se si^{utilizzano fiasche} T-25 cm. Dopo il risciacquo, la maggior parte delle celle galleggianti deve essere rimossa.

5. Mantenimento delle BMSC in condizioni di ipossia

1. Per le colture ipossiche, mantenere le cellule in una camera di ipossia o in un'incubatrice impostata su 1%-2% O₂ e 5% CO₂. Per le colture normossiche, mantenere le cellule al 21% di O₂ e al 5% di CO_2. Se si utilizza un'incubatrice ipossica, assicurarsi che le porte siano aperte il meno possibile per evitare afflussi di ossigeno atmosferico (21%). Cambia il supporto ogni 2-3 giorni.
2. Per i saggi sulle colonie, incubare le cellule per 7-10 giorni, dopodiché enumerare le colonie o iniziare la differenziazione o altri saggi desiderati. In condizioni di ipossia, si possono prevedere tra 50-120 colonie, mentre in condizioni normossiche, si possono prevedere tra 5-30 colonie.
3. Per le colture BMSC ad alta densità, incubare le cellule fino a renderle confluenti, circa 7-10 giorni per le colture ipossiche e circa 14-21 giorni per le colture normossiche. Una volta confluenti, tripsinizzare le cellule con tripsina allo 0,25% per l'uso nei saggi desiderati.
4. Per visualizzare le cellule, posizionare il piatto di coltura tissutale su un tavolino, ruotare l'obiettivo di fase nel percorso ottico e assicurarsi che il cursore del contrasto di fase sia selezionato per l'obiettivo corrispondente. Visualizza le celle con un ingrandimento di 100x o 200x.

Risultati

Dopo 7 giorni di isolamento cellulare, le cellule coltivate al 21% di ossigeno sono altamente eterogenee. In particolare, c'è una grande variazione di dimensioni, con celle bipolari più grandi intervallate da celle più piccole contenenti più sporgenze (Figura 1A). Al contrario, le cellule cresciute in condizioni di ipossia sono altamente omogenee. Le cellule all'interno delle colonie sono di dimensioni relativamente simili e hanno un aspetto bipolare, simile ad altre cellule di origine mesen...

Discussione

Sulla base delle nostre osservazioni, le BMSC aderiscono alla plastica di coltura tissutale prima dei macrofagi e di altre cellule di origine emopoietica¹¹. Per questo motivo, il risciacquo delle piastre 3 ore dopo la placcatura è una fase fondamentale in quanto rimuove le cellule ematopoietiche fluttuanti che hanno il potenziale per attaccare punti temporali successivi. Inoltre, questi risciacqui devono essere eseguiti con cura, in particolare pipettando i terren...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastre per coltura tissutale da 100 mm2	Corning	353003
1x soluzione salina potenziata con fosfato (PBS)	Emocitometro Gibco	100010-023
Bright-Line	Sigma-Aldrich	Z359629
C57BL/6J	The Jackson Laboratory	664
HyClone Fetal Bovine Serum (U.S.), caratterizzato	da GE Healthcare Life Scienze	SH30071.03
InvivO2 400	Baker Ruskinn	https://bakerco.com
MEMα, nucleosidi	Gibco	12571-063
Penicillina-streptomicina (10.000 U/mL)	Gibco	15140-122
Tampone per lisi di globuli rossi Hybri-Max	Sigma-Aldrich	R7757
T-25cm2  fiasche per coltura tissutale	Corning	430168
Trypan Blue Solution	Sigma-Aldrich	T8154
Tripsina-EDTA (0,25%), rosso fenolo	Gibco	25200-056