Questo protocollo descrive un test comparativo, utilizzando attività complesse mitocondriali CI+CIII e CII+CIII in presenza o assenza di Na+, per studiare l'esistenza di pool di CoQ funzionali parzialmente segmentati.
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Articolo metodologico
La sensibilità della membrana mitocondriale interna a Na+ rivela pool di CoQ funzionali parzialmente segmentati
In questo articolo
Sommario
Abstract
I pool di ubichinone (CoQ) nella membrana mitocondriale interna (IMM) sono parzialmente segmentati in enzimi del complesso I o FAD-dipendenti. Tale suddivisione può essere facilmente valutata mediante un saggio comparativo che utilizza NADH o succinato come donatori di elettroni nei mitocondri congelati-scongelati, in cui viene misurata la riduzione del citocromo c (cyt c). Il test si basa sull'effetto di Na+ sull'IMM, diminuendone la fluidità. Qui presentiamo un protocollo per misurare l'attività della NADH-cyt c ossidoreduttasi e le attività della succinato-cyt c ossidoreduttasi in presenza di NaCl o KCl. Le reazioni, che si basano sulla miscela di reagenti in una cuvetta in modo graduale, vengono misurate spettrofotometricamente durante 4 minuti in presenza di Na+ o K+. La stessa miscela viene eseguita in parallelo in presenza degli specifici inibitori enzimatici al fine di sottrarre la variazione aspecifica dell'assorbanza. L'attività della NADH-cyt c ossidoreduttasi non diminuisce in presenza di nessuno di questi cationi. Tuttavia, l'attività della succinato-cit c ossidoreduttasi diminuisce in presenza di NaCl. Questo semplice esperimento evidenzia: 1) l'effetto di Na+ nel diminuire la fluidità IMM e il trasferimento di CoQ; 2) che il supercomplesso I+III2 protegge il trasferimento di ubichinone (CoQ) dall'essere influenzato dall'abbassamento della fluidità IMM; 3) che il trasferimento di CoQ tra CI e CIII è funzionalmente diverso dal trasferimento di CoQ tra CII e CIII. Questi fatti supportano l'esistenza di pool di CoQ funzionalmente differenziati nell'IMM e mostrano che possono essere regolati dal mutevole ambiente Na+ dei mitocondri.
Introduzione
Il sistema di fosforilazione ossidativa mitocondriale (OXPHOS) è la principale via che guida la sintesi dell'adenosina trifosfato (ATP), la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e il consumo di equivalenti riducenti, come nicotinamide adenina dinucleotide (NADH) o succinato, da parte dei mitocondri. Il sistema OXPHOS è composto da cinque complessi proteici: il Complesso I (CI) ossida il NADH e riduce il CoQ in ubichinolo (CoQH2). Il Complesso II (CII) ossida il succinato in fumarato e riduce il CoQ in CoQH2. Il Complesso III (CIII) ossida nuovamente il CoQH2 in CoQ, riducendo il citocromo c (cyt c). Infine, il complesso IV ....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti seguendo la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e sono stati approvati dal comitato etico istituzionale del Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC), Spagna, in conformità con la direttiva dell'Unione europea del 22 settembre 2010 (2010/63 / UE) e con il regio decreto spagnolo del 1 ° febbraio 2013 (53/2013). Tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo il numero di animali utilizzati e la loro sofferenza.
NOTA: Questo test comparativo per studiare la segmentazione dei pool di CoQ mitocondriale è descritto come segue:
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Risultati
I risultati tipici di questo protocollo sono rappresentati di seguito (Figura 3). Poiché l'assorbanza cyt c ridotta si trova a 550 nm, tutti i sottocampioni disinibiti devono mostrare un aumento dell'assorbanza a 550 nm. I sottocampioni inibiti mostrano idealmente una pendenza piatta o leggermente crescente (Figura 3). Le pendenze dei sottocampioni inibiti devono essere sottratte dai sottocampioni disinibiti.
I campioni A e B, entramb.......
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Discussione
Sebbene questo protocollo rappresenti una procedura molto semplice per identificare l'esistenza dei pool di CoQ parzialmente segmentati, ci sono alcuni passaggi critici da prendere in considerazione. I substrati (cioè NADH o succinato) sono preferibilmente aggiunti per ultimi poiché può verificarsi l'autoossidazione di questi composti. Il capovolgimento della cuvetta deve essere attento per evitare la formazione di bolle che potrebbero interferire con la lettura.
Inoltre, la presente tecnica p.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Dr. R. Martínez-de-Mena, M. M. Muñoz-Hernandez, A., dr C. Jimenez e E. R. Martínez-Jimenez per l'assistenza tecnica. Questo studio è stato supportato da MICIN: RTI2018-099357-B-I00 e HFSP (RGP0016/2018). Il CNIC è sostenuto dall'Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), dal Ministerio de Ciencia, dall'Innovación y Universidades (MCNU) e dalla Fondazione Pro CNIC ed è un Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505). Figura 2 creata con BioRender.com.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Antimicina A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma-Aldrich | 10775835001 | |
| Bradford | Bio-Rad | 5000001 | |
| Citocromo c da cuore equino | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Acido malonico | Sigma-Aldrich | M1296 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NADH | Roche | 10107735001 | |
| Cianuro di potassio | Sigma-Aldrich | 207810 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Spectra Manager software | JASCO | versione 2 | |
| Spettrofotometro | UV/VISJASCO | ||
| Succinato | Sigma-Aldrich | 398055 |
Riferimenti
- Calvo, E., et al. Functional role of respiratory supercomplexes in mice: SCAF1 relevance and segmentation of the Qpool. Science Advances. 6 (26), (2020).
- Garcia-Poyatos, C., et al. Scaf1 promotes respiratory superc....
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Ristampe e permessi
