Articolo metodologico

Microscopia elettronica a trasmissione in situ indotta dalla luce per l'osservazione dell'interazione liquido-materia molle

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DOI:

10.3791/63742

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26 luglio 2022

 , 
1Electron Microscopy Laboratory, Faculty of Mechanical Engineering, Wroclaw University of Science and Technology, 2Advanced Materials Engineering and Modelling Group, Faculty of Chemistry, Wroclaw University of Science and Technology

In questo articolo

Sommario

Il presente protocollo descrive le modifiche al microscopio elettronico a trasmissione (TEM) con un sistema di illuminazione della luce, la fabbricazione di cellule liquide e osservazioni TEM in situ delle interazioni indotte dalla luce tra cellule batteriche e un fotosensibilizzatore. Vengono inoltre discussi i metodi di preparazione del campione, il danno al fascio di elettroni e l'imaging.

Abstract

L'attuale protocollo descrive le modifiche della configurazione del microscopio elettronico a trasmissione (TEM) per le osservazioni indotte dalla luce in situ . Una fibra ottica di vetro inserita nella colonna di elettroni sopra il polo dell'obiettivo e un laser, una sorgente luminosa regolabile, sono stati utilizzati per fabbricare il dispositivo. Dopo che l'illuminatore è stato calibrato utilizzando un sistema di misurazione esterno, consente di regolare l'intensità dell'illuminazione alle esigenze del processo osservato. Questo sistema di illuminazione è stato utilizzato per visualizzare fenomeni di terapia fotodinamica antimicrobica, attualmente oggetto di intense ricerche. Il campione è stato preparato individuando una sospensione di batteri su un substrato di carbonio, grafene o nitruro di silicio, tamponando la soluzione in eccesso, individuando la soluzione fotosensibilizzante, tamponando nuovamente il liquido in eccesso e quindi assemblando la cella liquida con un secondo substrato o film di grafene. Il processo dell'esperimento di imaging stesso include la scelta del posto giusto per l'osservazione con l'uso di un basso ingrandimento e una dose minima di elettroni, e quindi l'attivazione ciclica della sorgente luminosa per catturare immagini successive a intervalli specificati con la minima quantità di elettroni necessari. La dose elettronica di ciascuna esposizione e il tempo e l'intensità dell'illuminazione utilizzati devono essere accuratamente registrati a causa della complessità dei fenomeni osservati poiché, allo stesso tempo, il processo è guidato sia dalla luce che dall'elettrone. Dopo aver eseguito l'esperimento effettivo, devono essere fatte ulteriori osservazioni di controllo, in cui vengono utilizzate le stesse dosi di elettroni ma senza ulteriore influenza della luce e dosi più piccole di elettroni vengono utilizzate per dosi più elevate di luce. Ciò consente di distinguere gli effetti microstrutturali indotti dalla luce da quelli causati dagli elettroni sia nel campo della vita che nella scienza dei materiali.

Introduzione

I fenomeni indotti dalla luce in alta risoluzione sono interessanti in molti campi come la nanoingegneria 1,2,3, la catalisi 4,5 e la biofotonica 6. Alcuni disegni originali che consentono tali esperimenti possono essere trovati in letteratura, comprese le modifiche dei supporti del campione 1,4,7,8,9 e la fibra ottica attaccata al microscopio 10,11.

La combinazione di illuminazione luminosa, ambiente liquido e microscopia elettronica a trasmissione (TEM) offre una grande opportunità per studi dettagliati e dinamici dei processi fotoindotti. Tuttavia, la condizione di alto vuoto all'interno del microscopio è piuttosto sfavorevole per molti liquidi, in particolare le soluzioni acquose. L'incapsulamento liquido, che lo protegge dall'ambiente, può essere ottenuto utilizzando alcune tecniche basate principalmente su substrati di grafene 12, nitruro di silicio13 o carbonio14. Oltre alla ricerca nella scienza dei materiali2, le cosiddette cellule liquide offrono la possibilità di condurre osservazioni microscopiche non convenzionali su campioni biologici vicini alle loro condizioni native15. Tali osservazioni sono estremamente impegnative, specialmente per i microrganismi viventi come le cellule batteriche. Il fascio di elettroni come radiazione ionizzante provoca danni irreversibili ai campioni idratati, quindi la dose di elettroni deve essere specificata16. Ciò è necessario per ridurre al minimo gli effetti sfavorevoli, controllare il danno ed evitare artefatti confusi. La dose massima ottimale di elettroni che consente l'osservazione delle cellule viventi è ancora un argomento discutibile16, ma la dose di 30 e−/nm2 sembra essere il valore soglia, almeno per i batteri17.

Alcuni dei soggetti di interesse per tali studi microscopici sono i processi durante la terapia fotodinamica antimicrobica (APDT)18. In breve, la terapia procede come segue. Le cellule batteriche sono circondate dal liquido fotosensibile chiamato fotosensibilizzatore. Quando l'illuminazione della luce viene fornita a una lunghezza d'onda specifica, le specie citotossiche reattive dell'ossigeno (ROS) vengono generate dal trasferimento di energia o carica dalle molecole fotosensibilizzatrici eccitate all'ossigeno naturalmente presente nella soluzione. Gli agenti patogeni esposti ai ROS vengono rapidamente inattivati con un'efficienza molto elevata, senza effetti collaterali19. La risposta alla terapia varia per microbi distinti - ad esempio, l'impatto dello stesso fotosensibilizzatore può essere molto diverso per i batteri Gram-positivi e Gram-negativi20. In generale, è stato stabilito che il bersaglio principale dei ROS sono le strutture esterne delle cellule, dove il danno provoca disturbi funzionali della membrana cellulare e, di conseguenza, porta alla morte dei batteri21,22. Tuttavia, anche il danno agli acidi nucleici e alle proteine può essere considerato una causa di inattivazione18, quindi non è ancora noto quali strutture cellulari siano i principali bersagli durante questo processo19. Una comprensione più profonda dei processi dannosi potrebbe aiutare a migliorare questa terapia definitiva. Rispetto ai metodi di microscopia ottica utilizzati nella ricerca APDT23, le tecniche TEM offrono maggiori possibilità di osservare il meccanismo APDT con risoluzione e ingrandimento più elevati24. TEM è già stato utilizzato con successo per l'osservazione cellulare durante la terapia in corso, che ci ha permesso di studiare il danno batterico Gram-positivo e descrivere i cambiamenti che si verificano all'interno della parete cellulare in dettaglio 6,25.

L'attuale protocollo presenta una configurazione sperimentale adatta per l'imaging ad alta risoluzione dell'inattivazione batterica indotta dalla luce utilizzando TEM, che richiede un adeguato sistema di illuminazione della luce, l'incapsulamento delle cellule con un liquido e un rigoroso controllo della dose di elettroni. Il batterio utilizzato per l'osservazione era Staphylococcus aureus e una soluzione di blu di metilene è stata utilizzata come fotosensibilizzante. La speciale configurazione di illuminazione della luce comprende un laser a semiconduttore sintonizzabile collegato direttamente alla colonna del microscopio utilizzando la fibra luminosa. Questo design fornisce un'irradiazione uniforme in tutto il campione a causa del posizionamento quasi parallelo della fibra ottica all'asse del microscopio. La luce monocromatica di alta intensità generata dal laser può quindi essere utilizzata per studiare vari effetti fotochimici. La luce utilizzata nell'esperimento aveva una lunghezza d'onda pari a 660 nm perché, nella regione visibile, il blu di metilene ha picchi di assorbimento a 613 nm e 664 nm26. Il protocollo per l'incapsulamento liquido si basa su substrati di carbonio, il che rende la procedura rapida e senza complicazioni. Infine, viene presentato un metodo per l'osservazione TEM in situ a basse dosi di cellule in liquido. Vengono discusse le difficoltà relative alla preparazione del campione, agli effetti della dose di elettroni sul campione sensibile e alla ragionevole interpretazione delle immagini.

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Protocollo

1. Modifica del microscopio elettronico a trasmissione

  1. Modificare il microscopio elettronico a trasmissione collegando la fibra ottica (vedere Tabella dei materiali) alla colonna del microscopio nella parte superiore della lente dell'obiettivo. Lasciare alcuni centimetri di spazio tra la lente dell'obiettivo e la lente del condensatore, oltre a una fessura libera per gli accessori.
    NOTA: È possibile utilizzare anche un portacampioni dedicato4 o un supporto per osservazioni catodoluminescenti in configurazione inversa1 .
  2. Controllare il sistema per verificare la presenza di perdite utilizzando pompe per vuoto grezze. Se il sistema non mostra una perdita di vuoto, testare il sistema sotto un vuoto elevato.
    1. Verificare che l'azionamento del sistema per vuoto non si discosti dall'avvio standard del microscopio ventilato. In caso di problemi con l'esecuzione, il montaggio o la messa in servizio del modulo, contattare il personale di assistenza autorizzato o il produttore del dispositivo.
      NOTA: L'illuminatore correttamente realizzato e montato non oscurerà il fascio di elettroni. Se il fascio si sposta successivamente durante il funzionamento del microscopio, la fibra ottica non conduttiva non sarà sufficientemente coperta da uno schermo metallico e accumulerà una carica elettrica. In questo caso, far scorrere la fibra ottica in profondità nella giacca conduttrice.
  3. Misurare l'intensità della luce utilizzando il sensore di potenza del fotodiodo (vedere Tabella dei materiali). Se lo spazio tra i poli della lente dell'obiettivo non consente la misurazione all'interno del microscopio, misurare la geometria del campione e dell'illuminatore e riprodurre queste condizioni in una configurazione di misurazione esterna.
  4. Se il microscopio non è dotato di un sistema di misurazione della dose di elettroni, eseguire la calibrazione misurando la corrente del fascio con una coppa di Faraday (vedi Tabella dei materiali) e calcolando numericamente la densità degli elettroni che colpiscono il campione27.

2. Incapsulamento di batteri con il fotosensibilizzatore

  1. Posizionare due griglie TEM non trattate ricoperte di carbonio amorfo tra due pinzette incrociate rivolte verso l'alto verso il lato rivestito di carbonio. Tenere le griglie il più vicino possibile al bordo.
    NOTA: Per alcune combinazioni di substrato, soluzione e campione, può essere utile utilizzare lo scarico di bagliore su una o entrambe le maglie per rimuovere le impurità di fabbrica e ottenere una superficie idrofila massima28. Utilizzando l'esempio dei batteri S. aureus e della soluzione di blu di metilene, è stato determinato che i risultati migliori e più riproducibili sono stati ottenuti su nuovo carbonio non trattato su griglie di rame senza ulteriore scarico di bagliore o pulizia al plasma6.
  2. Mettere 4 μL di soluzione batterica su una delle griglie. La densità ottica del campione deve essere compresa tra 5 e 10.
    NOTA: I batteri utilizzati nello studio sono stati purificati dalla coltura e dispersi nel tampone PBS. Si raccomanda vivamente di controllare la concentrazione di batteri nel campione fresco ogni volta che lo si utilizza, ad esempio, utilizzando metodi di colorazione negativa, seguendo i protocolli stabiliti disponibili 29,30,31.
  3. Attendere 60 secondi e asciugare accuratamente il liquido con carta da filtro. Cerca di distribuire il liquido su tutta la superficie della griglia durante questo processo.
  4. Mettere 4 μL di fotosensibilizzatore sulla stessa griglia.
    NOTA: Il blu di metilene ad una concentrazione di 2 μg/ml è stato utilizzato come fotosensibilizzatore per il presente studio.
  5. Dopo 5 secondi, asciugare il liquido. Lasciare uno strato molto sottile di liquido sul substrato.
  6. Posizionare rapidamente la griglia asciutta sopra quella coperta di liquido.
  7. Spostare delicatamente la griglia superiore sul bordo della seconda e spremere i substrati ai bordi usando una pinzetta.
    NOTA: in questa fase può fuoriuscire del liquido dal campione, il che significa che non è stato scaricato abbastanza. Tuttavia, ciò non significa necessariamente che la formazione della cellula liquida non avrà successo.
  8. Ripetere attentamente la compressione.
    NOTA: È più facile eseguire questo passaggio ruotando le pinzette di 90° in modo che si trovino perpendicolarmente al tavolo e che le punte di entrambe le pinzette rimangano alla stessa altezza, non a seconda della posizione di apertura / chiusura.
  9. Lasciare la cella liquida tra le pinzette per 1 minuto.
  10. Inserire il campione nel supporto TEM subito dopo aver terminato la preparazione.
    NOTA: La tensione della piastra / anello di montaggio del supporto aiuterà i substrati ad aderire e mantenere il liquido all'interno.
    1. Se possibile, pompare il supporto del campione in una stazione di pompaggio esterna per ridurre la contaminazione del microscopio mediante evaporazione del liquido.

3. Osservazioni TEM in situ di cellule batteriche nell'effetto della dose di elettroni liquidi

  1. Inserire il campione nel microscopio.
  2. Avviare le osservazioni in modalità a basso ingrandimento per trovare un'area di osservazione adatta.
    NOTA: le aree più scure hanno maggiori probabilità di essere liquide a causa della diffusione del fascio di elettroni.
    1. Durante le osservazioni, mantenere la dose di elettroni il più bassa possibile. Espandere il tempo di esposizione (fino a 2 s per una tensione accelerata di 150 kV e un ingrandimento di 5.000x). L'ingrandimento di 5.000x per la fotocamera montata in basso (il campo visivo approssimativo è di 10 μm) è sufficiente per visualizzare batteri con un diametro di ~ 1 μm.
      NOTA: A volte, non è facile distinguere il liquido, quindi, all'inizio delle osservazioni, è utile focalizzare il fascio di elettroni dove è probabile che sia liquido. Il liquido dovrebbe muoversi su un fascio di elettroni focalizzato e appariranno le bolle. Dopo questa verifica, è necessario trovare un'altra area per ulteriori osservazioni.
  3. Trova le celle circondate da liquido all'ingrandimento appropriato con un tempo di esposizione prolungato e cattura immediatamente la prima immagine. Mantenere costante la dose di elettroni e raccogliere immagini ogni 30 s per osservare i cambiamenti.
  4. Esaminare attentamente le immagini e calcolare la dose totale di elettroni27 che corrisponde ai primi cambiamenti visibili nelle cellule.

4. Osservazioni TEM in situ di processi indotti dalla luce tra cellule batteriche e fotosensibilizzatore

  1. Prima di iniziare l'esperimento, impostare l'intensità della luce laser regolando il valore corrente. Scegliere la lunghezza d'onda appropriata in base allo spettro di assorbimento del fotosensibilizzatore. In base al grafico di calibrazione precedente (passaggio 1.4.), scegliere il valore corrente corrispondente all'intensità luminosa più bassa.
    NOTA: La lunghezza d'onda della luce utilizzata in questo studio era di 660 nm.
  2. Inserire il campione nel microscopio e trovare l'area di osservazione seguendo il punto 3.2. nella sezione precedente.
  3. Acquisire la prima immagine della cella prima di iniziare l'illuminazione del campione e utilizzare il beam blanker per spegnere il fascio di elettroni per evitare gli effetti dell'irradiazione elettronica.
  4. Accendi il laser. Inizia con un breve tempo di illuminazione (qui 30 s) poiché la luce laser ha un'intensità relativamente elevata. Dopo quel tempo, spegnere la fonte di luce.
  5. Spegnere il beam blanker e acquisire immediatamente l'immagine. Se possibile, utilizzare un algoritmo automatico per esporre il campione solo per il tempo necessario per l'acquisizione dell'immagine. Misurare attentamente il tempo di irradiazione elettronica per calcolare la dose di elettroni27 utilizzata per l'imaging.
  6. Ripetere il passaggio 4.4. e il passaggio 4.5. per ottenere il tempo di illuminazione della luce previsto.

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Risultati

La configurazione sperimentale è stata progettata per osservare i processi indotti dalla luce che si verificano in un liquido ad alta risoluzione. L'analisi competitiva delle immagini ha permesso di distinguere i danni causati dal fascio di elettroni dai cambiamenti legati alla reazione fotochimica. L'effetto del fascio di elettroni sul campione sensibile (in questo caso, le cellule incapsulate con liquido) era visibile in tutta l'area irradiata mentre gli elettroni penetravano uniformemente attraverso di essa. Naturalme...

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Discussione

L'installazione e la messa in servizio dell'illuminatore richiedono conoscenze di base e possono danneggiare il microscopio. Il modo più semplice per introdurre la luce al microscopio è collegare la fibra ottica dalla parte superiore della lente dell'obiettivo, dove di solito c'è spazio per le bobine di deflessione TEM e rilevatori aggiuntivi. Ci si può aspettare più spazio libero anche dai vecchi dispositivi top-entry, dove la stessa posizione ospita il blocco a vuoto del campione e il meccanismo di installazione del ca...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

La ricerca è stata sostenuta dalla sovvenzione Miniatura (2019/03/X/NZ3/02100, National Science Center, Polonia).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Film di carbonio su griglia di rame da 200 meshAgar ScientificAGS160Le griglie TEM standard per le osservazioni e la preparazione di celle liquide
Pinzette crossoverDumontN5Le pinzette sono necessarie per la preparazione di celle liquide
Sensore di potenza a fotodiodoThorLabsS130CIl sensore utilizzato per la misurazione dell'intensità luminosa
Fibra multimodale rivestita in poliimmideThorlabsFG400UEPDeve essere integrato nel microscopio utilizzando l'adattatore costruito in loco, secondo il microscopio elettronico a trasmissione 10.1016/j.ultramic.2021.113388
HitachiH-800Può essere sostituito con qualsiasi microscopio a ingresso laterale, disponibile per la modifica
Laser a diodi sintonizzabileCNIMRL-III-660DLa lunghezza d'onda della luce deve essere scelta in base allo spettro di assorbimento del fotosensibilizzatore

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