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Articolo metodologico

Istituzione di xenotrapianti derivati da pazienti zebrafish da cancro del pancreas per test di chemiosensibilità

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DOI:

10.3791/63744

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12 maggio 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Pisa, 2General Surgery Unit, Department of Translational Research and New Technologies in Medicine and Surgery, University of Pisa

In questo articolo

Sommario

I modelli preclinici mirano a far progredire la conoscenza della biologia del cancro e a prevedere l'efficacia del trattamento. Questo articolo descrive la generazione di xenotrapianti derivati dal paziente (zPDX) a base di zebrafish con frammenti di tessuto tumorale. Gli zPDX sono stati trattati con chemioterapia, il cui effetto terapeutico è stato valutato in termini di apoptosi cellulare del tessuto trapiantato.

Abstract

Il cancro è una delle principali cause di morte in tutto il mondo e l'incidenza di molti tipi di cancro continua ad aumentare. Sono stati fatti molti progressi in termini di screening, prevenzione e trattamento; Tuttavia, mancano ancora modelli preclinici che prevedano il profilo di chemiosensibilità dei pazienti oncologici. Per colmare questa lacuna, è stato sviluppato e convalidato un modello di xenotrapianto derivato dal paziente in vivo . Il modello era basato su embrioni di zebrafish (Danio rerio) a 2 giorni dopo la fecondazione, che sono stati utilizzati come destinatari di frammenti di xenotrapianto di tessuto tumorale prelevati dal campione chirurgico di un paziente.

Vale anche la pena notare che i campioni bioptici non sono stati digeriti o disaggregati, al fine di mantenere il microambiente tumorale, che è cruciale in termini di analisi del comportamento del tumore e della risposta alla terapia. Il protocollo descrive un metodo per stabilire xenotrapianti derivati dal paziente (zPDX) a base di zebrafish dalla resezione chirurgica primaria del tumore solido. Dopo lo screening da parte di un anatomopatologo, il campione viene sezionato utilizzando una lama di bisturi. Il tessuto necrotico, i vasi o il tessuto adiposo vengono rimossi e quindi tagliati in pezzi da 0,3 mm x 0,3 mm x 0,3 mm.

I pezzi vengono quindi etichettati in modo fluorescente e xenotrapiantati nello spazio perivitellino degli embrioni di zebrafish. Un gran numero di embrioni può essere trattato a basso costo, consentendo analisi in vivo ad alto rendimento della chemiosensibilità degli zPDX a più farmaci antitumorali. Le immagini confocali vengono acquisite di routine per rilevare e quantificare i livelli apoptotici indotti dal trattamento chemioterapico rispetto al gruppo di controllo. La procedura di xenotrapianto ha un vantaggio temporale significativo, poiché può essere completata in un solo giorno, fornendo una finestra temporale ragionevole per effettuare uno screening terapeutico per gli studi co-clinici.

Introduzione

Uno dei problemi della ricerca clinica sul cancro è che il cancro non è una singola malattia, ma una varietà di malattie diverse che possono evolvere nel tempo, richiedendo trattamenti specifici a seconda delle caratteristiche del tumore stesso e del paziente1. Di conseguenza, la sfida è quella di muoversi verso la ricerca sul cancro orientata al paziente, al fine di identificare nuove strategie personalizzate per la previsione precoce dei risultati del trattamento del cancro2. Ciò è particolarmente rilevante per l'adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC), poiché è considerato un tumore difficile da trattare, con un tasso di sopravvivenza a 5 anni dell'11%3.

La diagnosi tardiva, la rapida progressione e la mancanza di terapie efficaci rimangono i problemi clinici più urgenti del PDAC. La sfida principale è, quindi, quella di modellare il paziente e identificare i biomarcatori che possono essere applicati in clinica per selezionare la terapia più efficace in linea con la medicina personalizzata 4,5,6. Nel corso del tempo, sono stati proposti nuovi approcci per modellare le malattie tumorali: organoidi derivati dal paziente (PDO) e xenotrapianti derivati dal paziente di topo (mPDX) hanno avuto origine da una fonte di tessuto tumorale umano. Sono stati utilizzati per riprodurre la malattia per studiare la risposta e la resistenza alla terapia, nonché la recidiva della malattia 7,8,9.

Allo stesso modo, l'interesse per i modelli di xenotrapianto derivati dal paziente (zPDX) basati sul pesce zebra è aumentato, grazie alle loro caratteristiche uniche e promettenti10, rappresentando uno strumento rapido e a basso costo per la ricerca sul cancro11,12. I modelli zPDX richiedono solo una piccola dimensione del campione tumorale, il che rende fattibile lo screening ad alto rendimento della chemioterapia13. La tecnica più comune utilizzata per i modelli zPDX si basa sulla digestione completa del campione e sull'impianto delle popolazioni cellulari primarie, che riproduce parzialmente il tumore, ma presenta gli svantaggi di una mancanza di microambiente tumorale e diafonia tra cellule maligne e sane14.

Questo lavoro mostra come gli zPDX possono essere utilizzati come modello preclinico per identificare il profilo di chemiosensibilità dei pazienti con cancro del pancreas. La preziosa strategia facilita il processo di xenotrapianto, poiché non è necessaria l'espansione cellulare, consentendo l'accelerazione dello screening chemioterapico. La forza del modello è che tutti i componenti del microambiente sono mantenuti come sono nel tessuto tumorale del paziente, perché, come è noto, il comportamento del tumore dipende dalla loro interazione15,16. Ciò è molto favorevole rispetto ai metodi alternativi in letteratura, in quanto è possibile preservare l'eterogeneità del tumore e contribuire a migliorare la prevedibilità dell'esito del trattamento e della recidiva in modo paziente-specifico, consentendo così al modello zPDX di essere utilizzato in studi co-clinici. Questo manoscritto descrive i passaggi coinvolti nella realizzazione del modello zPDX, iniziando con un pezzo di resezione del tumore del paziente e trattandolo per analizzare la risposta alla chemioterapia.

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Protocollo

Il Ministero della Salute Pubblica italiano ha approvato tutti gli esperimenti sugli animali descritti, in conformità con la Direttiva 2010/63/UE sull'uso e la cura degli animali. Il Comitato Etico locale ha approvato lo studio, con numero di registrazione 70213. Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i soggetti coinvolti. Prima di iniziare, tutte le soluzioni e l'attrezzatura devono essere preparate (sezione 1) e il pesce deve essere attraversato (sezione 2).

1. Preparazione di soluzioni e attrezzature

NOTA: vedere la Tabella 1 per le soluzioni e i supporti da preparare.

  1. Supporto gel di agarosio
    1. Pesare la polvere di agarosio in un matraccio da microonde e scioglierla in un dato volume di mezzo E3 zebrafish per ottenere un gel all'1%. Riscaldare in un forno a microonde fino a quando l'agarosio si è completamente sciolto.
      NOTA: non bollire eccessivamente la soluzione.
    2. Versare l'agarosio fuso in una capsula di Petri e attendere che il gel si sia completamente solidificato.
    3. Realizzare piccoli cilindri di agarosio (~ 5 mm di altezza) utilizzando una pipetta Pasteur di plastica con la punta tagliata. Una volta preparato, conservare in una capsula di Petri a 4 °C avvolto in un foglio di alluminio.
  2. Microaghi di vetro
    1. Tirare i capillari di vetro borosilicato con un estrattore per ottenere aghi sottili (impostazioni: HEAT 990, PULL 550).
      NOTA: Da un capillare, è possibile ottenere due aghi sottili con un diametro della punta di 10 μm.

2. Incrocio del pesce e raccolta delle uova

  1. Trasferire i pesci adulti in vasche di riproduzione 3 giorni prima dell'impianto del tessuto, come descritto da Avdesh et al.17.
  2. NOTA: Si raccomanda un rapporto di 1:1 o 2:3 maschi e femmine. La densità del pesce dovrebbe essere un massimo di cinque pesci per litro d'acqua. Tenere maschi e femmine separati con una barriera durante la notte.
  3. Il giorno dopo, rimuovere la barriera e consentire al pesce di accoppiarsi.
  4. Rimuovere i pesci dalle vasche di riproduzione e riportarli alle loro vasche di alloggiamento.
  5. Versare l'acqua dalla vasca di allevamento attraverso una rete a maglie sottili. Trasferire le uova fecondate in una capsula di Petri con terreno E3 zebrafish.
  6. Controllare la capsula di Petri con uno stereomicroscopio e scartare le uova torbide. Conservare le uova fecondate in terreno fresco E3 zebrafish a 28 °C.

3. Raccolta di campioni

NOTA: pinza per autoclave e manico per bisturi.

  1. Elaborazione immediata
    1. Raccogliere il campione chirurgico di tumore in 10 ml di terreno tumorale a 4 °C (campione tumorale di diametro compreso tra 5 mm e 10 mm). Trasferire il campione a 4 °C dalla posizione desiderata per la lavorazione immediata.
  2. Conservazione durante la notte (opzionale)
    1. Raccogliere il campione chirurgico di tumore in 10 ml di terreno tumorale e conservare il campione per una notte a 4 °C.
  3. Conservazione a -80 °C (facoltativo, meno consigliato)
    1. Conservare il campione a -80 °C in un flaconcino criogenico con terreno tumorale integrato con dimetilsolfossido (DMSO) al 5%.

4. Elaborazione del campione

NOTA: Eseguire i passaggi sotto una cappa a flusso laminare per coltura di tessuto sterile.

  1. Lavare l'intero tessuto tumorale con 5 ml di terreno tumorale fresco, pipettando su e giù 10 volte usando una pipetta Pasteur di plastica. Aspirare e scartare il mezzo di lavaggio. Ripetere questo passaggio 3x.
    NOTA: Evitare l'aspirazione del tessuto tumorale in quanto potrebbe rimanere attaccato alla pipetta di plastica Pasteur.
  2. Trasferire il campione in una capsula di Petri e immergerlo in 1-2 ml di terreno tumorale fresco. Tagliare il campione di tumore in piccoli pezzi (1-2 mm3) usando una lama di bisturi e metterli in un tubo di plastica sterile da 5 ml con mezzo tumorale.
  3. Impostare il trinciatutto McIlwain su uno spessore di 100 μm. Posizionare i frammenti del campione sul tavolo di plastica circolare dell'elicottero e tritarli. Ruotare il tavolo di 90° e ripetere il taglio.
  4. Centrifugare i frammenti a 300 × g per 3 min. Quindi, aspirare con attenzione il surnatante e scartarlo.
  5. Incubare i frammenti con un tracker cellulare fluorescente, CM-DiI (concentrazione finale di 10 μg/mL nella soluzione salina tamponata fosfato di Dulbecco [DPBS]), Deep Red (concentrazione finale di 1 μL/mL in DPBS) o CellTrace (concentrazione finale di 5 μM in DPBS) per 30 minuti, ponendo il tubo a bagnomaria a 37 °C.
  6. Risospendere i frammenti mediante pipettaggio delicato su e giù ogni 10 minuti.
    NOTA: Nel caso di CellTrace, aggiungere terreno contenente almeno l'1% di proteine alla fine dell'incubazione, secondo le istruzioni del produttore.
  7. Centrifugare a 300 x g per 3 minuti ed eliminare il surnatante. Ripetere questo passaggio 3x con 1 mL di DPBS per rimuovere il colorante non incorporato.
  8. Sospendere i frammenti in 5 ml di DPBS in una capsula di Petri da 60 mm.
    NOTA: Assicurarsi che il tessuto non si asciughi.

5. Istituzione di zPDX

NOTA: Eseguire i passaggi sotto una cappa a flusso laminare per coltura di tessuto sterile.

  1. Anestetizzare gli embrioni 2 giorni dopo la fecondazione (dpf) con 0,16 mg/ml di tricaina nel terreno E3 di zebrafish.
  2. Mettere tre cilindri di agarosio (passo 1.1.3) in una capsula di Petri e posare un embrione di zebrafish su un cilindro, esponendo un lato. Rimuovere la soluzione in eccesso per mantenere l'embrione in un film sottile.
  3. Trasferire il pezzo di tessuto macchiato con una pinza sterile dalla capsula di Petri al supporto di agarosio all'1% dove giace l'embrione. Raccogliere il tessuto, metterlo sopra il tuorlo dell'embrione e quindi spingerlo nello spazio perivitellino usando il microago di vetro tirato dal calore (fase 1.2.1).
  4. Aggiungere delicatamente alcune gocce di E3 1% penicillina-streptomicina (Pen-Strep) all'embrione per riportarlo nel liquido.
  5. Ripetere i punti 5.2-5.4 per tutti gli embrioni e, infine, rimuovere i supporti di agarosio dalla capsula di Petri e incubare gli embrioni a 35 °C.
  6. Controllare gli embrioni per gli xenotrapianti corretti (colorazione positiva) 2 ore dopo l'impianto utilizzando uno stereomicroscopio fluorescente. Scartare gli embrioni con frammenti tumorali che non sono completamente all'interno dello spazio perivitellino, così come gli embrioni morti. Distribuire casualmente gli embrioni in sei piastre multi-pozzetto (massimo n = 20 embrioni/pozzetto), equamente divisi in gruppi secondo il piano sperimentale (ad esempio, controllo e FOLFOXIRI).

6. Trattamento

  1. Diluire il farmaco (ad es. 5-fluorouracile, oxaliplatino, irinotecan) in E3 1% Pen-Strep, mescolando accuratamente pipettando su e giù più volte. Come proposto da Usai et al.12, utilizzare una diluizione cinque volte del farmaco nell'acqua del pesce, rispetto alla concentrazione plasmatica equivalente (EPC).
  2. Mescolare i farmaci per preparare il cocktail (ad esempio, FOLFOXIRI).
  3. Rimuovere il supporto da ciascun pozzetto e aggiungere il cocktail di droga 2 ore dopo l'impianto.
  4. Trattare gli embrioni per 3 giorni. Rinnova il cocktail di droga ogni giorno.

7. Colorazione immunofluorescente a montaggio intero

NOTA: Prima di iniziare, porre acetone a -20 °C e preparare le soluzioni elencate nella Tabella 1.

  1. Giorno 1:
    1. Fissare le larve con 1 mL di paraformaldeide al 4% in flaconcini di vetro a 4 °C durante la notte.
  2. Giorno 2:
    1. Lavare le larve 3 x 5 min con 1 mL di PBS, agitando delicatamente su un bilanciere da laboratorio (400 rpm).
    2. Conservare in 1 mL di metanolo al 100% a -20 °C durante la notte (o per la conservazione a lungo termine).
    3. Reidratare 3 x 10 minuti con 1 mL di PTw (0,1% di interpolazione in PBS), agitando delicatamente su un bilanciere da laboratorio (400 rpm).
    4. Permeabilizzare con 1 mL di 150 mM Tris-HCl a pH 8,8 per 5 min a RT, quindi riscaldare per 15 min a 70 °C.
    5. Lavare 2 x 10 min con 1 mL di PTw, agitando delicatamente su un bilanciere da laboratorio (400 rpm).
    6. Lavare 2 x 5 min con 1 mL di dH2O, agitando delicatamente su un bilanciere da laboratorio (400 rpm).
    7. Permeabilizzare con 1 mL di acetone ghiacciato per 20 minuti a -20 °C.
    8. Lavare 2 x 5 min con 1 mL di dH2O, agitando delicatamente su un bilanciere da laboratorio (400 rpm).
    9. Lavare 2 x 5 minuti con 1 mL di PTw, agitando delicatamente su un bilanciere da laboratorio (400 rpm).
    10. Incubare le larve in 1 mL di tampone bloccante per 3 h a 4 °C, agitando delicatamente su un bilanciere da laboratorio (400 rpm).
    11. Posizionare le larve in piastre di pozzetto divise per gruppo come segue: 10 larve in 50 μL di volume/pozzetto in una piastra da 96 pozzetti o 20 larve in 100 μL di volume/pozzetto in una piastra da 48 pozzetti.
    12. Eliminare il tampone bloccante, incubare le larve con una soluzione anticorpale primaria (ad esempio, caspasi scissa anti-umana di coniglio-3, 1:250) diluita in tampone di incubazione per una notte a 4 °C al buio e dondolare delicatamente su una piastra shaker (400 rpm). Vedere il punto 7.2.11 per i volumi consigliati.
  3. Giorno 3:
    1. Lavare le larve in sequenza 3 x 1 h con 1 mL di PBS-TS (10% siero di capra, 1% Triton X-100 in PBS) e poi, con 2 x 10 min con 1 mL di PBS-T (1% Triton X-100 in PBS) e 2 x 1 h con 1 mL di PBS-TS. In ogni lavaggio, agitare delicatamente le piastre contenenti le larve su una piastra shaker (400 rpm).
    2. Incubare le larve con anticorpi secondari coniugati con coloranti fluorescenti (ad esempio, Goat anti-Rabbit IgG [H+L] Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647, 1:500) e 100 μg/mL Hoechst 33258 diluito in tampone di incubazione al buio durante la notte a 4 °C, con delicata agitazione su una piastra shaker (400 rpm). Vedere il punto 7.2.11 per i volumi raccomandati di soluzione anticorpale secondaria.
  4. Giorno 4:
    1. Lavare 3 x 1 h con 1 mL di PBS-TS e 2 x 1 h con 1 mL di PTw, agitando delicatamente su una piastra shaker (400 rpm).
    2. Creare uno strato circolare con lo smalto (spessore di ~ 0,5-1 mm) sui vetrini del microscopio. Lasciare asciugare lo smalto e posizionare le larve al centro dello strato circolare, esponendo il lato dello xenotrapianto.
    3. Asciugare la soluzione in eccesso e montare il vetrino di copertura con un mezzo di montaggio solubile in acqua e non fluorescente.

8. Imaging

  1. Cattura immagini al microscopio confocale con un obiettivo 40x. Utilizzare i seguenti parametri di acquisizione: una risoluzione di 1024 x 512 pixel con una spaziatura Z di 5 μm.

9. Analisi dell'apoptosi mediante ImageJ

  1. Caricare (Fiji Is Just) ImageJ software (https://imagej.net/Fiji/Downloads) e aprire l'immagine del file Z-stack (fare clic su File | Aperto). Nella finestra pop-up, selezionare Visualizzazione stack/Hyperstack e fare clic su OK.
  2. Sovrapporre i diversi canali selezionando Immagine | Colore | Crea composito.
  3. Trascinare la barra Z nella parte inferiore dell'immagine per sfogliare l'immagine Z-stack e identificare l'area dello xenotrapianto (cellule che sono fluorescenti del tracker cellulare positivo. Vedere punto 4.5) nello spazio perivitelline del pesce zebra.
  4. Selezionare Point Tool e contare il numero di cellule umane apoptotiche (positive al tracker cellulare fluorescente e caspasi scisse-3), come mostrato nel video supplementare S1.
  5. Fare doppio clic sull'icona Point Tool , modificare il contatore e contare il numero totale di nuclei di cellule umane (nuclei di cellule CM-DiI positive).

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Risultati

Questo protocollo descrive l'approccio sperimentale per stabilire zPDX da adenocarcinoma pancreatico umano primario. Un campione di tumore è stato raccolto, tritato e colorato utilizzando colorante fluorescente, come descritto nella sezione 4 del protocollo. Gli zPDX sono stati quindi stabiliti con successo mediante l'impianto di un pezzo di tumore nello spazio perivitellino di 2 embrioni di zebrafish dpf, come descritto nella sezione 5 del protocollo. Come descritto nella sezione 6 del protocollo, gli zPDX sono stati ul...

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Discussione

I modelli in vivo nella ricerca sul cancro forniscono strumenti inestimabili per comprendere la biologia del cancro e prevedere la risposta al trattamento del cancro. Attualmente sono disponibili diversi modelli in vivo , ad esempio animali geneticamente modificati (topi transgenici e knockout) o xenotrapianti derivati da pazienti da cellule primarie umane. Nonostante molte caratteristiche ottimali, ognuna ha varie limitazioni. In particolare, i suddetti modelli mancano di un modo affidabile per imitare...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato dalla Fondazione Pisa (progetto 114/16). Gli autori ringraziano Raffaele Gaeta dell'Unità Operativa di Istopatologia dell'Azienda Ospedaliera Pisana per la selezione dei campioni di pazienti e il supporto patologico. Ringraziamo anche Alessia Galante per il supporto tecnico nelle sperimentazioni. Questo articolo è basato sul lavoro di COST Action TRANSPAN, CA21116, sostenuto da COST (European Cooperation in Science and Technology).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
5-fluorouracileTeva Pharma AGSMP 1532755
48 piastra multipozzettoSarstedt83 3923
96 piastra multipozzettoSarstedt82.1581.001
AcetoneMerck179124
Agarosio in polvere MerckA9539
AmfotericinaThermo Fisher Scientific15290018
Anticorpo anti-nuclei, clone 235-1MerckMAB1281 Diluizione 1:200
Rete per acquario QN6Penn-plax0-30172-23006-6
BSAMerckA9418
CellTraceThermo Fisher ScientificC34567
CellTracker CM-DiI Thermo Fisher ScientificC7001
CellTracker Rosso intenso Thermo Fisher ScientificC34565
Caspasi-3 scissa (Asp175) (5A1E)di segnalazione cellulare9661SDiluizione 1:250
Dimetil solfossido (DMSO) PanReac AppliChem ITW ReagentiA3672,0250
Dumont #5 pinzeWorld Precision Instruments501985
Acido folinico -  Capillari in vetro LederfolinPfizer
, 3,5"Drummond Scientific Company3-000-203-G/XDiametro esterno = 1,14 mm. Diametro interno = 0,53 mm.
Fiale di vetro VWR InternationalWHEAW224581
Capra anti-Coniglio  IgG (H+L) Anticorpo secondario adsorbito in modo incrociato, Alexa Fluor 647Thermo Fisher ScientificA-21244   Diluizione 1:500
Siero di capraThermo Fisher Scientific31872
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570
IrinotecanHospira
Fiale per congelatore a bassa temperaturaVWR International479-1220
McIlwain Tissue ChopperWorld Precision Instruments
Miscelatoreper micropiastreSCILOGEX822000049999
OxaliplatinoTeva
ParaformaldeideMerckP6148-500G
PBSThermo Fisher Scientific14190094
Penicillina-streptomicina Thermo Fisher Scientific 15140122
Piastra di Petri 100 mmSarstedt83 3902500
Piastra di Petri 60 mmSarstedt83 3901
Pipetta Pasteur in plasticaSarstedt86.1171.010
Poly-MountTebu-bio18606-5
Ioduro di propidioMerckP4170
RPMI-1640 medioThermo Fisher Scientific11875093
lama per bisturi n. 10 Sterile in acciaio inossidabileVWR InternationalSWAN3001
manico per bisturi #3World Precision Instruments500236
TricaineMerckE10521
Triton X-100 MerckT8787
Tween 20MerckP9416
Estrattore per micropipette verticaleStrumento otturatoreP-30 
Tecnologia mAb di coniglio

Riferimenti

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