Istituzione di xenotrapianti derivati da pazienti zebrafish da cancro del pancreas per test di chemiosensibilità

Uno dei problemi della ricerca clinica sul cancro è che il cancro non è una singola malattia, ma una varietà di malattie diverse che possono evolvere nel tempo, richiedendo trattamenti specifici a seconda delle caratteristiche del tumore stesso e del paziente¹. Di conseguenza, la sfida è quella di muoversi verso la ricerca sul cancro orientata al paziente, al fine di identificare nuove strategie personalizzate per la previsione precoce dei risultati del trattamento del cancro². Ciò è particolarmente rilevante per l'adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC), poiché è considerato un tumore difficile da trattare, con un tasso di sopravvivenza a 5 anni dell'11%³.

La diagnosi tardiva, la rapida progressione e la mancanza di terapie efficaci rimangono i problemi clinici più urgenti del PDAC. La sfida principale è, quindi, quella di modellare il paziente e identificare i biomarcatori che possono essere applicati in clinica per selezionare la terapia più efficace in linea con la medicina personalizzata ^4,5,6. Nel corso del tempo, sono stati proposti nuovi approcci per modellare le malattie tumorali: organoidi derivati dal paziente (PDO) e xenotrapianti derivati dal paziente di topo (mPDX) hanno avuto origine da una fonte di tessuto tumorale umano. Sono stati utilizzati per riprodurre la malattia per studiare la risposta e la resistenza alla terapia, nonché la recidiva della malattia ^7,8,9.

Allo stesso modo, l'interesse per i modelli di xenotrapianto derivati dal paziente (zPDX) basati sul pesce zebra è aumentato, grazie alle loro caratteristiche uniche e promettenti¹⁰, rappresentando uno strumento rapido e a basso costo per la ricerca sul cancro^11,12. I modelli zPDX richiedono solo una piccola dimensione del campione tumorale, il che rende fattibile lo screening ad alto rendimento della chemioterapia¹³. La tecnica più comune utilizzata per i modelli zPDX si basa sulla digestione completa del campione e sull'impianto delle popolazioni cellulari primarie, che riproduce parzialmente il tumore, ma presenta gli svantaggi di una mancanza di microambiente tumorale e diafonia tra cellule maligne e sane¹⁴.

Questo lavoro mostra come gli zPDX possono essere utilizzati come modello preclinico per identificare il profilo di chemiosensibilità dei pazienti con cancro del pancreas. La preziosa strategia facilita il processo di xenotrapianto, poiché non è necessaria l'espansione cellulare, consentendo l'accelerazione dello screening chemioterapico. La forza del modello è che tutti i componenti del microambiente sono mantenuti come sono nel tessuto tumorale del paziente, perché, come è noto, il comportamento del tumore dipende dalla loro interazione^15,16. Ciò è molto favorevole rispetto ai metodi alternativi in letteratura, in quanto è possibile preservare l'eterogeneità del tumore e contribuire a migliorare la prevedibilità dell'esito del trattamento e della recidiva in modo paziente-specifico, consentendo così al modello zPDX di essere utilizzato in studi co-clinici. Questo manoscritto descrive i passaggi coinvolti nella realizzazione del modello zPDX, iniziando con un pezzo di resezione del tumore del paziente e trattandolo per analizzare la risposta alla chemioterapia.

Il Ministero della Salute Pubblica italiano ha approvato tutti gli esperimenti sugli animali descritti, in conformità con la Direttiva 2010/63/UE sull'uso e la cura degli animali. Il Comitato Etico locale ha approvato lo studio, con numero di registrazione 70213. Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i soggetti coinvolti. Prima di iniziare, tutte le soluzioni e l'attrezzatura devono essere preparate (sezione 1) e il pesce deve essere attraversato (sezione 2).

1. Preparazione di soluzioni e attrezzature

NOTA: vedere la Tabella 1 per le soluzioni e i supporti da preparare.

1. Supporto gel di agarosio
   1. Pesare la polvere di agarosio in un matraccio da microonde e scioglierla in un dato volume di mezzo E3 zebrafish per ottenere un gel all'1%. Riscaldare in un forno a microonde fino a quando l'agarosio si è completamente sciolto.
      NOTA: non bollire eccessivamente la soluzione.
   2. Versare l'agarosio fuso in una capsula di Petri e attendere che il gel si sia completamente solidificato.
   3. Realizzare piccoli cilindri di agarosio (~ 5 mm di altezza) utilizzando una pipetta Pasteur di plastica con la punta tagliata. Una volta preparato, conservare in una capsula di Petri a 4 °C avvolto in un foglio di alluminio.
2. Microaghi di vetro
   1. Tirare i capillari di vetro borosilicato con un estrattore per ottenere aghi sottili (impostazioni: HEAT 990, PULL 550).
      NOTA: Da un capillare, è possibile ottenere due aghi sottili con un diametro della punta di 10 μm.

2. Incrocio del pesce e raccolta delle uova

1. Trasferire i pesci adulti in vasche di riproduzione 3 giorni prima dell'impianto del tessuto, come descritto da Avdesh et ^al.17.
2. NOTA: Si raccomanda un rapporto di 1:1 o 2:3 maschi e femmine. La densità del pesce dovrebbe essere un massimo di cinque pesci per litro d'acqua. Tenere maschi e femmine separati con una barriera durante la notte.
3. Il giorno dopo, rimuovere la barriera e consentire al pesce di accoppiarsi.
4. Rimuovere i pesci dalle vasche di riproduzione e riportarli alle loro vasche di alloggiamento.
5. Versare l'acqua dalla vasca di allevamento attraverso una rete a maglie sottili. Trasferire le uova fecondate in una capsula di Petri con terreno E3 zebrafish.
6. Controllare la capsula di Petri con uno stereomicroscopio e scartare le uova torbide. Conservare le uova fecondate in terreno fresco E3 zebrafish a 28 °C.

3. Raccolta di campioni

NOTA: pinza per autoclave e manico per bisturi.

1. Elaborazione immediata
   1. Raccogliere il campione chirurgico di tumore in 10 ml di terreno tumorale a 4 °C (campione tumorale di diametro compreso tra 5 mm e 10 mm). Trasferire il campione a 4 °C dalla posizione desiderata per la lavorazione immediata.
2. Conservazione durante la notte (opzionale)
   1. Raccogliere il campione chirurgico di tumore in 10 ml di terreno tumorale e conservare il campione per una notte a 4 °C.
3. Conservazione a -80 °C (facoltativo, meno consigliato)
   1. Conservare il campione a -80 °C in un flaconcino criogenico con terreno tumorale integrato con dimetilsolfossido (DMSO) al 5%.

4. Elaborazione del campione

NOTA: Eseguire i passaggi sotto una cappa a flusso laminare per coltura di tessuto sterile.

1. Lavare l'intero tessuto tumorale con 5 ml di terreno tumorale fresco, pipettando su e giù 10 volte usando una pipetta Pasteur di plastica. Aspirare e scartare il mezzo di lavaggio. Ripetere questo passaggio 3x.
   NOTA: Evitare l'aspirazione del tessuto tumorale in quanto potrebbe rimanere attaccato alla pipetta di plastica Pasteur.
2. Trasferire il campione in una capsula di Petri e immergerlo in 1-2 ml di terreno tumorale fresco. Tagliare il campione di tumore in piccoli pezzi (1-2 mm³) usando una lama di bisturi e metterli in un tubo di plastica sterile da 5 ml con mezzo tumorale.
3. Impostare il trinciatutto McIlwain su uno spessore di 100 μm. Posizionare i frammenti del campione sul tavolo di plastica circolare dell'elicottero e tritarli. Ruotare il tavolo di 90° e ripetere il taglio.
4. Centrifugare i frammenti a 300 × g per 3 min. Quindi, aspirare con attenzione il surnatante e scartarlo.
5. Incubare i frammenti con un tracker cellulare fluorescente, CM-DiI (concentrazione finale di 10 μg/mL nella soluzione salina tamponata fosfato di Dulbecco [DPBS]), Deep Red (concentrazione finale di 1 μL/mL in DPBS) o CellTrace (concentrazione finale di 5 μM in DPBS) per 30 minuti, ponendo il tubo a bagnomaria a 37 °C.
6. Risospendere i frammenti mediante pipettaggio delicato su e giù ogni 10 minuti.
   NOTA: Nel caso di CellTrace, aggiungere terreno contenente almeno l'1% di proteine alla fine dell'incubazione, secondo le istruzioni del produttore.
7. Centrifugare a 300 x g per 3 minuti ed eliminare il surnatante. Ripetere questo passaggio 3x con 1 mL di DPBS per rimuovere il colorante non incorporato.
8. Sospendere i frammenti in 5 ml di DPBS in una capsula di Petri da 60 mm.
   NOTA: Assicurarsi che il tessuto non si asciughi.

5. Istituzione di zPDX

NOTA: Eseguire i passaggi sotto una cappa a flusso laminare per coltura di tessuto sterile.

1. Anestetizzare gli embrioni 2 giorni dopo la fecondazione (dpf) con 0,16 mg/ml di tricaina nel terreno E3 di zebrafish.
2. Mettere tre cilindri di agarosio (passo 1.1.3) in una capsula di Petri e posare un embrione di zebrafish su un cilindro, esponendo un lato. Rimuovere la soluzione in eccesso per mantenere l'embrione in un film sottile.
3. Trasferire il pezzo di tessuto macchiato con una pinza sterile dalla capsula di Petri al supporto di agarosio all'1% dove giace l'embrione. Raccogliere il tessuto, metterlo sopra il tuorlo dell'embrione e quindi spingerlo nello spazio perivitellino usando il microago di vetro tirato dal calore (fase 1.2.1).
4. Aggiungere delicatamente alcune gocce di E3 1% penicillina-streptomicina (Pen-Strep) all'embrione per riportarlo nel liquido.
5. Ripetere i punti 5.2-5.4 per tutti gli embrioni e, infine, rimuovere i supporti di agarosio dalla capsula di Petri e incubare gli embrioni a 35 °C.
6. Controllare gli embrioni per gli xenotrapianti corretti (colorazione positiva) 2 ore dopo l'impianto utilizzando uno stereomicroscopio fluorescente. Scartare gli embrioni con frammenti tumorali che non sono completamente all'interno dello spazio perivitellino, così come gli embrioni morti. Distribuire casualmente gli embrioni in sei piastre multi-pozzetto (massimo n = 20 embrioni/pozzetto), equamente divisi in gruppi secondo il piano sperimentale (ad esempio, controllo e FOLFOXIRI).

6. Trattamento

1. Diluire il farmaco (ad es. 5-fluorouracile, oxaliplatino, irinotecan) in E3 1% Pen-Strep, mescolando accuratamente pipettando su e giù più volte. Come proposto da Usai et ^al.12, utilizzare una diluizione cinque volte del farmaco nell'acqua del pesce, rispetto alla concentrazione plasmatica equivalente (EPC).
2. Mescolare i farmaci per preparare il cocktail (ad esempio, FOLFOXIRI).
3. Rimuovere il supporto da ciascun pozzetto e aggiungere il cocktail di droga 2 ore dopo l'impianto.
4. Trattare gli embrioni per 3 giorni. Rinnova il cocktail di droga ogni giorno.

7. Colorazione immunofluorescente a montaggio intero

NOTA: Prima di iniziare, porre acetone a -20 °C e preparare le soluzioni elencate nella Tabella 1.

1. Giorno 1:
   1. Fissare le larve con 1 mL di paraformaldeide al 4% in flaconcini di vetro a 4 °C durante la notte.
2. Giorno 2:
   1. Lavare le larve 3 x 5 min con 1 mL di PBS, agitando delicatamente su un bilanciere da laboratorio (400 rpm).
   2. Conservare in 1 mL di metanolo al 100% a -20 °C durante la notte (o per la conservazione a lungo termine).
   3. Reidratare 3 x 10 minuti con 1 mL di PTw (0,1% di interpolazione in PBS), agitando delicatamente su un bilanciere da laboratorio (400 rpm).
   4. Permeabilizzare con 1 mL di 150 mM Tris-HCl a pH 8,8 per 5 min a RT, quindi riscaldare per 15 min a 70 °C.
   5. Lavare 2 x 10 min con 1 mL di PTw, agitando delicatamente su un bilanciere da laboratorio (400 rpm).
   6. Lavare 2 x 5 min con 1 mL di dH₂O, agitando delicatamente su un bilanciere da laboratorio (400 rpm).
   7. Permeabilizzare con 1 mL di acetone ghiacciato per 20 minuti a -20 °C.
   8. Lavare 2 x 5 min con 1 mL di dH₂O, agitando delicatamente su un bilanciere da laboratorio (400 rpm).
   9. Lavare 2 x 5 minuti con 1 mL di PTw, agitando delicatamente su un bilanciere da laboratorio (400 rpm).
   10. Incubare le larve in 1 mL di tampone bloccante per 3 h a 4 °C, agitando delicatamente su un bilanciere da laboratorio (400 rpm).
   11. Posizionare le larve in piastre di pozzetto divise per gruppo come segue: 10 larve in 50 μL di volume/pozzetto in una piastra da 96 pozzetti o 20 larve in 100 μL di volume/pozzetto in una piastra da 48 pozzetti.
   12. Eliminare il tampone bloccante, incubare le larve con una soluzione anticorpale primaria (ad esempio, caspasi scissa anti-umana di coniglio-3, 1:250) diluita in tampone di incubazione per una notte a 4 °C al buio e dondolare delicatamente su una piastra shaker (400 rpm). Vedere il punto 7.2.11 per i volumi consigliati.
3. Giorno 3:
   1. Lavare le larve in sequenza 3 x 1 h con 1 mL di PBS-TS (10% siero di capra, 1% Triton X-100 in PBS) e poi, con 2 x 10 min con 1 mL di PBS-T (1% Triton X-100 in PBS) e 2 x 1 h con 1 mL di PBS-TS. In ogni lavaggio, agitare delicatamente le piastre contenenti le larve su una piastra shaker (400 rpm).
   2. Incubare le larve con anticorpi secondari coniugati con coloranti fluorescenti (ad esempio, Goat anti-Rabbit IgG [H+L] Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647, 1:500) e 100 μg/mL Hoechst 33258 diluito in tampone di incubazione al buio durante la notte a 4 °C, con delicata agitazione su una piastra shaker (400 rpm). Vedere il punto 7.2.11 per i volumi raccomandati di soluzione anticorpale secondaria.
4. Giorno 4:
   1. Lavare 3 x 1 h con 1 mL di PBS-TS e 2 x 1 h con 1 mL di PTw, agitando delicatamente su una piastra shaker (400 rpm).
   2. Creare uno strato circolare con lo smalto (spessore di ~ 0,5-1 mm) sui vetrini del microscopio. Lasciare asciugare lo smalto e posizionare le larve al centro dello strato circolare, esponendo il lato dello xenotrapianto.
   3. Asciugare la soluzione in eccesso e montare il vetrino di copertura con un mezzo di montaggio solubile in acqua e non fluorescente.

8. Imaging

1. Cattura immagini al microscopio confocale con un obiettivo 40x. Utilizzare i seguenti parametri di acquisizione: una risoluzione di 1024 x 512 pixel con una spaziatura Z di 5 μm.

9. Analisi dell'apoptosi mediante ImageJ

1. Caricare (Fiji Is Just) ImageJ software (https://imagej.net/Fiji/Downloads) e aprire l'immagine del file Z-stack (fare clic su File | Aperto). Nella finestra pop-up, selezionare Visualizzazione stack/Hyperstack e fare clic su OK.
2. Sovrapporre i diversi canali selezionando Immagine | Colore | Crea composito.
3. Trascinare la barra Z nella parte inferiore dell'immagine per sfogliare l'immagine Z-stack e identificare l'area dello xenotrapianto (cellule che sono fluorescenti del tracker cellulare positivo. Vedere punto 4.5) nello spazio perivitelline del pesce zebra.
4. Selezionare Point Tool e contare il numero di cellule umane apoptotiche (positive al tracker cellulare fluorescente e caspasi scisse-3), come mostrato nel video supplementare S1.
5. Fare doppio clic sull'icona Point Tool , modificare il contatore e contare il numero totale di nuclei di cellule umane (nuclei di cellule CM-DiI positive).

Questo protocollo descrive l'approccio sperimentale per stabilire zPDX da adenocarcinoma pancreatico umano primario. Un campione di tumore è stato raccolto, tritato e colorato utilizzando colorante fluorescente, come descritto nella sezione 4 del protocollo. Gli zPDX sono stati quindi stabiliti con successo mediante l'impianto di un pezzo di tumore nello spazio perivitellino di 2 embrioni di zebrafish dpf, come descritto nella sezione 5 del protocollo. Come descritto nella sezione 6 del protocollo, gli zPDX sono stati ulteriormente sottoposti a screening per identificare i profili di sensibilità alla chemioterapia delle cellule tumorali derivate dal paziente. Ad esempio, è stata testata la combinazione di chemioterapia FOLFOXIRI (5-fluorouracile, acido folinico, oxaliplatino e irinotecan), poiché viene utilizzata come chemioterapia di prima linea per l'adenocarcinoma duttale pancreatico avanzato e nel carcinoma colorettale metastatico. Le immagini a montaggio intero degli zPDX sono state acquisite come stack Z sul microscopio confocale e l'induzione dell'apoptosi è stata analizzata come descritto nelle sezioni 8 e 9 del protocollo. Come mostrato in Figura 1A,B, la terapia combinata ha portato ad un aumento dell'apoptosi cellulare rispetto al gruppo di controllo. Nel caso di studio qui riportato, è stato identificato un aumento statisticamente significativo della frazione di cellule apoptotiche negli xenotrapianti impiantati per il gruppo trattato con FOLFOXIRI rispetto al gruppo di controllo (Figura 1C).

Tabella 1: Soluzioni e supporti utilizzati nel protocollo.

Figura supplementare S1: Il campione di tumore PDAC è stato colorato con DiO (verde) e xenoinnestato nello spazio perivitellino di 2 embrioni di zebrafish dpf.Dopo un tempo di incubazione di 3 giorni, gli zPDX sono stati iniettati con 2 μg/mL di ioduro di propidio (PI; rosso) e quindi sottoposti a imaging confocale 3D. La vitalità cellulare è stata verificata misurando le cellule PI-positive sul numero totale di cellule umane (DiO positive). Barra di scala = 100 μm. Abbreviazioni: PDAC = adenocarcinoma duttale pancreatico; dpf = giorni dopo la fecondazione; zPDX = xenotrapianto derivato dal paziente zebrafish. Clicca qui per scaricare questo file.

Video supplementare S1: Esempio di conteggio apoptotico delle cellule umane, utilizzando lo strumento multipunto di ImageJ. Il video è uno Z-stack di uno zPDX 3 giorni dopo l'impianto, acquisito dopo l'immunocolorazione con caspasi-3 e Hoechst 33258. Abbreviazioni: zPDX = xenotrapianto derivato dal paziente zebrafish. Clicca qui per scaricare questo video.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.