Nelle sinapsi eccitatorie nel cervello dei mammiferi, il glutammato rilasciato presinapticamente attiva i recettori incorporati nella membrana postsinaptica 1,2. La forza di queste connessioni sinaptiche subisce una plasticità dipendente dall'esperienza, una proprietà che consente diverse forme di apprendimento e memoria 3,4,5,6,7,8,9. Cambiamenti patologici nel numero di sinapsi e nelle loro proprietà di segnalazione portano all'alterazione dell'attività del circuito e dell'elaborazione delle informazioni mostrata in numerosi disturbi neurologici e psichiatrici 10,11,12. Pertanto, vi è un bisogno critico di comprendere i meccanismi sottostanti che governano la connettività neurale e la forza delle connessioni sinaptiche.
Le sinapsi eccitatorie si formano su spine dendritiche, minuscole sporgenze postsinaptiche contenenti proteine dell'impalcatura, recettori, fattori di segnalazione, proteine del citoscheletro e organelli di traffico 1,2,13,14,15,16. Questi compartimenti di segnalazione di dimensioni micron consentono il controllo della forza sinaptica su base sinapsi per sinapsi13,16. La morfologia della spina dendritica varia lungo la lunghezza dei dendriti neuronali, con forme della spina tipicamente descritte come sottili, filopodiali, tozze, a fungo o ramificate13. È importante sottolineare che la forma della colonna vertebrale è correlata alla funzione sinaptica e alla stabilità. Ad esempio, le spine più grandi hanno un numero maggiore di recettori e una maggiore forza sinaptica 16,17,18. A differenza delle spine sottili, le spine più grandi possono persistere per mesi in vivo, una proprietà che può consentire connessioni sinaptiche stabili e archiviazione della memoria a lungo termine19,20.
La morfologia e la densità della colonna vertebrale lungo un dendrite sono comunemente monitorate per sondare il grado di connettività neurale e le proprietà delle sinapsi eccitatorie all'interno di una particolare regione del cervello, sia in stati normali che in stati di malattia13. È stata sviluppata una varietà di metodi per visualizzare la morfologia della colonna vertebrale in diverse preparazioni tissutali e sistemi modello utilizzando la microscopia ottica e a fluorescenza standard, nonché la microscopia a superrisoluzione e la microscopia elettronica (EM)21. Queste potenti tecniche di imaging hanno fornito una visione straordinaria della nostra attuale comprensione dell'organizzazione, della funzione e della malattia del cervello. Questa raccolta di metodi include importanti tecniche di imaging per monitorare la complessità morfologica di dendriti e spine, nonché strumenti optogenetici per attivare e misurare l'attività neurale nei dendriti e nelle singole spine.
Pekarek et al.22 presentano un protocollo relativamente rapido e ad alto rendimento per visualizzare e quantificare la struttura dei dendriti neuronali in profondità all'interno del tessuto nervoso intatto. Gli autori eseguono il maging/immunocoloring/ibridazione in situ compatibile con Tissue-hYdrogel (CLARITY), una tecnica di pulizia dei tessuti che rimuove i lipidi dal tessuto cerebrale e aiuta a ridurre al minimo la dispersione della luce durante l'imaging successivo23. Dopo la cancellazione, le pile Z di neuroni che esprimono proteine fluorescenti sono state raccolte mediante microscopia confocale o a due fotoni. L'analisi delle immagini e la quantificazione automatizzata hanno permesso di misurare con precisione la densità e la forma delle spine, nonché la complessità degli alberi dendritici. Questo protocollo consente l'imaging simultaneo di strutture che vanno dalle singole spine agli alberi dendritici ed elimina la fase di taglio a sezione sottile, che richiede tempo e potenzialmente dannosa. Questa tecnica sarà molto utile per i ricercatori che cercano di quantificare i cambiamenti nella morfologia della colonna vertebrale e nella complessità dendritica nei tessuti cerebrali intatti in seguito all'introduzione o alla rimozione di uno o più geni di interesse.
Sviluppata oltre 100 anni fa24, la colorazione del Golgi rimane un potente strumento per visualizzare l'organizzazione del sistema nervoso e la morfologia neuronale. In questo metodo, popolazioni sparse di neuroni vengono colorate mediante microcristallizzazione di cromato d'argento, consentendo la visualizzazione di assoni, alberi dendritici e spine25. Frankfurt e Bowman26 descrivono in dettaglio un protocollo di impregnazione rapida di Golgi per visualizzare i neuroni e le spine dendritiche nell'ippocampo di ratto e nella corteccia prefrontale mediale. Gli autori dimostrano come preparare, colorare e visualizzare i tessuti per la successiva microscopia ottica, oltre a quantificare la densità della colonna vertebrale lungo gli alberi dendritici. Il protocollo qui descritto produce un'impregnazione coerente e affidabile dei neuroni e riduce l'esposizione a sostanze chimiche tossiche.
Mentre la microscopia a luce e a fluorescenza sono adatte per l'imaging di dendriti e spine, l'EM consente la visualizzazione con risoluzione nanometrica di strutture pre e postsinaptiche21. Gli approcci EM sono tipicamente utilizzati per misurare le proprietà ultrastrutturali delle sinapsi, comprese le dimensioni della densità postsinaptica, nonché il numero e le dimensioni delle vescicole sinaptiche21. In questa raccolta, Śliwińska et al.27 forniscono un protocollo per acquisire immagini EM tridimensionali (3D) mediante scansione del viso Electron Microscopia (SBEM) nel tessuto di topo ippocampale28,29. In particolare, descrivono come preparare i campioni, incorporare il tessuto nella resina, montare e tagliare i campioni, eseguire SBEM e analizzare le immagini per generare ricostruzioni 3D. Questo protocollo genera immagini ad alto contrasto con membrane ben definite e può essere adattato a una varietà di tipi di tessuto.
Durante lo sviluppo del sistema nervoso, i neuroni subiscono drammatici cambiamenti morfologici poiché le connessioni sinaptiche si formano e si affinano dall'attività neurale30,31. Per monitorare la maturazione neuronale nel cervelletto in via di sviluppo, Chan et al.32 forniscono un protocollo per l'elettroporazione postnatale in vivo dei neuroni granulari in via di sviluppo. Qui, i ricercatori hanno iniettato ed elettroporicato il DNA nel rombencefalo di cuccioli di topo postnatale per trasfettare una popolazione sparsa di neuroni con proteine fluorescenti. La microscopia confocale ad alta risoluzione e l'imaging 3D hanno permesso ai ricercatori di caratterizzare la morfologia dei dendriti e degli artigli dendritici in diverse fasi dello sviluppo postnatale. È importante sottolineare che questo approccio potrebbe consentire l'inserimento o la rimozione di geni che possono influenzare la maturazione e la funzione delle cellule dei granuli e sarà di grande interesse per i ricercatori che studiano lo sviluppo cerebellare e la maturazione dei neuroni dei granuli.
Infine, i protocolli di Cuentas-Condori e Miller33 impiegano l'imaging a super-risoluzione34, l'optogenetica35 e l'imaging su cellule vive della dinamica del calcio36 per studiare l'attività dei neuroni GABAergici nel nematode C. elegans. Utilizzando un microscopio confocale attrezzato per l'imaging a super-risoluzione37, gli autori esprimono proteine fluorescenti nei dendriti per misurare la frequenza di diverse forme della colonna vertebrale. Inoltre, gli autori valutano la funzione neurale attraverso l'espressione di una proteina optogenetica presinaptica e di un indicatore di calcio postsinaptica. In seguito all'attivazione luminosa dei terminali, sono stati osservati transitori di calcio all'interno delle singole spine dendritiche. Questi protocolli, insieme a recenti risultati38, evidenziano l'uso entusiasmante di C. elegans come potente sistema modello per monitorare la morfologia della colonna vertebrale e l'attività sinaptica.
Nel loro insieme, i protocolli descritti in questa raccolta di metodi si aggiungeranno alla già ricca cassetta degli attrezzi disponibile per visualizzare la struttura neurale e la funzione21. L'implementazione di questi metodi in studi futuri fornirà probabilmente ulteriori informazioni sui processi che guidano la plasticità sinaptica correlata all'apprendimento e sui meccanismi cellulari che sono alla base degli stati patologici.