Ingegnerizzazione e caratterizzazione di un modello optogenetico della giunzione neuromuscolare umana

Martin Liberman; Miguel Chavez; Trevor R. Nash; Olaia F. Vila; Gordana Vunjak-Novakovic

doi:10.3791/63759

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Articolo metodologico

Ingegnerizzazione e caratterizzazione di un modello optogenetico della giunzione neuromuscolare umana

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DOI:

10.3791/63759

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14 aprile 2022

Martin Liberman¹ , Miguel Chavez¹ , Trevor R. Nash¹^,² , Olaia F. Vila¹^,³ , Gordana Vunjak-Novakovic¹^,²^,⁴

¹Department of Biomedical Engineering, Columbia University, ²Department of Medicine, Columbia University, ³Gladstone Institutes, ⁴College of Dental Medicine, Columbia University

In questo articolo

Sommario

Descriviamo un sistema di imaging riproducibile, automatizzato e imparziale per caratterizzare la funzione di giunzione neuromuscolare utilizzando tessuto muscolare scheletrico ingegnerizzato umano e motoneuroni optogenetici. Questo sistema consente la quantificazione funzionale della connettività neuromuscolare nel tempo e rileva una diminuzione della funzione neuromuscolare causata da neurotossine e miastenia grave del siero del paziente.

Abstract

Molte malattie neuromuscolari, come la miastenia grave (MG), sono associate a disfunzione della giunzione neuromuscolare (NMJ), che è difficile da caratterizzare nei modelli animali a causa delle differenze fisiologiche tra animali e umani. L'ingegneria tissutale offre l'opportunità di fornire modelli in vitro di NMJ umani funzionali che possono essere utilizzati per diagnosticare e studiare patologie NMJ e testare potenziali terapie. Incorporando proteine optogenetiche in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), abbiamo generato neuroni che possono essere stimolati con specifiche lunghezze d'onda della luce. Se l'NMJ è sano e funzionale, un segnale neurochimico dal motoneurone provoca la contrazione muscolare. Attraverso l'integrazione dell'optogenetica e della microfabbricazione con l'ingegneria tissutale, abbiamo stabilito una metodologia imparziale e automatizzata per caratterizzare la funzione NMJ utilizzando l'analisi video. È stato sviluppato un protocollo standardizzato per la formazione di NMJ, la stimolazione ottica con registrazione video simultanea e l'analisi video della contrattilità tissutale. La stimolazione dei motoneuroni optogenetici da parte della luce per indurre contrazioni muscolari scheletriche ricapitola la fisiologia NMJ umana e consente ripetute misurazioni funzionali di NMJ nel tempo e in risposta a vari input. Dimostriamo la capacità di questa piattaforma di mostrare miglioramenti funzionali nella connettività neuromuscolare nel tempo e caratterizzare gli effetti dannosi degli anticorpi MG del paziente o delle neurotossine sulla funzione NMJ.

Introduzione

La giunzione neuromuscolare (NMJ) è la sinapsi chimica tra motoneuroni (MN) e cellule muscolari scheletriche (SkM) che consente la contrazione muscolare. Le tossine, come la neurotossina α-bungarotossina (BTX), o le malattie neuromuscolari (NMD) come la miastenia grave (MG) possono portare alla degenerazione del NMJ e alla riduzione del controllo muscolare¹. I modelli di tessuto umano bioingegnerizzati ricapitolano meglio i meccanismi funzionali e fisiologici degli NMJ umani e offrono un maggiore potenziale traslazionale rispetto ai modelli animali.

Mentre i modelli animali hanno avanzato la com....