Presentiamo un protocollo per lo screening dei composti del virus anti-epatite B (HBV) mirati alle fasi del ciclo di vita di ingresso pre e post-virale, utilizzando la calorimetria isotermica di titolazione per misurare l'affinità di legame (KD) con il polipeptide cotrasportante del taurocolato di sodio ospite. L'efficacia antivirale è stata determinata attraverso la soppressione dei marcatori del ciclo di vita virale (formazione del cccDNA, trascrizione e assemblaggio virale).
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Articolo metodologico
Un modello di epatociti competente che esamina l'ingresso del virus dell'epatite B attraverso il taurococolato di sodio che trasporta il polipeptide come bersaglio terapeutico
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'infezione da virus dell'epatite B (HBV) è stata considerata un fattore di rischio cruciale per il carcinoma epatocellulare. Il trattamento attuale può solo ridurre la carica virale ma non provocare una remissione completa. Un modello epatocitario efficiente per l'infezione da HBV offrirebbe un ciclo di vita virale realistico che sarebbe cruciale per lo screening degli agenti terapeutici. La maggior parte degli agenti anti-HBV disponibili si rivolge alle fasi del ciclo di vita dopo l'ingresso virale, ma non prima dell'ingresso virale. Questo protocollo descrive in dettaglio la generazione di un modello di epatociti competente in grado di selezionare gli agenti terapeutici mirati alle fasi del ciclo di vita dell'ingresso pre-virale e post-virale. Ciò include il targeting del legame del polipeptide cotrasportatore di taurocolato di sodio (NTCP), la formazione del cccDNA, la trascrizione e l'assemblaggio virale basato su imHC o HepaRG come cellule ospiti. Qui, il test di inibizione dell'ingresso HBV ha utilizzato la curcumina per inibire il legame e le funzioni di trasporto dell'HBV tramite NTCP. Gli inibitori sono stati valutati per l'affinità di legame (KD) con NTCP utilizzando la calorimetria isotermica di titolazione (ITC), uno strumento universale per lo screening dei farmaci HBV basato su parametri termodinamici.
Introduzione
L'infezione da virus dell'epatite B (HBV) è considerata una malattia pericolosa per la vita in tutto il mondo. L'infezione cronica da HBV è carica di un rischio di cirrosi epatica e carcinoma epatocellulare1. L'attuale trattamento anti-HBV si concentra principalmente sull'ingresso post-virale utilizzando analoghi nucleos(t)ide (NAs) e interferone-alfa (IFN-α)2,3. La scoperta di un inibitore dell'ingresso dell'HBV, Myrcludex B, ha identificato un nuovo bersaglio per gli agenti anti-HBV4. La combinazione di inibitori di ingresso e NA nell'HBV cronico ha ridotto sig....
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Protocollo
NOTA: Le seguenti procedure devono essere eseguite in una cappa di flusso di pericolo biologico di classe II o in una cappa a flusso laminare. La gestione dell'HBV è stata eticamente approvata dall'IRB (MURA2020/1545). Vedere la tabella dei materiali per i dettagli su tutte le soluzioni, i reagenti, le apparecchiature e le linee cellulari utilizzate in questo protocollo.
1. Preparazione delle cellule ospiti (epatociti maturi)
- Epatociti di coltura (3,75 × 105 cellule HepaRG o imHC) e mantenere in un matraccio di coltura di 75 cm2 con 10 ml di terreno DMEM/F12 integrato con sie....
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Risultati
Sono state osservate caratteristiche di maturazione epatica, tra cui cellule binucleate e morfologia di forma poligonale (Figura 1), specialmente nello stadio differenziato di imHC (Figura 1A). Un grande aumento dell'espressione di NTCP è stato misurato in d-HepaRG e d-imHC rispettivamente a 7 volte e 40 volte (Figura 1B). La forma altamente glicosilata di NTCP, postulata per conferire suscettibilità all'ingresso dell'HBV, è stata r.......
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Discussione
L'infezione da HBV viene avviata attraverso il legame a bassa affinità ai proteoglicani dell'eparan solfato (HSPG) sugli epatociti25, seguito dal legame a NTCP con successiva internalizzazione attraverso l'endocitosi26. Poiché NTCP è un recettore cruciale per l'ingresso dell'HBV, l'ingresso mirato all'HBV può essere clinicamente tradotto per ridurre l'infezione de novo , la trasmissione madre-figlio (MTCT) e la recidiva dopo trapianto di fegato. Interrompere l'ingr.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di relazioni commerciali o finanziarie che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Questo progetto di ricerca è supportato dalla Mahidol University e dalla Thailand Science Research and Innovation (TSRI) assegnati separatamente ad A. Wongkajornsilp e K. Sa-ngiamsuntorn. Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dall'Office of National Higher Education Science Research and Innovation Policy Council attraverso il Program Management Unit for Competitiveness (numero di sovvenzione C10F630093). A. Wongkajornsilp ha ricevuto una borsa di studio Chalermprakiat della Facoltà di Medicina Siriraj Hospital, Mahidol University. Gli autori desiderano ringraziare Miss Sawinee Seemakhan (Excellent Center for Drug Discovery, Faculty of Science, Mahidol Unive....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Linee cellulari | |||
| HepaRG Cellule, crioconservate | Thermo Fisher Scientific | HPRGC10 | |
| Hep-G2/2.2.15 Linea cellulare di epatoblastoma umano | Merck | SCC249 | |
| Reagents | |||
| 4% Soluzione tampone di fosfato di paraformadeide | FUJIFLIM Wako chimico | 163-20145 | |
| BD Perm/Wash buffer | BD Biosciences | 554723 | Perm/Wash buffer |
| Ciclosporina A | abcam | 59865-13-3 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | 8 mM |
| G 418 sale disolfato | Merck | 108321-42-2 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail Senza EDTA (100x) | Thermo Scientific | 78425 | |
| HEPES | Merck | 7365-45-9 | |
| illustraTM RNAspin Kit di isolamento per mini RNA | GE Healthcare | 25-0500-71 | |
| illustra RNAspin Mini kit di isolamento per RNA | GE Healthcare | 25-0500-71 | |
| Sistema di trascrizione inversa ImProm-II | Promega | A3800 | |
| KAPA SYBR Kit qPCR VELOCE | Kapa Biosystems | KK4600 | |
| Concentratore Lenti-X | Concentratore Takara bio | PT4421-2 | |
| Substrato HRP occidentale Substrato | Merck | WBLUR0100 | |
| Master Mix (2x) Universal | Kapa Biosystems | KK4600 | |
| Kit di estrazione del DNA Nucleospin | macherey-nagel | 1806/003 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato | Merck | P3813 | |
| Polietilenglicole 8000 | Merck | 25322-68-3 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo scientific | P36930 | |
| Clone di nuvola | NTCP ricombinante | RPE421Hu02 | |
| RIPA Lysis Buffer (10x) | Merck | 20-188 | |
| TCA | Sigma | 345909-26-4 | |
| Kit TCA Elisa | Mybiosource | MB2033685 | |
| Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| Tripsina-EDTA | Gibco | 25200072 | Diluire allo 0,125% |
| Anticorpi | |||
| Anticorpo anti-NTCP1 | Abcam | ab131084 | diluizione 1:100 |
| Anticorpo anti-GAPDH | Thermo Fisher Scientific | AM4300 | diluizione 1:200.000 |
| Anticorpo anti-coniglio di capra coniugato HRP | Abcam | ab205718 | diluizione 1:10.000 |
| HRP capra anticorpo secondario di topo | Abcam | ab97023 | diluizione 1:10.000 |
| Anticorpo secondario IgG anti-coniglio di capra, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | diluizione 1:500 |
| Composizione del reagente | |||
| 1° Tampone di diluizione anticorpale | |||
| 1x TBST& | |||
| nbsp; 3% BSA | Sigma | A7906-100G | Concentrazione di lavoro: 3% |
| Sodio azide | Sigma | 199931 | Concentrazione di lavoro: 0,05% |
| Epatocita Media di crescita | |||
| DME/F12 | Gibco | 12400-024 | |
| 10% FBS | Sigma Aldrich | F7524 | |
| 1% Pen/Strep | HyClon | SV30010 | |
| 1% GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| Maturazione epatica media | |||
| La E medio | Sigma Aldrich | W4125-1L | |
| 10% FBS | Sigma Aldrich | F7524 | |
| 1% Pen/Strep | HyClon | SV30010 | |
| 1% GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| 5 µ g/mL Insulina | Sigma Aldrich | 91077C-100MG | |
| 50 µ M idrocotisone | Sigma Aldrich | H0888-1g | |
| 2% DMSO | PanReac AppliChem | A3672-250ml | |
| IF Soluzione bloccante | |||
| 1x | PBS Gibco | 21300-058 | |
| 3% BSA | Sigma | A7906-100G | Concentrazione di lavoro: 3% |
| 0,2% Triton X-100 | Sigma | T8787 | Concentrazione di lavoro: 0,2% |
| RIPA Soluzione tampone di lisi | Merck | 20-188 | Concentrazione finale: 1X |
| Cocktail di inibitori della proteasi | Thermo Scientific | 78425 | Concentrazione finale: 1X |
| Na3VO4 | Concentrazione finale: 1 mM | ||
| PMSF | Concentrazione finale: 1 mM | ||
| NaF | Concentrazione finale: 10 mM | ||
| Western blot reagent | |||
| 10x Soluzione salina tamponata con Tris (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Concentrazione finale: 1X |
| Interpolazione 20 | Merck | 9005-64-5 | |
| 1x TBST | 0,1% Tween 20 | ||
| 1x | PBS Gibco | 21300-058 | |
| Kit per il dosaggio delle proteine BCA Pierce | Thermo Fisher Scientific | A53225 | |
| Gel di poliacrilammide | Bio-Rad | 161-0183 | |
| Persolfato di ammonio (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | Concentrazione finale: 0,05% |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | Stacker gel: 0,1%, Resolver gel: 0,05% |
| 2x tampone per campioni Laemmli | Bio-Rad | 161-0737 | Concentrazione finale: 1X |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 161-0374 | |
| WB Soluzione bloccante/ 2° Tampone di diluizione anticorpale | |||
| 1x TBST& | |||
| nbsp; 5% Latte scremato (latte scremato in polvere) | Bio-Rad | 170-6404 | Concentrazione di lavoro: 5% |
| 1x Tampone di corsa 1 L | |||
| 10x Soluzione salina tamponata con Tris (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Concentrazione finale: 1X |
| Glicina | Sigma | G8898 | 14,4 g |
| SDS | Merck | 7910 | Concentrazione di lavoro: 0,1% |
| Tampone di trasferimento Blot 500 mL | |||
| 10x Soluzione salina tamponata con Tris (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Concentrazione finale: 1X |
| Glicina | Sigma | G8898 | 7,2 g |
| Metanolo | Merck | 106009 | 100 mL |
| Soluzione di strippaggio delicato 1 L | Regolare il pH a 2,2 | ||
| Glicina | Sigma | G8898 | 15 g |
| Scheda di sicurezza | Merck | 7910 | 1 g |
| Tween 20 | Merck | 9005-64-5 | 10 mL |
| Equipments | |||
| 15 mL provetta da centrifuga | Corning | 430052 | |
| 50 mL Provetta da centrifuga | Corning | 430291 | |
| Airstream Classe II | Esco | 2010621 | Armadio di sicurezza biologica |
| CelCulture CO2 | Esco | 2170002 | Incubatore per colture tissutali umidificate |
| CFX96 Touch Rivelatore PCR in tempo reale | Bio-Rad | 1855196 | |
| FACSVerse Flow Cytometer | BD Biosciences | 651154 | |
| Pipette graduate (10 mL) | Jet Biofil | GSP010010 | |
| Pipette graduate (5 mL) | Jet Biofil | GSP010005 | |
| MicroCal PEAQ-ITC | Calorimetri di titolazione isotermici | Malvern | |
| Mini PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | Camera di elettroforesi |
| Mini Trans-blot carta da filtro assorbente | Bio-Rad | 1703932 | |
| Omega Lum G Imaging System | Aplegen | 8418-10-0005 | |
| Pipetta controller | Eppendorf | 4430000.018 | Easypet 3 |
| PowerPac HC | Bio-Rad | 1645052 | Alimentatore |
| Membrana PVDF | Merck | IPVH00010 | |
| T-75 pallone per colture cellulari | Corning | 431464U | |
| Trans-Blot SD Cella di trasferimento semi-secca | Bio-Rad | 1703940 | Cella di trasferimento semi-secca |
| Processore ad ultrasuoni (Vibra-Cell VCX 130) | Sonics & Materiali | ||
| Centrifuga refrigerata da tavolo Versati Centrifuga | Esco | T1000R | con rotante a secchiello oscillante |
Riferimenti
- Levrero, M., Zucman-Rossi, J. Mechanisms of HBV-induced hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 64 (1), 84-101 (2016).
- Kim, K. -H., Kim, N. D., Seong, B. -L. Discovery and development of anti-HBV agents and their resistance. Molecules. 15 (9), 5878-5908 (20....
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Ristampe e permessi
