Articolo metodologico

Isolamento e identificazione delle cellule staminali mesenchimali del midollo osseo suino e delle loro vescicole extracellulari derivate

DOI:

10.3791/63785

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22 aprile 2022

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1State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Fuwai Hospital, National Center for Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College, 2State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Center for Cardiovascular Experimental Study and Evaluation, National Center for Cardiovascular Diseases, Beijing Key Laboratory of Pre-clinical Research and Evaluation for Cardiovascular Implant Materials, Animal Experimental Center, Fuwai Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 3State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Department of Cardiology, Fuwai Hospital, National Center for Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College

In questo articolo

Sommario

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Questo articolo elabora un metodo per isolare e identificare le cellule staminali mesenchimali del midollo osseo suino (pBM-MSC) e le vescicole extracellulari (EV) da esse derivate, fornendo una base metodologica per la valutazione preclinica dell'efficacia del trapianto di BM-MSC e delle loro EV derivate.

Abstract

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Con lo sviluppo della terapia con cellule staminali nella ricerca traslazionale e nella medicina rigenerativa, le cellule staminali mesenchimali del midollo osseo (BM-MSC), come una sorta di cellule staminali pluripotenti, sono favorite per la loro disponibilità immediata e la comprovata sicurezza. È stato riportato che il trapianto di BM-MSC è di grande beneficio per la riparazione dei tessuti danneggiati in varie malattie, il che potrebbe essere correlato alla modulazione delle risposte immunitarie e infiammatorie attraverso meccanismi paracrini. Le vescicole extracellulari (EV), caratterizzate da una struttura di membrana lipidica a doppio strato, sono considerate i principali mediatori degli effetti paracrini delle cellule staminali. Riconosciute per il loro ruolo cruciale nella comunicazione cellulare e nella regolazione epigenetica, le vescicole extracellulari sono già state applicate in vivo per l'immunoterapia. Tuttavia, come per le sue cellule materne, la maggior parte degli studi sull'efficacia del trapianto di vescicole extracellulari rimane ancora a livello di piccoli animali, il che non è sufficiente a fornire prove essenziali per la traduzione clinica. Qui, utilizziamo la centrifugazione a gradiente di densità per isolare inizialmente le cellule del midollo osseo (BMC) dal midollo osseo suino e successivamente otteniamo BM-MSC suine (pBM-MSC) mediante coltura cellulare, identificate dai risultati dell'osservazione al microscopio, del saggio di differenziazione indotta e della citometria a flusso. Inoltre, isoliamo con successo le vescicole extracellulari derivate da pBM-MSC in surnatante cellulare mediante ultracentrifugazione, come dimostrato dalle tecniche di microscopia elettronica a trasmissione (TEM), analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) e western blotting. Nel complesso, le pBM-MSC e le loro vescicole extracellulari derivate possono essere isolate e identificate efficacemente dai seguenti protocolli, che potrebbero essere ampiamente utilizzati negli studi preclinici sull'efficacia del trapianto di BM-MSC e delle loro vescicole extracellulari derivate.

Introduzione

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Negli ultimi 10 anni, la terapia con cellule staminali ha promesso grandi benefici per i pazienti che soffrono di una varietà di malattie e lesioni, come traumi, malattie respiratorie e cardiovascolari. Con i progressi nel campo, le cellule staminali mesenchimali del midollo osseo (BM-MSC) vengono gradualmente favorite dalle persone per la loro accessibilità e poche controversie etiche1, che sono state considerate il gold standard per la ricerca clinica nonostante altri tipi di cellule2. Le terapie basate sulle BM-MSC sono anche attraenti per un numero sempre maggiore di ricercatori grazie alla loro capacità unica di modulare le risposte immunitarie e infiammatorie e riparare i tessuti danneggiati attraverso meccanismi di differenziazione o paracrini3.

Le vescicole extracellulari (EV), come sostiene l'International Society for Extracellular Vesicles (ISEV), si riferiscono alle particelle totali con una struttura a doppio strato lipidico che vengono rilasciate naturalmente dalle cellule. Con le recenti scoperte di vari contenuti come proteine, lipidi e materiali genetici (ad esempio, miRNA, mRNA, molecole di DNA, così come lunghi RNA non codificanti) in vescicole extracellulari di diversi tipi di cellule5, è stato riconosciuto il loro ruolo cruciale nella comunicazione cellulare e nella regolazione epigenetica6. Come nuovo sostituto delle cellule materne, le vescicole extracellulari sono state applicate nell'immunoterapia e nella medicina rigenerativa con studi in vivo, che fungono da base per la ricerca preclinica in corso e gli studi clinici di follow-up7.

Tuttavia, allo stato attuale, la maggior parte degli studi sull'efficacia del trapianto di BM-MSC e delle loro EV derivate rimangono ancora al livello dei piccoli animali, il che non è sufficiente a fornire le prove necessarie per la traduzione clinica. Di conseguenza, è estremamente urgente condurre ricerche precliniche sul trapianto di BM-MSC e delle loro vescicole extracellulari derivate a livello di animali di grandi dimensioni come i suini.

È stato riportato che le MSC sono presenti in numero estremamente basso nel midollo osseo, rappresentando solo lo 0,01% allo 0,001% delle cellule totali8. Tuttavia, la somministrazione preclinica di BM-MSC richiede un gran numero di cellule (≥107 per animale)9; la quantità di EV richiesta è ancora maggiore, la cui dose mediana è di 0,25 mg di proteine per chilogrammo di peso corporeo nei suini10. Per raggiungere questi grandi numeri, c'è un urgente bisogno di un metodo sicuro ed efficace per isolare e coltivare le MSC dal midollo osseo suino per ottenere la loro massiccia espansione in vitro e acquisire successivamente le loro EV con un'alta concentrazione proteica.

Finora, esistono vari metodi per isolare le BM-MSC e le loro vescicole extracellulari derivate. Gli attuali metodi per isolare le BM-MSC includono l'impianto diretto di cellule del midollo osseo (BMC)11, la centrifugazione a gradiente di densità, lo smistamento delle etichette molecolari sulla superficie cellulare e lo screening con citometria a flusso. È stato riportato che lo smistamento delle marcature molecolari sulla superficie cellulare e lo screening della citometria a flusso determinano una diminuzione del tasso di adesione cellulare, un aumento della mortalità nelle 24 ore e l'inibizione della proliferazione12, mentre la coltura diretta di BMC può portare a un elevato numero di cellule ematopoietiche miste. Pertanto, la centrifugazione a gradiente di densità è ora comunemente utilizzata per ottenere BM-MSC. Gli attuali metodi per isolare le vescicole extracellulari dai surnatanti cellulari includono l'ultracentrifugazione, l'ultrafiltrazione, la precipitazione di polimeri e l'esclusione dimensionale13. Rispetto ad altri metodi, l'ultracentrifugazione presenta il vantaggio del basso costo, della facilità d'uso e della compatibilità con la preparazione di grandi volumi senza complicati pretrattamenti, che è stato il "gold standard" per la separazione delle vescicole extracellulari14. Tuttavia, esiste una grande eterogeneità nei reagenti e nelle tecniche tra i diversi laboratori durante il processo 3,15, il che potrebbe essere fuorviante per i lettori. Questo articolo spiega in dettaglio una serie di passaggi sequenziali per isolare le pBM-MSC e le vescicole extracellulari da esse derivate, e i successivi risultati dell'identificazione dimostrano che il metodo è fattibile per ottenere pBM-MSC e le loro vescicole extracellulari per ulteriori analisi nella ricerca preclinica. Ci auguriamo che questo lavoro sistematico possa fornire una base metodologica per i ricercatori impegnati nella valutazione pre-clinica del trapianto di pBM-MSC e delle loro vescicole extracellulari derivate, in modo che gli studi clinici possano essere condotti il prima possibile.

Protocollo

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Secondo la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio pubblicata dal National Institutes of Health, USA, tutte le procedure sperimentali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), Fuwai Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences.

1. Preparazione preoperatoria per gli animali

  1. Procuratevi dei maialini cinesi maschi adulti (30 ± 5 kg) a circa 12 mesi di età dall'Istituto di Zoologia, Accademia Cinese delle Scienze, e ospitateli nelle strutture del Centro Sperimentale Animale, Ospedale Fuwai, con almeno 2 settimane di anticipo. Effettuare ispezioni preoperatorie, come esami del sangue di routine, per assicurarsi che gli animali siano sani.
  2. Pulire e radere la pelle della zona della coscia del maialino il giorno prima dell'operazione. Per evitare l'aspirazione, digiunare il maialino per 12 ore prima dell'estrazione del midollo osseo.

2. Preparazione per l'isolamento e la coltivazione cellulare

  1. Utilizzare Percoll (1,130 g/mL) per isolare le cellule staminali mesenchimali dal midollo osseo. Miscelare la soluzione madre con 10x PBS concentrato in un rapporto di 9:1 per ottenere un mezzo isotonico. Quindi miscelare il terreno isotonico con PBS in un rapporto di 3:2 per acquisire una soluzione di Percoll al 60% (1,077 g/mL), che può essere utilizzata come soluzione di separazione finale per isolare le pBM-MSC.
  2. Preparare il terreno di Dulbecco modificato (IMDM) di Iscove con il 10% di siero fetale bovino e l'1,0% di penicillina-streptomicina per ottenere un terreno completo. Preriscaldare l'intero terreno e il PBS in un bagno d'acqua a 37 °C per la successiva coltura cellulare.

3. Anestetizzazione per gli animali

  1. Somministrare l'anestesia generale con ketamina (10 mg/kg) e xilazina (2 mg/kg) per via intramuscolare. Eseguire rapidamente l'intubazione endotracheale quando il maialino ha una respirazione lenta e una minore attività degli arti e preservare la respirazione spontanea per evitare l'intubazione fallita.
  2. Eseguire il mantenimento dell'anestesia per inalazione di isoflurano al 2%, con ossigeno (1,5 L/min) come gas di trasporto. Durante l'anestesia, monitorare la frequenza cardiaca, la respirazione e la saturazione di ossigeno nel sangue del maialino in tempo reale.

4. Estrazione del midollo osseo dal maialino

  1. Posizionare il maialino in posizione laterale. Per garantire una quantità sufficiente di midollo osseo per la successiva coltura cellulare, individuare il punto di puntura del midollo osseo nel femore prossimale del maialino (Figura 1). Disinfettare e drappeggiare la pelle dell'area di puntura prima dell'applicazione dell'operazione.
  2. Stringere la pelle attorno al punto di puntura con la mano non dominante e perforare verticalmente l'ago per biopsia del midollo osseo nel punto con la mano dominante. Quando si sente l'ago a contatto con l'osso corticale, ruotare delicatamente l'impugnatura a sinistra e a destra per perforare l'ago. Quando l'ago entra nella cavità del midollo osseo, c'è spesso la sensazione di perdere resistenza.
  3. Dopo che la puntura è in posizione, estrarre l'ago centrale. Quindi collegare una siringa sterile monouso da 50 ml all'estremità dell'ago esterno e sciacquare preventivamente la parete interna della siringa con eparina.
  4. Estrarre lentamente 20 ml di midollo osseo e trasferirli con cura in una provetta da centrifuga sterile da 50 ml.
  5. Al termine della procedura, estrarre l'ago e rimuovere il telo. Disinfettare il sito di puntura e premerlo per 20 minuti per l'emostasi.
  6. Estubare il maialino dopo aver ripristinato la respirazione spontanea. Quando è completamente sveglio con il libero movimento degli arti, rimetti il maialino nella gabbia per continuare a nutrirsi.

5. Isolamento delle cellule staminali mesenchimali dal midollo osseo

  1. Aggiungere un volume uguale di PBS preriscaldato al midollo osseo e mescolarli accuratamente. Quindi, utilizzare una pipetta sterile per trasferire con cautela 20 mL di midollo osseo diluito al di sopra del livello di soluzione con gradiente di densità del 60% in un rapporto volume 1:1 in una provetta da centrifuga sterile da 50 mL.
  2. Centrifugare la provetta a 600 x g (accelerazione (ACC) = 5, decelerazione (DEC) = 5) per 20 minuti a temperatura ambiente (RT).
    NOTA: Dopo la centrifugazione, nella provetta si formano quattro fasi, tra cui la fase sierica, la fase di cellula mononucleata, la fase di mezzo a gradiente di densità e la fase di precipitazione dall'alto verso il basso. La fase cellulare mononucleata è un sottile strato flocculante tra il siero e il mezzo di gradiente di densità. In questa fase si trovano le cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo.
  3. Aspirare la fase di cella mononucleata in una provetta da centrifuga sterile da 15 ml e lavare due volte con PBS a 800 x g per 5 minuti.
  4. Risospendere le cellule lavate in 2 mL di terreno completo e piantare le cellule risospese in un pallone di coltura cellulare da 175 cm2 a una densità di 3-5 x 105/mL.
    NOTA: Tutte le procedure di cui sopra per isolare le cellule staminali mesenchimali possono essere viste nella Figura 2.

6. Coltivazione di cellule staminali mesenchimali in vitro

  1. Incubare il pallone di coltura a 37 °C in un'atmosfera satura e umidificata con una quantità di CO2 al 5%. Agitare delicatamente il pallone di coltura ogni 24 ore per prevenire la crescita aderente delle cellule staminali ematopoietiche precipitate e osservare la crescita, la morfologia e la contaminazione cellulare al microscopio.
  2. Sostituire il terreno di coltura per la prima volta dopo 3 giorni, quindi sostituire il terreno ogni 2-3 giorni. Quando le colonie cellulari raggiungono l'80%-90% di confluenza, sottocolture le cellule con un rapporto di 1:2.

7. Differenziamento adipogenico, osteogenico e condrogenico delle pBM-MSC

  1. Saggio di differenziazione adipogenica
    1. Preparare il terreno di differenziazione adipogenica A (Medium A) e B (Medium B) per le BM-MSC secondo le istruzioni del kit. Informazioni specifiche sul kit sono disponibili nella Tabella dei materiali.
    2. Aggiungere 1 mL di gelatina allo 0,1% alla piastra a sei pozzetti e agitare delicatamente in modo che possa coprire uniformemente il fondo di ciascun pozzetto. Quindi posizionare la piastra a sei pozzetti in un banco pulito o in un'incubatrice a CO2 per almeno 30 minuti.
    3. Dopo 30 minuti, aspirare la gelatina e aggiungere 2 ml di terreno completo generale a ciascun pozzetto. Quindi piantare le pBM-MSC nella piastra a sei pozzetti a una densità cellulare di 2 x 104 cellule/cm2. Successivamente, incubare la piastra a 37 °C in un'umidità satura del 5% di CO2.
    4. Quando le cellule raggiungono il 100% di confluenza, rimuovere con cura l'intero terreno e aggiungere 2 mL di terreno A a ciascun pozzetto della piastra. Dopo 3 giorni, rimuovere il terreno A dalla piastra e aggiungere 2 ml di terreno B a ciascun pozzetto.
    5. Dopo aver mantenuto per 1 giorno, rimuovere il terreno B e sostituirlo con il mezzo A per induzione. Secondo il metodo di "Medio A per 3 giorni, Medio B per 1 giorno", utilizzare il mezzo A e B in sequenza per l'induzione.
    6. Osservare lo stato della cella ogni giorno durante il periodo. Se le cellule si restringono o muoiono durante il processo di induzione del terreno A, sostituirlo con il mezzo B in tempo fino a quando lo stato della cella non si riprende.
    7. Ripetere il processo di induzione e mantenimento e prepararsi alla colorazione quando al microscopio si osservano goccioline lipidiche sufficienti di dimensioni adeguate.
    8. Rimuovere il terreno per la differenziazione adipogenica nella piastra a sei pozzetti e lavare delicatamente con 1x PBS. Aggiungere 2 mL di soluzione di paraformaldeide al 4% in ciascun pozzetto e fissare per 30 minuti a RT.
    9. Rimuovere il fissativo paraformaldeide e lavare con 1x PBS due o tre volte per assicurarsi che il fissativo venga rimosso completamente. Aggiungere 2 ml di colorante Oil Red O a ciascun pozzetto e colorare per 30 minuti a RT.
    10. Rimuovere il colorante Oil Red O e lavare con 1x PBS due o tre volte. Aggiungere 2 mL di PBS 1x a ciascun pozzetto, quindi osservare l'effetto della differenziazione adipogenica al microscopio.
  2. Saggio di differenziazione osteogenica
    1. Preparare il terreno completo per la differenziazione osteogenica secondo le istruzioni del kit.
    2. Seguire i passaggi 7.1.2-7.1.3 per piantare e coltivare pBM-MSC.
    3. Quando le cellule raggiungono il 70% di confluenza, rimuovere con cura il terreno completo generale e aggiungere 2 mL di terreno per la differenziazione osteogenica a ciascun pozzetto della piastra.
    4. Passare al terreno di differenziazione osteogenico fresco ogni 3 giorni. Continua l'induzione per 2-4 settimane e preparati a colorare con il colorante rosso alizarina quando compaiono evidenti noduli di calcio durante l'osteogenesi.
    5. Rimuovere il terreno per la differenziazione osteogenica nella piastra a sei pozzetti e lavare delicatamente con 1x PBS. Aggiungere 2 mL di soluzione di paraformaldeide al 4% in ciascun pozzetto e fissare per 30 minuti a RT.
    6. Rimuovere il fissativo paraformaldeide e lavare con 1x PBS due o tre volte per assicurarsi che il fissativo sia pulito accuratamente. Aggiungere 2 ml di colorante rosso di alizarina in ogni pozzetto e colorare per 10 minuti a RT.
    7. Rimuovere il colorante rosso alizarina e lavare con 1x PBS due o tre volte. Aggiungere 2 mL di PBS 1x a ciascun pozzetto, quindi osservare l'effetto della differenziazione osteogenica al microscopio.
  3. Saggio di differenziazione condrogenica
    1. Preparare la premiscela per la differenziazione condrogenica secondo le istruzioni del kit.
    2. Trasferire 3-4 x 105 pBM-MSC in una provetta da centrifuga sterile da 15 mL. Centrifugare a 250 x g per 4 min a 20 °C.
    3. Rimuovere il surnatante e aggiungere 0,5 mL di premiscela per risospendere il pellet ottenuto dalla centrifugazione nel passaggio precedente, quindi centrifugare a 150 x g per 5 min a 20 °C. Ripetere questo passaggio per lavare nuovamente le cellule.
    4. Preparare il terreno completo per la differenziazione condrogenica.
    5. Risospendere la cella ottenuta nel passaggio precedente con 0,5 mL di terreno completo e centrifugare a 150 x g per 5 min a 20 °C.
    6. Svitare il tappo della provetta da centrifuga per facilitare lo scambio di gas. Posizionarlo in posizione verticale in un'incubatrice a 37 °C, 5% di CO2 e umidità satura.
    7. Quando le cellule sembrano aggregarsi (di solito dopo 24-48 ore, a seconda della situazione reale), muovi il fondo del tubo da centrifuga per fare in modo che le sfere di cartilagine si stacchino dal fondo e si sospendano nel mezzo.
    8. Passare a un terreno completo fresco per la differenziazione condrogenica ogni 2-3 giorni. Continuare l'induzione fino a formare nel tubo sfere di cartilagine con un diametro di 1,5-2 mm, quindi preparare le sezioni per la colorazione.
    9. Preparare sezioni di paraffina di palline di cartilagine secondo le fasi di routine degli esperimenti patologici. Aggiungere il colorante blu Alicia alle sezioni decerate e colorare a 37 °C per 1 ora.
    10. Sciacquare il vetrino con acqua corrente per 5 minuti, quindi osservare l'effetto di colorazione di Alicia blue al microscopio dopo l'asciugatura.

8. Identificazione del fenotipo cellulare mediante citometria a flusso

  1. Quando le colonie cellulari raggiungono l'80%-90% di confluenza ai passaggi 3-5, rimuovere il terreno di coltura e lavare le cellule due volte con PBS preriscaldato. Quindi digerire le cellule con 3-4 mL di tripsina/EDTA allo 0,25% e incubarle a 37 °C in un'atmosfera umidificata satura di CO2 al 5% per 2-3 minuti fino a quando non vengono staccate dal fondo del pallone al microscopio.
  2. Raccogliere le cellule con un terreno completo da 10 mL e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga sterile da 15 mL. Centrifugare la sospensione cellulare a 800 x g per 5 minuti a RT. Scartare il surnatante e lavare le cellule con PBS a 4 °C.
  3. Risospendere le cellule a 10 mL con PBS a 4 °C. La sospensione cellulare è divisa in nove gruppi con un volume di 1 mL in ciascuna microprovetta da 1,5 mL, denominati rispettivamente controllo negativo, controllo isotipo FITC, controllo isotipo PE, controllo isotipo APC, gruppo CD105, CD29, CD90, CD14 e CD45. Assicurarsi che il numero di cellule in ciascuna microprovetta sia compreso tra 1 x 105 e 1 x 106.
  4. Centrifugare la sospensione a 800 x g per 5 minuti a 4 °C e risospendere le cellule in ciascuna microprovetta con 100 μl di PBS a 4 °C. Fatta eccezione per il gruppo di controllo negativo, aggiungere 5 μl del corrispondente controllo isotipico (FITC, PE e APC Mouse IgG1 kappa Isotype Control) e degli anticorpi (CD105, CD29, CD90, CD14 e CD45 Monoclonal Antibody) per la citometria a flusso a ciascuna microprovetta secondo l'ordine del passaggio 8.3. Mescolare delicatamente e incubare per 1,5 ore a 4 °C al buio.
  5. Aggiungere 1 mL di PBS a 4 °C in ciascuna microprovetta e centrifugare a 300 x g per 10 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e aggiungere 200 μl di PBS a 4 °C per risospendere le cellule.
  6. Testare almeno 10.000 cellule sulla citometria a flusso dopo aver filtrato la sospensione cellulare16 e analizzare i dati utilizzando il software di citometria a flusso.

9. Isolamento di vescicole extracellulari (EV) derivate da cellule staminali mesenchimali del midollo osseo suino

  1. Quando la confluenza pBM-MSCs raggiunge l'80%-90%, scartare il surnatante e lavare le celle con PBS 2x. Quindi aggiungere 25 mL di IMDM senza siero a ciascun pallone di coltura e continuare a incubare a 37 °C in un'atmosfera umidificata al 5% di CO2 per 48 ore.
  2. Raccogliere il surnatante cellulare (terreno condizionato, CM) in una provetta da centrifuga da 50 mL e centrifugare a 300 x g per 10 minuti a 4 °C per rimuovere i detriti cellulari.
  3. Raccogliere nuovamente il surnatante in un'altra provetta da centrifuga da 50 ml. Effettuare l'isolamento delle vescicole extracellulari il prima possibile dopo aver raccolto il surnatante. Per la conservazione a lungo termine, conservare il surnatante in frigorifero a -80 °C per evitare la perdita di vescicole extracellulari.
  4. Centrifugare il surnatante al punto 9.3 a 2.000 x g per 20 minuti a 4 °C.
  5. Trasferire il surnatante in una provetta sterile utilizzata per centrifughe ad alta velocità e centrifugare a 16.500 x g per 30 minuti a 4 °C.
  6. Trasferire nuovamente il surnatante in una provetta per ultracentrifuga e centrifugare a 120.000 x g per almeno 70 minuti a 4 °C, con un rotore ad angolo fisso.
  7. Scartare completamente il surnatante. Aggiungere 1 mL di PBS a 4 °C in ciascuna provetta per ultracentrifuga e risospendere la precipitazione con una micropipetta. Mescolare la soluzione dello stesso gruppo in una provetta per ultracentrifuga, quindi aggiungere 4 °C di PBS per rendere il volume superiore a 3/4 della provetta.
  8. Centrifugare a 120.000 x g per 60 min a 4 °C e rimuovere il surnatante il più possibile.
  9. Risospendere nuovamente il precipitante con PBS sterile e conservare le EV in un frigorifero a -80 °C.
    NOTA: La quantità di PBS per la risospensione può essere determinata come 100 μl per la precipitazione da ogni due matracci di coltura da 175 cm2 . Tutti i passaggi precedenti per l'isolamento delle vescicole extracellulari sono mostrati sistematicamente nella Figura 3 .

10. Identificazione delle vescicole extracellulari mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM), analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) e western blotting

  1. Posizionare il campione di EVs su ghiaccio dopo averlo scongelato in un bagno d'acqua a 25 °C, quindi diluire a metà della concentrazione precedente con PBS per il rilevamento NTA17.
  2. Pipettare 10 μl del campione sulla rete di rame, lasciarlo riposare per 1 minuto e assorbire il liquido galleggiante con carta da filtro. Quindi, aggiungere 10 μl di acido fosfotungstico alla rete di rame, lasciarla riposare per 1 minuto e assorbire il liquido in eccesso.
  3. Dopo l'essiccazione per alcuni minuti a RT, eseguire l'imaging al microscopio elettronico in condizioni di 100 KV di accelerazione della tensione18.
  4. Risospendere il campione di EVs dal passaggio 9.9 nel tampone di lisi RIPA (25 mM Tris· HCl (pH 7,6), 150 mM di cloruro di sodio [NaCl], 1% di nonil fenossipolietossiletanolo (NP-40), 1% di desossicolato di sodio, 0,1% di dodecil solfato di sodio (SDS), 1 mM di fenilmetansulfonilfluoruro (PMSF), 1x inibitore della proteasi) e rilevare l'espressione di marcatori specifici per le vescicole extracellulari come Alix, TSG101, CD81 e CD63 mediante western blotting19.

Risultati

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Insediamento di cellule staminali mesenchimali del midollo osseo suino
Le cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo suino sono state isolate e coltivate con successo in vitro, e la morfologia delle pBM-MSC in giorni diversi può essere vista nella Figura 4. Nella coltura primaria di pBM-MSC, l'osservazione microscopica ha mostrato che l'adesione cellulare si verificava un giorno dopo l'impianto e le cellule aderenti erano solitamente di forma rotonda. Le pBM-MSC primarie generalmente rimanevano in fase di quiescenza per 3 giorni dopo la semina e la proliferazione cellulare iniziava il 4° giorno. La morfologia cellulare è cambiata da rotonda a fuso, multilaterale o a stella dopo la proliferazione, e i nuclei sono centrali, con doppi nucleoli in alcune cellule. Le colonie cellulari si sono formate 7-9 giorni dopo l'inizio della proliferazione cellulare e l'80%-90% di confluenza cellulare ha potuto essere raggiunto a 12-14 giorni. L'osservazione microscopica ha mostrato che le cellule aderenti crescevano come colonie sparse e si disponevano in uno schema vorticoso.

La proliferazione cellulare è stata significativamente accelerata dopo il passaggio e la confluenza dell'80%-90% potrebbe essere raggiunta in una settimana. La morfologia cellulare era omogenea a forma di fuso dal secondo passaggio, simile ai fibroblasti, con un rapporto lunghezza/larghezza di circa 2-3:1. Se le celle fossero differenziate, potrebbero apparire poligonali o a forma di stella. Dopo il passaggio, le cellule non crescevano più come colonie sparse, ma in modo uniforme e radiale in una disposizione parallela.

Identificazione del potenziale di differenziazione cellulare mediante colorazione
Nel saggio di differenziazione adipogenica, la colorazione con Oil Red O ha mostrato che attorno al nucleo apparivano goccioline lipidiche rotonde rosso-arancio di diverse dimensioni (Figura 5A); Nel saggio di differenziazione osteogenica, la colorazione con rosso alizarina ha mostrato noduli rossi sulla superficie cellulare (Figura 5B), causati dalla reazione cromatica con i sali di calcio depositati dagli osteoblasti differenziati dalle pBM-MSC. Nel test di differenziazione condrogenica, la colorazione blu di Alicia ha mostrato che l'intera sezione di tessuto era blu (Figura 5C), causata dalla colorazione del mucopolisaccaride endoacido nelle sfere di cartilagine.

Identificazione del fenotipo cellulare mediante citometria a flusso
Sono stati eseguiti saggi dei marcatori della superficie cellulare per creare un fenotipo di pBM-MSCs. Dai risultati della citometria a flusso (Figura 6), tre marcatori positivi come CD105, CD29 e CD90 sono stati espressi in modo significativo sulla superficie delle pBM-MSC, rappresentando rispettivamente il 96,5%, il 99,8% e il 92% (Figura 6A-C). Tuttavia, l'espressione di CD14 e CD45 era negativa (Figura 6D, E). Nel frattempo, i risultati dei corrispondenti controlli isotipici sono stati tutti negativi, cosa che è già stata sovrapposta nella figura, escludendo la possibilità di un legame non specifico degli anticorpi.

Identificazione di vescicole extracellulari derivate da pBM-MSC mediante NTA, TEM e western blotting
Il risultato dell'NTA ha mostrato che la dimensione media delle particelle era di 126,9 nm, che rientrava nell'intervallo delle vescicole extracellulari; inoltre, la concentrazione originale del campione di EVs era di 1,5 x 1010 particelle/mL e il valore accurato assegnato alla dimensione può essere trovato nella Figura 7A. Il diagramma della traiettoria delle particelle è mostrato nella Figura 7B, che illustra che le particelle erano in moto browniano irregolare. Inoltre, la vescicola discoidale, come la struttura classica delle vescicole extracellulari, potrebbe essere vista chiaramente al microscopio elettronico a ingrandimenti di 50.000x (Figura 7C). Inoltre, l'espressione di marcatori specifici per le vescicole extracellulari come Alix, TSG101, CD81 e CD63 è stata rilevata nel campione mediante western blotting (Figura 7D).

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Figura 1: Punto di puntura del midollo osseo del maialino. L'area rossa mostra il punto di puntura dell'estrazione del midollo osseo, situato al femore prossimale del maialino. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Isolamento di cellule staminali mesenchimali dal midollo osseo suino. Il processo di isolamento delle cellule staminali mesenchimali dal midollo osseo suino è mostrato nel diagramma di flusso e quattro fasi liquide sono illustrate chiaramente dopo la centrifugazione a gradiente di densità. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Isolamento delle vescicole extracellulari derivate da pBM-MSC. Il diagramma schematico mostra i passaggi specifici per isolare le vescicole extracellulari dal mezzo condizionato mediante ultracentrifugazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Caratteristiche morfologiche delle pBM-MSC in giorni diversi. Caratteristiche morfologiche simili delle pBM-MSC possono essere osservate il 3°, 5°, 7° e 9° giorno dopo la semina sotto il campo microscopico 100x, e le colonie cellulari si sono formate il 9° giorno. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5. Identificazione del potenziale di differenziazione di pBM-MSC mediante colorazione. (A) Saggio di differenziazione adipogenico, (B) osteogenico e (C) condrogenico di pBM-MSC, rispettivamente. Il potenziale di differenziazione delle pBM-MSC può essere identificato da questi risultati di colorazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6: Risultati dell'identificazione delle pBM-MSC mediante citometria a flusso. CD105, CD29 e CD90 sono espressi in modo significativo sulla superficie delle pBM-MSC, rappresentando rispettivamente il 96,5%, il 99,8% e il 92,0%, mentre l'espressione di CD14 e CD45 è negativa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 7: Risultati dell'identificazione delle vescicole extracellulari derivate da pBM-MSC in base alla morfologia e alla biologia molecolare. (A) risultato NTA delle vescicole extracellulari derivate da pBM-MSC, con grafico della distribuzione granulometrica e (B) diagramma della traiettoria delle particelle, rispettivamente; (C) Immagine TEM scattata con ingrandimenti di 50.000x e la freccia bianca mostra la struttura classica delle vescicole discoidi. (D) Espressione di marcatori specifici per le vescicole extracellulari mediante western blotting. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

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Il tradizionale punto di puntura del midollo osseo dei maialini era posizionato sulla cresta iliaca20. Sebbene sia facile da localizzare, la quantità di estrazione del midollo osseo è limitataa 21 (solo circa 5 mL in generale), quindi è difficile soddisfare il requisito di un gran numero di espansioni in vitro per il trapianto in vivo. In questo metodo, abbiamo riposizionato il punto di puntura del midollo osseo sul femore prossimale e da questo sito possono essere estratti almeno 20 mL di midollo osseo, garantendo una quantità sufficiente di pBM-MSC per la successiva coltura cellulare.

Le due principali soluzioni di separazione utilizzate per isolare le BM-MSC mediante centrifugazione a gradiente di densità sono Percoll e Ficoll. Percoll è composto da polivinilpirrolidone siliconato (PVP), che è un nuovo agente separatore centrifugo a gradiente di densità non tossico e non irritante. La bassa costante di diffusione di Percoll si traduce in un gradiente di densità relativamente stabile; Pertanto, una separazione soddisfacente delle celle può essere ottenuta in genere entro decine di minuti a basse forze centrifughe (200-1000 x g). Il metodo per l'isolamento delle pBM-MSC utilizzando Ficoll è stato riportato in precedenza21. Rispetto a Ficoll, Percoll è stato gradualmente utilizzato grazie ai suoi vantaggi di facile isopermeabilità, bassa viscosità, non tossicità e non causa aggregazione cellulare, che possono integrare i metodi esistenti per isolare le pBM-MSC.

Nell'isolamento e nella coltura delle pBM-MSC, alcuni passaggi critici non possono essere ignorati. In primo luogo, il successo della stratificazione di diverse fasi liquide dopo la centrifugazione in gradiente di densità è la chiave per isolare le pBM-MSC purificate. Le BM-MSC, come un tipo di cellule mononucleate del midollo osseo (BM-MNC), hanno un peso specifico simile a quello dei linfociti e dei monociti, intorno a 1,075 g/mL. La densità originale di Percoll è di 1,130 g/mL e per ottenere con successo lo strato cellulare contenente BM-MSC dopo la centrifugazione in gradiente di densità, la soluzione di separazione isotonica in gradiente di densità al 60% (1,077 g/mL) deve essere configurata in anticipo secondo la relazione densità-concentrazione di Percoll22. Inoltre, anche le condizioni di centrifugazione appropriate contribuiscono al successo della stratificazione. Considerando la bassa costante di diffusione di Percoll, abbiamo centrifugato il midollo osseo estratto a 600 x g per 20 minuti a livelli di accelerazione/decelerazione relativamente bassi (ACC = 5, DEC = 5), ottenendo un buon effetto di stratificazione. In secondo luogo, un'adeguata densità di impianto è essenziale anche per la coltura cellulare. Al fine di acquisire un numero sufficiente di MSC (di solito più di 107 per animale9) per il successivo trapianto, utilizziamo fiasche di coltura da 175 cm2 per la coltura cellulare. In uno studio precedente20, le BM-MNC ottenute sono state solitamente piantate in fiaschi di coltura per la coltivazione a una densità di 5 x 105/cm2. È stato riportato che dopo la centrifugazione in gradiente di densità, si possono ottenere 2-3 x 107 BM-MNC per ogni 5 mL di midollo osseo suino23. Quindi, in questo protocollo, si consiglia di piantare BM-MNC totali isolati da ogni 20 ml di midollo osseo suino in un pallone di coltura da 175 cm2 per una densità adeguata. In terzo luogo, le impurità dovrebbero essere evitate durante l'isolamento e la coltura delle pBM-MSC. Quando si aspira la fase di cella mononucleata, la pipetta non deve essere inserita nella fase Percoll in modo da non mescolarsi con il liquido di separazione. Inoltre, dopo 24 ore di impianto cellulare, il pallone di coltura deve essere agitato delicatamente per ridurre l'aderenza dei globuli rossi.

Durante il processo di ultracentrifugazione, alti livelli di aggregati proteici e di contaminazione lipoproteica attraverso questo metodo compromettono inevitabilmente la quantificazione e l'analisi funzionale delle EVs14. Al fine di ridurre il più possibile la contaminazione durante il processo, è necessario mantenere una profondità di 5 mm di liquido sul fondo ogni volta che si trasferisce il surnatante prima della fase di ultracentrifugazione. Nel frattempo, dopo la prima ultracentrifugazione, la risospensione del pellet in PBS sterile e quindi la ripetizione dell'ultracentrifugazione possono ridurre efficacemente la contaminazione da lipoproteine.

Sebbene la centrifugazione a gradiente di densità e l'ultracentrifugazione siano state ampiamente utilizzate rispettivamente nell'isolamento di BM-MSC e delle loro vescicole extracellulari derivate, queste due tecniche hanno anche i loro limiti. Da un lato, la tecnica Percoll è lunga e ingombrante, e la produzione di campioni di concentrato di midollo osseo tramite un dispositivo di concentrazione cellulare al letto del paziente è stata segnalata come metodo alternativo per isolare le MSC24. D'altra parte, il metodo dell'ultracentrifugazione richiede non solo tecnici altamente qualificati ma anche attrezzature costose; pertanto, l'applicazione combinata di due o più tecniche può presentare una strategia ragionevole per un isolamento più efficiente delle vescicole extracellulari25. Inoltre, anche l'identificazione delle pBM-MSC e delle loro vescicole extracellulari derivate deve essere migliorata. Ad esempio, secondo i criteri internazionali per la definizione delle MSC26, l'espressione di alcuni marcatori positivi o negativi, come CD73, CD34 e HLA-DR, è ancora assente dai risultati dell'identificazione dei fenotipi BM-MSC mediante citometria a flusso in questo studio. Inoltre, sebbene siano state adottate misure per evitare la contaminazione durante il processo di isolamento delle vescicole extracellulari, a causa delle limitazioni del nostro laboratorio, non siamo in grado di valutare la purezza del campione di vescicole extracellulari per migliorare il lavoro di follow-up.

Questo studio combina metodi per l'isolamento sequenziale di pBM-MSC e delle loro vescicole extracellulari derivate, come dimostrato dai successivi risultati di identificazione in modo sistematico. In particolare, abbiamo evidenziato le operazioni chiave in questa serie di passaggi, spiegando alcune condizioni sperimentali specifiche che possono risolvere in una certa misura il problema dell'eterogeneità esistente nei diversi laboratori durante questo processo. Questo lavoro metodico potrebbe essere ampiamente utilizzato in studi preclinici sull'efficacia del trapianto di BM-MSC e delle loro vescicole extracellulari derivate, che potrebbero fornire una base sperimentale con un livello sufficiente per la ricerca clinica.

Dichiarazioni

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Tutti gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

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Ringraziamo Yang Jianzhong e Wang Xuemin per il loro contributo all'operazione di estrazione del midollo osseo. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (CIFMS) [numero di sovvenzione 2016-I2M-1-009], National Natural Science Foundation of China (n. 82070307; n. 81874461).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Pallone per coltura cellulare da 175 cm2Thermo Fisher159910utilizzato per colture cellulari
0,25% Tripsina/EDTAThermo Fisher25200056utilizzato per digerire le cellule
Kit di differenziazione adipogenica per cellule staminali mesenchimali del midollo osseoOriCell  GUXMX-90031utilizzato per il test di differenziazione adipogenica
Anticorpo monoclonale AlixThermo FisherMA1-83977utilizzato per identificare le vescicole extracellulari (Evs) mediante western blotting
APC Mouse IgG1 kappa Isotype ControlThermo Fisher17-4714-42utilizzato per eliminare gli effetti della colorazione non specifica nella citometria a flusso
CD105 (Endoglin) Anticorpo monoclonaleThermo Fisher17-1057-42utilizzato per identificare le pBM-MSC mediante citometria a flusso
Anticorpo monoclonale CD14Thermo FisherMA1-82074utilizzato per identificare le pBM-MSC mediante citometria a flusso
Anticorpo monoclonale CD29/IGTB1Thermo FisherMA1-19458utilizzato per identificare le pBM-MSC mediante citometria a flusso
Anticorpo monoclonale CD45Thermo FisherMA5-28383utilizzato per identificare le pBM-MSC mediante citometria a flusso
Anticorpo monoclonale CD63Thermo Fisher10628Dutilizzato per identificare le vescicole extracellulari mediante western blotting
Anticorpo monoclonale CD81Thermo FisherMA5-13548utilizzato per identificare le vescicole extracellulari mediante western blotting
Anticorpo monoclonale CD90Thermo FisherA15794utilizzato per identificare le pBM-MSC mediante citometria a flusso
Kit di differenziazione condrogenica per cellule staminali mesenchimali del midollo osseo OriCellGUXMX-90041utilizzato per il saggio di differenziazione condrogenica
Siero fetale bovinoGibco10099141Cutilizzato per preparare il mezzo completo
FITC Mouse IgG1 kappa Isotype ControlThermo Fisher11-4714-42utilizzato per eliminare gli effetti della colorazione non specifica nella citometria a flusso
Citometria a flussoBDAccuri C6utilizzata per l'identificazione del fenotipo cellulare
Software FlowJoBDV10utilizzato per analizzare i dati della citometria a flusso
Provetta da centrifuga ad alta velocità (50 mL)Beckman357003utilizzato per la centrifugazione ad alta velocità
Medium GibcoDulbco modificato di IscoveC12440500BTutilizzato per la coltura cellulare
Centrifuga da pavimento ad alta velocità a bassa temperaturaAvantiJ-26XPIutilizzato per la centrifugazione ad alta velocità per ottenere un mezzo condizionato pulito
Nonil fenossipolietossiletanolo (NP-40)Sigma-AldrichNP40Sutilizzato per la composizione del tampone di lisi RIPA
Kit di differenziazione osteogenica per midollo osseo Cellule staminali mesenchimaliOriCellGUXMX-90021utilizzato per il saggio di differenziazione osteogenica
PE Mouse IgG1 kappa Controllo dell'isotipoThermo Fisher12-4714-42utilizzato per eliminare gli effetti della colorazione aspecifica nella citometria a flusso
PercollCytiva17089102utilizzato per isolare le cellule staminali mesenchimali del midollo osseo suino (pBM-MSCs)
Fenilmetanthansulfonilfluoruro (PMSF)Thermo Scientific36978utilizzato per la composizione del tampone di lisi RIPA
Soluzione salina tamponata con fosfato (10x)BeyotimeST476utilizzato per preparare il Percoll isotonico soluzione
Soluzione salina tamponata con fosfato (1x)CytivaAF29561133utilizzato per diluire Percoll e lavare le cellule
Inibitore della proteasi (1x)Thermo ScientificA32955utilizzato per la composizione del tampone di lisi RIPA
cloruro di sodioSigma-AldrichS9888utilizzato per la composizione del tampone di lisi RIPA
desossicolato di sodioSigma-AldrichD6750utilizzato per la composizione del tampone di lisi RIPA
dodecil solfato di sodio (SDS)Sigma-AldrichL3771utilizzato per la composizione del tampone di lisi RIPA
Microscopia elettronica a trasmissioneHitachiHT7700utilizzato per l'imaging in microscopia elettronica
Tris· HClSigma-Aldrich93363utilizzato per la composizione del tampone di lisi RIPA
TSG101 Anticorpo monoclonaleThermo FisherMA1-23296utilizzato per identificare le vescicole extracellulari mediante western blotting
Ultracentrifuga (rotore Tipo 50.2 Ti)Beckmanoptima L-100XPutilizzato per l'ultracentrifugazione per isolare gli esosomi Provetta
ultracentrifuga (26,3 mL)Beckman355654utilizzato per ultracentrifugazione
ZetaVIEWParticle MetrixS/N 17-310utilizzato per l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle
Il di per

Riferimenti

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