La microscopia a espansione per la conservazione delle etichette (LR-ExM) consente l'imaging a super-risoluzione e l'etichettatura ad alta efficienza

La microscopia ad espansione (ExM) è stata utilizzata dai ricercatori sin da quando è stata introdotta per la prima volta come approccio conveniente per ottenere immagini a super risoluzione con microscopi convenzionali, come l'epifluorescenza e i microscopi confocali 1,2,3,4,5,6,7 . Utilizzando ExM, è possibile raggiungere una risoluzione laterale di ~ 70 nm anche con normali microscopi confocali. Quando ExM è combinato con l'imaging a super-risoluzione, la risoluzione viene ulteriormente migliorata. Ad esempio, si può ottenere una risoluzione di circa 30 nm con la microscopia a illuminazione strutturata (SIM) e una risoluzione di circa 4 nm con la microscopia a ricostruzione ottica stocastica (STORM)^1,5.

Tuttavia, la bassa efficienza dell'etichettatura è un problema critico con i metodi ExM standard. La perdita di fluorescenza può variare in base al tipo di gruppi fluorescenti e al tempo di digestione. In media, tuttavia, è stato riportato che oltre il 50% dei fluorofori viene perso dopo la polimerizzazione e le fasi di digestione delle proteine di ExM, il che è dannoso per la qualità dell'imaging ^3,4.

Pertanto, è stata sviluppata la microscopia ad espansione per la conservazione delle etichette (LR-ExM), che può conservare in modo efficiente le etichette e ridurre la perdita di segnale¹. L'innovazione chiave di LR-ExM è l'uso di una serie di ancoraggi trifunzionali invece di utilizzare semplicemente coloranti fluorescenti - come nella procedura standard ExM - per colorare le proteine di interesse. Questi linker trifunzionali sono costituiti da tre parti: (1) il connettore (ad esempio, N-idrossisuccinimide (NHS)) per connettersi all'anticorpo, (2) l'ancora (ad esempio, metacrilammide (MA)) per ancorare le proteine al polimero e (3) il reporter (ad esempio, biotina o digossigenina (DIG)) per coniugare a un colorante organico. Le ancore trifunzionali sopravvivono alle fasi di polimerizzazione e digestione delle proteine, e quindi prevengono la perdita di fluorofori.

Inoltre, questo metodo ha un grande potenziale poiché è compatibile con tag enzimatici auto-etichettanti come SNAP o CLIP. Gli approcci di tag enzimatici hanno alcuni vantaggi rispetto all'approccio immunocolorante per quanto riguarda l'elevata specificità e l'efficienza di etichettatura ^8,9,10.

In questo manoscritto viene dimostrata una procedura dettagliata di LR-ExM. LR-ExM è un metodo altamente efficace e flessibile per ottenere un'elevata risoluzione spaziale con una maggiore efficienza di etichettatura.

1. Coltura cellulare

1. Utilizzare cellule U2OS coltivate nel mezzo 5A di McCoy integrato con FBS al 10% a 37 °C in CO 2 al 5%.
2. Celle di coltura su un vetro di copertura a camera rimovibile a 16 pozzetti (area di coltura 0,4 cm²) per una facile manipolazione.

2. Fissazione e permeabilizzazione

NOTA: Le condizioni di fissazione e permeabilizzazione dipendono dai protocolli di immunocolorazione ottimizzati. Di seguito è riportato un protocollo di fissazione e permeabilizzazione per microtubuli co-immunostain e pozzi rivestiti di clatrina (CCP).

1. Una volta che la conta cellulare raggiunge ~0,04 x 10 6, fissare le cellule con 100 μL di paraformaldeide (PFA) al 3,2% in tampone PEM (100 mM PIPES, 1 mM EGTA e 1 mM MgCl₂, pH^6,9) per 10 minuti a temperatura ambiente (Tabella 1).
   NOTA: La fissazione mediante PFA viene eseguita in un cappuccio di sicurezza certificato.
2. Lavare le celle tre volte per 5 minuti ciascuna con 200 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
3. Permeabilizzare le cellule con 100 μL di tampone di permeabilizzazione a temperatura ambiente per 15 minuti (Tabella 1).
   NOTA: Procedere con l'etichettatura il prima possibile per evitare la degradazione della proteina bersaglio, dell'RNA o del DNA e per ottenere un risultato ottimale. Se necessario, tuttavia, i campioni fissi possono essere conservati per un tempo prolungato (fino a un mese) in un tampone PBS a 4 °C. Sostituire qualsiasi PBS evaporato e proteggere il campione dal fotosbiancamento.

3. Streptavidina endogena e blocco della biotina

1. Incubare le cellule con la soluzione di streptavidina diluita in un tampone bloccante cellulare (100 μL) per 15 minuti a temperatura ambiente (Tabella 1).
2. Risciacquare brevemente con 200 μL di tampone bloccante cellulare.
3. Incubare le cellule con 100 μL di soluzione di biotina diluite in un tampone bloccante cellulare per 15 minuti a temperatura ambiente.
   NOTA: quando si utilizza un approccio di tagging autoetichettante, ad esempio utilizzando tag SNAP o CLIP, ignorare il passaggio 4 e procedere al passaggio 5.1: approccio di tagging autoetichettante.

4. Colorazione degli anticorpi primari

1. Incubare cellule con anticorpo anti-α-tubulina di ratto (diluizione 1:500) e anticorpo anti-lattrina a catena pesante di coniglio (diluizione 1:100) in 100 μL di tampone bloccante cellulare per 16 h a 4 °C o 1 h a temperatura ambiente. Raddoppiare il tempo di incubazione dei campioni di tessuto.
2. Lavare i campioni quattro volte con 200 μL di PBS per 5 minuti ciascuno.

5. Colorazione anticorpale secondaria specifica LR-ExM

1. Coniugare gli anticorpi IgG con i linker trifunzionali come N-idrossisuccinimide (NHS) - metacrilammide (MA) -Biotina o NHS-MA-Digoxigenina (Dig) (Figura 1B). La sintesi di ancore trifunzionali e la coniugazione degli anticorpi secondari sono state precedentemente introdotte in Shi et ^al.1. Approccio di tagging auto-etichettante: coniugare gli anticorpi IgG con i linker trifunzionali, come MA- benzilguanina (BG)-biotina o MA- benzilcitosina (BC)-Dig (Figura 1B). La sintesi di ancore trifunzionali e una coniugazione degli anticorpi secondari sono state precedentemente introdotte in Shi et ^al.1.
2. Incubare le cellule con gli anticorpi secondari anti-coniglio-Dig-MA (diluizione 1:100) e anti-ratto-biotina-MA dell'asino (diluizione 1:100) in 100 μL di tampone bloccante cellulare per 1 ora a temperatura ambiente. Raddoppia questo tempo di incubazione per i campioni di tessuto.
3. Lavare i campioni quattro volte in 200 μL di PBS per 5 minuti ciascuno.

6. Ancoraggio aggiuntivo

1. Incubare le cellule con lo 0,25% di glutaraldeide (GA) in PBS (100 μL) per 15 minuti a temperatura ambiente per ancorare le proteine sull'idrogel. In alternativa, utilizzare 25 mM di acido metacrilico N-idrossisuccinimide estere (MA-NHS) per l'ancoraggio. È incoraggiata l'incubazione di un'ora a temperatura ambiente.
2. Lavare i campioni tre volte in PBS per 5 minuti ciascuno.

7. Gelificazione

NOTA: La velocità di espansione è determinata dal tempo di diffusione del sale e dell'acqua fuori o nel gel; Pertanto, la colata di gel sottili accelera il tempo di espansione.

1. Rimuovere la struttura superiore della piastra di gel a 16 pozzetti. Aggiungere 40 μL di soluzione monomerica a ciascun pozzetto per condizionare le cellule sul ghiaccio. Incubare su ghiaccio per 5 min.
   1. Per preparare una soluzione monomerica, vedere Tabella 2.
2. Preparare la soluzione di gelificazione su ghiaccio. Aggiungere acqua bidistillata e un acceleratore al 10% di N,N,N′,N′ Tetrametiletilendiammina (TEMED) alla soluzione monomerica (10% TEMED: soluzione monomerica = 1:47); non aggiungere ancora l'iniziatore (Tabella 3).
3. Per una camera di coltura cellulare con un'area di 0,4 cm², utilizzare un volume di soluzione di gelificazione di circa 40 μL. Preparare 45 μL di soluzione di gelificazione per ciascun pozzetto.
4. Aggiungere il 10% di persolfato di ammonio (APS) alla soluzione di gelificazione, incubare su ghiaccio e pipettare immediatamente 40 μL di soluzione di gelificazione in ciascuna guarnizione siliconica bene sul ghiaccio. Incubare su ghiaccio per 3 minuti (10% APS:10% TEMED:soluzione monomerica = 1:1:47).
5. Proteggere il campione dalla luce e spostare il vetro di copertura nella capsula di Petri da 10 cm in un incubatore a 37 °C per 1,5 ore per la gelificazione. Per mantenere l'umidità del gel durante l'incubazione a 37 °C, coprire la capsula di Petri con il coperchio e mettere qualche goccia d'acqua nella capsula di Petri.

8. Digestione

1. Dopo la gelificazione, rimuovere il vetro per separare il gel e trasferire il gel in 6 pozzetti. Digerire le cellule incorporate con 2 ml di tampone digestivo (Tabella 1) durante la notte a temperatura ambiente o 4 ore a 37 °C. Utilizzare almeno 10 volte il volume in eccesso di tampone di digestione.
2. Lavare i gel con un volume d'acqua in eccesso di almeno 10 volte rispetto al volume finale del gel. Ripetere la fase di lavaggio quattro volte per 20-30 minuti ogni volta. Il gel si espande di circa due volte in ogni dimensione.
   NOTA: I campioni di gel possono essere conservati fino a 1 mese in un tampone PBS a 4 °C. Sostituire l'acqua evaporata per evitare l'essiccazione e proteggere il campione dalla luce durante lo stoccaggio. Per evitare il degrado degli ancoraggi trifunzionali, i campioni devono essere colorati il prima possibile dopo la digestione e il lavaggio.

9. Colorazione a fluorescenza post-digestione

1. Incubare gel in 2 mL di volume di tampone colorante streptavidina (STV)/digoxigenina (DIG) con colorante STV da 2 a 5 μM e/o colorante anti-DIG per 24 ore a temperatura ambiente. Conservare i campioni al buio.

10. Espansione

1. Lavare ed espandere il gel quattro volte con acqua eccessiva (2-3 ml) per 30 minuti a 1 ora ogni volta.
2. Per una più facile visualizzazione delle cellule al microscopio fluorescente, colorare le cellule con DAPI durante il terzo dei cinque lavaggi. Diluire la concentrazione di DAPI (5 mg/ml, conservata a 4 °C) in 1:5.000 diluizioni in acqua di lavaggio. Incubare il gel con una soluzione DAPI-acqua (2 ml) per 30 minuti a 1 ora.
3. Lavare altre due volte con 3 ml di acqua.
4. Espandi i gel in qualsiasi piatto piatto abbastanza grande da contenere i campioni. I gel espansi che vengono preparati su 0,4 cm² area coverglass si adattano bene in una piastra di vetro inferiore a 6 pozzetti.
   NOTA: I campioni colorati post-espansione possono essere conservati fino a 4 mesi in un tampone PBS a 4 ° C. Aggiungere acqua sufficiente per evitare l'essiccazione e proteggere il campione dal fotosbiancamento. Ripetere la fase di espansione e colorazione DAPI prima dell'imaging. Per evitare qualsiasi rischio di degradazione dei fluorofori, i campioni devono essere ripresi il prima possibile.

11. Imaging

1. Rivestire la camera di imaging con fondo in vetro a 6 pozzetti con poli-L-lisina allo 0,01% (3 ml ciascuno) per immobilizzare i campioni di gel.
2. Trasferire i campioni di gel nella camera di imaging rivestita.
3. Immagina i campioni con qualsiasi oscilloscopio a fluorescenza desiderato.

I pozzi rivestiti di clatrina (CCP) sono immunocolorati utilizzando ancore trifunzionali (Figura 1B) e LR-ExM viene eseguito come descritto nella Figura 1A. LR-ExM (Figura 2C,E) mostra un'intensità di fluorescenza molto più elevata rispetto alla microscopia ad espansione di ritenzione proteica (proExM, Figura 2A) o biotina-ExM (Figura 2B); il segnale per LR-ExM era circa sei volte superiore a proExM (Figura 2D). LR-ExM può catturare efficacemente piccole strutture come i CCP, che sono anche più piccole del limite di diffrazione (Figura 2F,G).

Alcuni risultati rappresentativi di LR-ExM sono presentati utilizzando l'approccio immunocolorante. I microtubuli e i CCP sono co-immunocolorati utilizzando ancoranti trifunzionali, tra cui NHS-MA-DIG e NHS-MA-biotina (Figura 3A,B). LR-ExM è disponibile per l'approccio basato su tag enzimatici. Il risultato è dimostrato utilizzando gli ancoraggi trifunzionali BG-MA-biotina (per SNAP-tag) e BC-MA-DIG (per CLIP-tag) nella Figura 3C-F. Inoltre, è possibile combinare sia l'immunocolorazione che l'approccio protein-tag in LR-ExM come mostrato in Figura 3G-J. Da questi risultati, è confermato che LR-ExM è utile per ottenere immagini di alta qualità con maggiore efficienza e risoluzione dell'etichettatura.

LR-ExM mostra grandi prestazioni anche nei campioni di tessuto. LR-ExM viene eseguito sul tessuto cerebrale del topo co-immunocolorando il marcatore presinaptico Fagotto e il marcatore postsinaptico Homer1. Le due etichette sono chiare e ben separate, che supportano l'alta risoluzione e l'efficienza dell'etichettatura (Figura 4A-E).

Figura 1: Flusso di lavoro della microscopia ad espansione per la conservazione delle etichette (LR-ExM). (a) Flusso di lavoro di LR-ExM. (B) Schemi di ancoraggi trifunzionali. Questa cifra è stata modificata da Shi et al.1. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Quantificazione delle immagini confocali di microscopia ad espansione (ExM) di ritenzione del segnale (A-C) di pozzi rivestiti di clatrina (CCP) in cellule U2OS indirettamente immunocolorate per la catena pesante della clatrina (POI). (A) Protein-retention ExM (ProExM) utilizzando anticorpi secondari coniugati con AF488. (B) ExM con marcatura post-espansione con anticorpi coniugati con biotina. (C) LR-ExM utilizzando anticorpi coniugati con ancoranti trifunzionali NHS-MA-biotina. I campioni in B e C sono colorati post-espansione con streptavidina-AF488. (D) Quantificazione dell'intensità di A-C. Le barre di errore rappresentano SD. n = 3 per ogni caso. I rapporti di espansione della lunghezza per le immagini in A, B, C ed E-G sono rispettivamente 4,3, 4,5, 4,6 e 4,3. Il rapporto di espansione della lunghezza per i campioni utilizzati nel grafico D è di 4,5 ± 0,2. Barre scala, 500 nm (A-C ed E) e 100 nm (F e G). Tutte le barre della scala si trovano in unità di pre-espansione. Arb. u., unità arbitrarie; STV, streptavidina. Tutte le immagini sono ottenute utilizzando un microscopio confocale a disco rotante (Nikon CSU-W1) con un obiettivo di immersione in acqua 60x (NA1.27). Questa cifra è stata modificata da Shi et al.1. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Risultati rappresentativi di LR-ExM utilizzando microscopi confocali. (A,B) Immagini confocali LR-ExM di microtubuli marcati con anticorpi secondari coniugati con NHS-MA-biotina (magenta) e CCP marcati con anticorpi secondari coniugati NHS-MA-DIG (verde) in una cellula U2OS. (B) Vista ingrandita. (C-F) Immagini confocali LR-ExM di CCP e/o mitocondri in cellule HeLa marcate utilizzando l'approccio con tag proteico (C) clatrina marcata con tag SNAP, (D) TOMM20 etichettato con tag CLIP e (E) imaging a due colori. (F) Vista ingrandita. (G) Immagini LR-ExM confocali a due colori utilizzando una combinazione di approccio immunocolorante (NPC, red hot) e approccio protein-tag (laminato A/C marcato SNAP (ciano)). (H) Vista ingrandita. (I,J) Viste dei singoli canali di H. Si noti che lo sfondo citoplasmatico in G è causato dall'anticorpo anti-NUP153. I rapporti di espansione della lunghezza per le immagini in A-B: 4,7, C-D: 4,4, E-F: 4,5 e G-J è 4,5. Barre di scala, 1 μm per A, 200 nm per B e F, 500 nm per C-E, 2 μm per G e 500 nm per H, I e J. Tutte le barre della scala si trovano in unità di pre-espansione. Tutte le immagini sono ottenute utilizzando un microscopio confocale a disco rotante (Nikon CSU-W1) con un obiettivo di immersione in acqua 60x (NA1.27). Questa cifra è stata modificata da Shi et al.1. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Risultati rappresentativi di LR-ExM su campioni di tessuto. (A) Immagine confocale LR-ExM della fetta di cervello di topo indirettamente immunocolorata per il marcatore presinaptico Fagotto (magenta) e il marcatore postsinaptico Homer1 (verde). (B,C) Immagini ingrandite delle sinapsi. (D,E) Profili di intensità trasversali lungo gli assi lunghi della scatola gialla. Il fagotto è etichettato con anticorpi secondari coniugati NHS-MA-DIG e Homer1 è etichettato con anticorpi secondari coniugati con NHS-MA-biotina. Tutti i campioni sono colorati post-espansione con streptavindina-AF488 e/o anti-Digossina-AF594. I rapporti di espansione della lunghezza per le immagini in A-C sono 4,2. Barre di scala, 1 μm (A) e 200 nm (B,C). Tutte le barre della scala si trovano in unità di pre-espansione. Tutte le immagini sono ottenute utilizzando un microscopio confocale a disco rotante (Nikon CSU-W1) con un obiettivo di immersione in acqua 60x (NA1.27). Questa cifra è stata modificata da Shi et al.1. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella 1: Prodotti chimici e tamponi Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Soluzione monomerica Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Tabella 3: Soluzione di gelificazione Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.