Questo protocollo versatile descrive l'isolamento delle cellule della cresta neurale premigratoria (NCC) attraverso l'escissione di pieghe neurali craniche da embrioni di pulcino. Dopo la placcatura e l'incubazione, gli NCC migratori emergono dagli espianti di piega neurale, consentendo la valutazione della morfologia cellulare e della migrazione in un ambiente 2D semplificato.
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Articolo metodologico
Preparazione e analisi morfologica di colture cellulari di cresta neurale cranica di pulcino
In questo articolo
Sommario
Abstract
Durante lo sviluppo dei vertebrati, le cellule della cresta neurale (NCC) migrano ampiamente e si differenziano in vari tipi di cellule che contribuiscono a strutture come lo scheletro craniofacciale e il sistema nervoso periferico. Mentre è fondamentale comprendere la migrazione NCC nel contesto di un embrione 3D, l'isolamento delle cellule migratorie in coltura 2D facilita la visualizzazione e la caratterizzazione funzionale, integrando gli studi embrionali. Il presente protocollo dimostra un metodo per isolare le pieghe neurali craniche dei pulcini per generare colture NCC primarie. Gli NCC migratori emergono da espianti di piega neurale placcati su un substrato rivestito di fibronectina. Ciò si traduce in popolazioni NCC disperse e aderenti che possono essere valutate mediante colorazione e analisi morfologiche quantitative. Questo approccio culturale semplificato è altamente adattabile e può essere combinato con altre tecniche. Ad esempio, l'emigrazione NCC e i comportamenti migratori possono essere valutati mediante imaging time-lapse o interrogati funzionalmente includendo inibitori o manipolazioni sperimentali dell'espressione genica (ad esempio, DNA, morfolino o elettroporazione CRISPR). Grazie alla sua versatilità, questo metodo fornisce un potente sistema per studiare lo sviluppo di NCC cranici.
Introduzione
Le cellule della cresta neurale (NCC) sono una popolazione di cellule transitorie negli embrioni vertebrati. Le NCC sono specificate ai bordi della piastra neurale e subiscono una transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) per migrare dal tubo neurale dorsale1. Dopo l'EMT, le NCC si disperdono ampiamente in tutto l'embrione, differenziandosi e contribuendo a varie strutture, tra cui lo scheletro craniofacciale, il tratto di deflusso del cuore e la maggior parte del sistema nervoso periferico2. I cambiamenti nella polarità cellulare, nel citoscheletro e nelle proprietà di adesione sono alla base di questo passaggio da una ....
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Protocollo
È possibile utilizzare qualsiasi varietà di razze Gallus gallus , tra cui White Leghorn, Golden Sex Link o Rhode Island Red. Le uova di gallina utilizzate nel presente studio erano di varie razze e ottenute da molteplici fonti, tra cui allevamenti e vivai locali.
1. Preparazione di soluzioni e materiali
- Preparare la soluzione di Ringer miscelando 123,3 mM NaCl, 1,53 mM CaCl 2, 4,96 mM KCl, 0,809 mM Na 2 HPO 4 e 0,147 mM KH2PO4 (vedere Tabella dei materiali). Regolare il pH a 7,4 e sterilizzare il filtro in flaconi da 100 ml. Conservar....
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Risultati
Una panoramica del presente protocollo è mostrata nella Figura 1. Le uova incubate sono state aperte e il tuorlo, con l'embrione in superficie, è stato isolato versando delicatamente nel palmo di una mano guantata (Figura 2A,B). Dopo aver eliminato l'albumina (Figura 2C), sono stati applicati telai di carta da filtro sulla membrana del tuorlo che circonda l'embrione per facilitare il taglio e il sollevamento dell'em.......
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Discussione
La tecnica qui descritta fornisce un metodo adattabile per isolare le pieghe neurali dei pulcini e placcarle per creare colture di NCC cranici migratori. Queste colture forniscono condizioni 2D semplificate per una facile analisi della migrazione e della morfologia NCC del pulcino che possono integrare metodi di imaging più tecnicamente impegnativi in ovo 24,25,26. Mentre questo metodo in vitro è relativamente .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Ringraziamo Corinne A. Fairchild e Katie L. Vermillion, che hanno partecipato allo sviluppo della nostra versione del protocollo di coltura della piega neurale cranica del pulcino.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| AxioObserver dotato di una testa di scansione confocale LSM710 controllata dal software ZEN 3.0 SR. | Zeiss | Usato alfa Plan-Apocromatico 100x/1.46 Olio DIC M27 obiettivo | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Piatti da camera (fondo in vetro, singoli o divisi) | MatTek; Cella Vis | P35G-1.5-14-C (MatTek) X000NOJQGX (Cellvis) X000NOK1OJ (Cellvis) | Vetro di copertura a camera singola da 35 mm o 4 camere da 35 mm |
| Carolina Biological Supply Company | 633029, 633031, 633033, 633035, 633037 | cerchi, 0.13– Spessore 0,17 mm, disponibile con diametro 12-25 mm | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320033 | per uova L15 media |
| Sportsman | 1502 | ||
| FBS | Life Technologies | 10437-028 | |
| Fibronectina | Fisher Scientific | CB-40008A | |
| Carta da filtro | per cromatografia 3MM di grado | Whatman | |
| (smussata) | Fisher Scientific; Thomas Scientific | 08-890 (Fisher); 1141W97 (Thomas) | |
| Forcipe (fine) | Strumenti per le scienze fini | 11252-20 | Dumont #5 |
| Image J | https://fiji.sc/ | Software gratuito per l'analisi delle immagini | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| L15 media | Invitrogen | 11415064 | |
| L-glutammina | Invitrogen | 25030 | |
| Mezzi di montaggio (Vectashield o ProLong Gold) | Vector Laboratories; Thermofisher Scientific | H-1700 (Vectashield); P36930 (ProLong Gold) | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Paraformaldeide | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillina/streptomicina | Life Technologies | 15140-148 | 10.000 Unità/mL Penicillina; 10.000 mg/mL Streptomicina |
| Piastre di Petri | VWR (o simili) | 60 mm, 100 mm | |
| Falloidina | Sigma-Aldrich | P1951 | flurofori multipli disponibili |
| Portaspilli | Fine Science Tools | 26016-12 | Per ago di tungsteno (alternativa alle forbici a molla) |
| Forbici (dissezione) | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Forbici a molla | Fine Science Tools | 15000-08 | Tagliente da 2,5 mm (alternativa all'ago di tungsteno) |
| Sylgard | Krayden | Sylgard 184 | |
| Filtri per siringa | Sigma-Aldrich | SLGVM33RS | Millex-GV Unità filtrante per siringa, 0,22 e micro; m, PVDF, 33 mm, sterilizzato a raggi gamma |
| Piastre per colture tissutali | Sarstedt | 83-3900 | Piastre per colture di colture di pieghe neurali sfuse |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Filo di tungsteno | Varietà di fonti | Diametro di 0,01" per aghi di tungsteno (alternativa alle forbici a molla) |
Riferimenti
- Pla, P., Monsoro-Burq, A. H. The neural border: Induction, specification and maturation of the territory that generates neural crest cells. Developmental Biology. 444, 36-46 (2018).
- Tang, W., Bronner, M. E. Neural crest lineage analy....
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Ristampe e permessi
