Articolo metodologico

Valutazione dell'efficienza fotosintetica nei mutanti fotorespiratori mediante analisi di fluorescenza clorofilliana

DOI:

10.3791/63801

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9 dicembre 2022

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1Department of Biological Sciences, Louisiana State University, 2Department of Plant Pathology and Crop Physiology, Louisiana State University AgCenter

In questo articolo

Sommario

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Descriviamo un approccio per misurare i cambiamenti nell'efficienza fotosintetica nelle piante dopo il trattamento con bassa CO2 utilizzando la fluorescenza della clorofilla.

Abstract

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La fotosintesi e la fotorespirazione rappresentano i maggiori flussi di carbonio nel metabolismo primario delle piante e sono necessari per la sopravvivenza delle piante. Molti degli enzimi e dei geni importanti per la fotosintesi e la fotorespirazione sono stati ben studiati per decenni, ma alcuni aspetti di questi percorsi biochimici e la loro diafonia con diversi processi subcellulari non sono ancora completamente compresi. Gran parte del lavoro che ha identificato i geni e le proteine importanti nel metabolismo delle piante è stato condotto in ambienti altamente controllati che potrebbero non rappresentare al meglio come funzionano la fotosintesi e la fotorespirazione in ambienti naturali e agricoli. Considerando che lo stress abiotico si traduce in una ridotta efficienza fotosintetica, è necessario lo sviluppo di uno schermo ad alto rendimento in grado di monitorare sia lo stress abiotico che il suo impatto sulla fotosintesi.

Pertanto, abbiamo sviluppato un metodo relativamente veloce per lo screening di cambiamenti indotti da stress abiotico all'efficienza fotosintetica in grado di identificare geni non caratterizzati con ruoli nella fotorespirazione utilizzando l'analisi della fluorescenza clorofilliana e lo screening a bassa CO2 . Questo articolo descrive un metodo per studiare i cambiamenti nell'efficienza fotosintetica nei mutanti knockout del DNA trasferito (T-DNA) in Arabidopsis thaliana. Lo stesso metodo può essere utilizzato per lo screening dei mutanti indotti dal metansolfonato di etile (EMS) o per lo screening dei soppressori. L'utilizzo di questo metodo può identificare i candidati geni per ulteriori studi sul metabolismo primario delle piante e sulle risposte allo stress abiotico. I dati di questo metodo possono fornire informazioni sulla funzione genica che potrebbe non essere riconosciuta fino all'esposizione a ambienti di stress aumentati.

Introduzione

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Le condizioni di stress abiotico comunemente osservate nei campi degli agricoltori possono avere un impatto negativo sui raccolti riducendo l'efficienza fotosintetica. Condizioni ambientali dannose come ondate di calore, cambiamenti climatici, siccità e salinità del suolo possono causare stress abiotici che alterano la disponibilità di CO2 e riducono la risposta di una pianta a stress luminosi elevati. I due maggiori flussi di carbonio terrestri sono la fotosintesi e la fotorespirazione, che sono essenziali per la crescita delle piante e la resa delle colture. Molte delle importanti proteine ed enzimi coinvolti in questi processi sono stati caratterizzati i....

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Protocollo

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1. Preparazione e sterilizzazione delle sementi

NOTA: La preparazione delle sementi consiste nell'assorbimento e nella sterilizzazione dei semi. È importante notare che tutti questi passaggi devono essere eseguiti in una cappa a flusso laminare per mantenere condizioni sterili. Tutti i materiali, i reagenti e i substrati di crescita necessari devono essere sottoposti ad autoclave (vedere la Tabella dei materiali).

  1. Assorbimento e stratificazione dei semi
    NOTA: Le linee di semi utilizzate sono plgg1-1 (salk_053463), abcb26 (salk_085232) e wild type (WT, Col-0).
    1. Erogare i ....

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Risultati

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I risultati mostrano immagini di lastre di immagini grezze e fluorescenza dallo screening ambientale e a bassa CO2 di WT e mutanti di prova. Ogni piantina è etichettata per numero di area, con le corrispondenti letture di fluorescenza fornite come QY. I dati vengono esportati come file di testo e possono essere aperti in un foglio di calcolo per l'analisi (vedere la tabella supplementare S1). Le linee mutanti plgg1-1 e abcb26 sono state selezionate per dimostrare l'identifica.......

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Discussione

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I metodi sperimentali descritti in questo documento presentano alcuni vantaggi e limitazioni. Un vantaggio è che questo metodo può schermare molte piantine di piante, anche se devono essere prese alcune precauzioni per prevenire la contaminazione della piastra del supporto vegetale durante il processo di placcatura e crescita. Pertanto, è fondamentale sigillare le piastre di Arabidopsis con nastro chirurgico. Un altro vantaggio di questo esperimento è che ha un periodo di stress fotorespiratorio più breve di 12 ore rispe.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti o conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Questa ricerca è stata finanziata dal Louisiana Board of Regents (AWD-AM210544).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provetta per microcentrifuga da 1,5 mLVWR10810-070contenitore per sterilizzazione dei semi
agarosioVWR9012-36-6prodotto chimico utilizzato per sospendere i semi per facilitarne la placcatura
Arabidopsis thaliana semi (abcb26)ABRC, ordinati tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_085232semi di arabidopsis utilizzati come gruppo
sperimentaleArabidopsis thaliana semi (plgg1-1)ABRC, ordinati tramite TAIR www.arabidopsis.orgSALK_053469Csemi di arabidopsis parentale 
Arabidopsis thaliana semi (WT)ABRC, ordinati tramite TAIR www.arabidopsis.orgCol-0semi di arabidopsis wild type utilizzati come gruppo di controllo
... candeggina Cloroxcandeggina generica Sostanza chimica utilizzata per sterilizzare i semi
Medlineassorbenti CarbolimeS232-104-001CO2 assorbente
Closed FluorCamPhoton Systems StrumentiFC 800-CImager a fluorescenza
FluoroCam FC 800-CPhoton Systems InstrumentsClosed FluorCam FC 800-C/1010-SImager a fluorescenza
FluoroCam7Photon SystemsInstruments Closed FluorCam FC 800-C/1010- SSoftware di analisi delle immagini a fluorescenza
Gelzan (agar vegetale)Phytotech labs71010-52-1chimico utilizzato per solidificare i terreni MS come piastre 
pallone di vetro 1 LFisherbrandcontenitore FB5011000per la produzione e la sterilizzazione in autoclave MS camera
di crescitacaron7317-50-2camera di crescita utilizzata per coltivare piante
Murashige & Skoog Basal Medium con Vitamine & 1,0 g/L MES (MS)PhytotechlabsM5531 Terreni di crescita per piantine di Arabidopsis 
idrossido di potassio (KOH)Phytotech labs1310-58-3produce come soluzione 1 M per
le luci a ragnoMean Well EnterprisesXLG-100-H-ABluci utilizzate nel test della luce 
Piastra di Petri quadrata con griglia, sterileSimport ScientificD21016utilizzata per contenere terreni MS per piantine di arabidopsis
nastro chirurgico3M1530-1nastro utilizzato per sigillare le piastre
tra 20biorad  9005-64-5tensioattivo utilizzato per assistere la sterilizzazione dei semi
Prodotti di regolazione del ph

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Peterhansel, C., et al. Photorespiration. Arabidopsis Book. 8, 0130(2010).
  2. Bordych, C., Eisenhut, M., Pick, T. R., Kuelahoglu, C., Weber, A. P. Co-expression analysis as tool for the discovery of transport proteins in photorespiration. Plant Biology. 15 (4), 686-693 ....

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Screening a bassa concentrazione di CO2Arabidopsis thalianaresa quanticascreening ad alta produttivitrisposta allo stress abioticoimaging delle plantulefluorimetro a impulsi di ampiezza

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