Valutazione dell'efficienza fotosintetica nei mutanti fotorespiratori mediante analisi di fluorescenza clorofilliana

Le condizioni di stress abiotico comunemente osservate nei campi degli agricoltori possono avere un impatto negativo sui raccolti riducendo l'efficienza fotosintetica. Condizioni ambientali dannose come ondate di calore, cambiamenti climatici, siccità e salinità del suolo possono causare stress abiotici che alterano la disponibilità di CO₂ e riducono la risposta di una pianta a stress luminosi elevati. I due maggiori flussi di carbonio terrestri sono la fotosintesi e la fotorespirazione, che sono essenziali per la crescita delle piante e la resa delle colture. Molte delle importanti proteine ed enzimi coinvolti in questi processi sono stati caratterizzati in condizioni di laboratorio e identificati al livello genetico¹. Sebbene siano stati fatti molti progressi nella comprensione della fotosintesi e della fotorespirazione, molti passaggi, incluso il trasporto tra organelli vegetali, rimangono non caratterizzati ^2,3.

La fotorespirazione, il secondo più grande flusso di carbonio nelle piante dopo la fotosintesi, inizia quando l'enzima Rubisco fissa l'ossigeno invece dell'anidride carbonica al ribulosio 1,5 bisfosfato (RuBP), generando il composto inibitorio 2-fosfoglicolato (2PG)¹. Per minimizzare gli effetti inibitori del 2PG e riciclare il carbonio precedentemente fissato, le piante C3 hanno sviluppato il processo multi-organellare della fotorespirazione. La fotorespirazione converte due molecole di 2PG in una molecola di 3-fosfoglicerato (3PGA), che può rientrare nel ciclo di fissazione del carbonio C3¹. Pertanto, la fotorespirazione converte solo il 75% del carbonio precedentemente fissato dalla generazione di 2PG e consuma ATP nel processo. Di conseguenza, il processo di fotorespirazione è un significativo trascinamento del 10% -50% sul processo fotosintetico, a seconda della disponibilità di acqua e delle temperature della stagione di crescita⁴.

Gli enzimi coinvolti nella fotorespirazione sono stati un'area di ricerca per decenni, ma solo un piccolo numero di proteine di trasporto sono state caratterizzate a livello genetico, anche se almeno 25 fasi di trasporto sono coinvolte nel processo ^5,6,7. Le due proteine di trasporto direttamente coinvolte nel movimento del carbonio generato nel processo di fotorespirazione sono il trasportatore plastidico glicolato/glicerato PLGG1 e il trasportatore di sodio degli acidi biliari BASS6, entrambi coinvolti nell'esportazione di glicolato dal cloroplasto ^5,6.

Sotto ambiente [CO₂], Rubisco fissa una molecola di ossigeno a RuBP circa il 20% delle volte¹. Quando le piante sono soggette a bassi [CO 2], i tassi di fotorespirazione aumentano, rendendo basso [CO₂] un ambiente ideale per testare i mutanti che possono essere importanti sotto elevato stress fotorespiratorio. Il test di ulteriori linee di T-DNA della proteina di trasporto putativo del cloroplasto sotto bassa CO₂ per 24 ore e la misurazione delle modifiche alla fluorescenza della clorofilla hanno portato all'identificazione di linee vegetali bass6-1 che hanno dimostrato un^fenotipo mutante 5 della fotorespirazione. Un'ulteriore caratterizzazione ha dimostrato che BASS6 è un trasportatore di glicolato nella membrana interna del cloroplasto.

Questo articolo descrive in dettaglio un protocollo simile a quello inizialmente utilizzato per identificare BASS6 come trasportatore della fotorespirazione, che proveniva da una lista di proteine di trasporto putative situate all'interno della membrana del cloroplasto⁸ Questo protocollo può essere utilizzato in un esperimento ad alto rendimento che caratterizza i mutanti del T-DNA di Arabidopsis o le piante mutanti generate da EMS come un modo per identificare geni importanti per mantenere l'efficienza fotosintetica sotto una serie di stress abiotici come il calore, elevato stress luminoso, siccità e disponibilità di CO₂ . Lo screening dei mutanti delle piante mediante fluorescenza clorofilliana è stato utilizzato in passato per identificare rapidamente geni importanti per il metabolismo primario⁹. Con ben il 30% del genoma di Arabidopsis contenente geni che codificano per proteine di funzione sconosciuta o scarsamente caratterizzata, l'analisi indotta dallo stress dell'efficienza fotosintetica potrebbe fornire informazioni sulle funzioni molecolari non osservate in condizioni controllate nelle piante mutanti¹⁰. L'obiettivo di questo metodo è identificare i mutanti della via fotorespiratoria utilizzando uno screening a bassa CO₂ . Presentiamo un metodo per identificare i mutanti che interrompono la fotorespirazione dopo l'esposizione a basse emissioni di CO₂. Un vantaggio di questo metodo è che si tratta di uno screening ad alto rendimento per piantine che può essere eseguito in un periodo di tempo relativamente breve. Le sezioni del protocollo video forniscono dettagli sulla preparazione e sterilizzazione delle sementi, sulla crescita delle piante e sul trattamento a bassa CO₂ , sulla configurazione del sistema di imaging a fluorescenza, sulla misurazione della resa quantica dei campioni trattati, sui risultati rappresentativi e sulle conclusioni.

1. Preparazione e sterilizzazione delle sementi

NOTA: La preparazione delle sementi consiste nell'assorbimento e nella sterilizzazione dei semi. È importante notare che tutti questi passaggi devono essere eseguiti in una cappa a flusso laminare per mantenere condizioni sterili. Tutti i materiali, i reagenti e i substrati di crescita necessari devono essere sottoposti ad autoclave (vedere la Tabella dei materiali).

1. Assorbimento e stratificazione dei semi
   NOTA: Le linee di semi utilizzate sono plgg1-1 (salk_053463), abcb26 (salk_085232) e wild type (WT, Col-0).
   1. Erogare i semi in provette da microcentrifuga da 1,5 ml. Assorbire i semi in acqua sterile in una cappa a flusso laminare e stratificare a 4 °C al buio per 2 giorni.
2. Sterilizzazione dei semi
   1. In condizioni sterili, preparare 10 ml di soluzione di candeggina al 50% (v/v) e aggiungere circa 20 μL di Tween 20. Per la sterilizzazione dei semi, rimuovere l'acqua dai semi assorbiti, aggiungere 1 ml di soluzione di candeggina nei tubi della microcentrifuga e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.
   2. Rimuovere la soluzione di candeggina con una pipetta.
   3. Risciacquare i semi in 1 ml di acqua sterile per risospendere. Rimuovere l'acqua una volta che i semi si sono depositati sul fondo. Ripetere i passaggi 1.6 e 1.7 sette volte.
   4. Risospendere i semi in soluzione sterile di agarosio allo 0,1%.
3. Placcatura delle sementi
   1. Produrre un volume di 1 L di Murashige & Skoog Basal Medium con vitamine e 1,0 g/L di acido 2-(N-morfonio)etanosolfonico (MS) aggiungendo 5,43 g di polvere a 500 ml di acqua distillata. Regolare il pH tra 5,6 e 5,8 utilizzando idrossido di potassio (KOH). Riempire a 1 L con acqua distillata.
      1. Dividere la soluzione liquida in 500 ml e porli a metà in un matraccio da 1 L contenente un agitatore magnetico. Aggiungere 5 g di polvere di agar per ottenere una soluzione di agar all'1% p/v per ciascun pallone.
      2. Autoclave a 121 °C e 15 psi per 30 min; Quindi, mettere a temperatura ambiente mescolando lentamente. Una volta raffreddato, versare 25 ml di agar MS in una capsula di Petri quadrata. Lascia che si solidifichi.
         NOTA: Queste piastre Murashige & Skoog Basal Medium contengono l'1% di MS medium con vitamine e l'1% di agar per la coltivazione dei mutanti di prova.
   2. Tagliare una punta di pipetta da 200 μL con una lametta da rasoio. Posizionare un seme al centro della griglia quadrata designata per ciascun mutante o genotipo di prova (1 cm² quadrato) di una piastra MS quadrata (Figura 1) utilizzando una micropipetta da 200 μL.
      NOTA: La griglia quadrata di 1 cm x 1 cm aiuta a mantenere una distanza uniforme tra le piantine ed evitare sovrapposizioni, che saranno importanti nelle successive immagini e analisi a fluorescenza.
   3. Una volta che i semi sono stati placcati, avvolgere con nastro chirurgico intorno al coperchio per sigillare e metterlo nella camera di crescita nelle condizioni descritte di seguito.

2. Crescita delle piante e trattamento a basso contenuto di CO₂

1. Coltivare le piante per 7-9 giorni a 20 °C con un ciclo luminoso di 8 ore di 120 μmol·m−²s⁻¹ e 16 ore di buio a 18 °C. Controlla le piante il 6 ° giorno per determinare se sono abbastanza grandi per l'imaging. L'8 ° giorno dopo la placcatura, esporre le piante a bassa CO₂.
2. Trattamento a basso contenuto di CO₂
   1. Dopo 7-9 giorni, posizionare quattro delle otto piastre dalle condizioni della camera di crescita ambiente in condizioni fotorespiratorie di 20 °C, livelli di luce continua di 200 μmol·m−2 s⁻¹ e basso CO₂ per ¹²ore.
   2. Costruire la condizione di bassa CO₂ utilizzando un contenitore trasparente ermetico con 100 g di calce sodata posta sul fondo del contenitore. Posizionare il contenitore all'interno della stessa camera di crescita del controllo. Mantenere gli impianti di controllo sotto 120 μmol·m−2 s⁻¹ in CO 2_{ambiente per} ¹²ore.

3. Configurazione del sistema di imaging a fluorescenza

1. Posizionare una piastra di prova (preparata secondo le sezioni 1 e 2) centrata sotto la telecamera a una distanza fissa nel sistema di imaging a fluorescenza.
2. All'interno del software dello strumento, accedere alla finestra live e selezionare la casella Lampeggia per attivare i flash di misurazione non attinici.
3. Fare clic sugli strumenti Zoom e Messa a fuoco fino a visualizzare un'immagine completa e nitida. A tal fine, utilizzare un palco o uno scaffale per regolare la distanza tra le piante e la fotocamera. Mantieni costanti lo zoom, la messa a fuoco e la distanza dalla fotocamera per l'intero esperimento.
4. Impostare il valore di El. Shutter su 0 e regolare la sensibilità per ottenere un segnale fluorescente nell'intervallo di 200-500 unità digitali.
   NOTA: un valore dell'otturatore inferiore (0-1) garantirà che i flash di misurazione non siano attinici, mentre un valore più alto (2) migliorerà la risoluzione dell'immagine.
5. Posizionare un esposimetro nella stessa posizione utilizzato per regolare le impostazioni della fotocamera.
6. Nella finestra animata, seleziona la casella Super per avviare un impulso di saturazione della durata di 800 ms. Ricordati di selezionare la casella ogni volta per un nuovo impulso.
7. Utilizzare il cursore per regolare la percentuale di potenza relativa per l'impulso Super fino a quando l'esposimetro non legge 6.000-8.000 μmol·m−²s⁻¹.

4. Progettare il programma di resa quantistica

1. Importare strumenti operativi standard per il sistema di imaging.
   Includi default.inc
   Includi light.inc
   Nota : la sintassi del programma utilizzata come riferimento in questo esperimento è per un sistema di imaging FluorCam.
2. Definire le seguenti variabili globali in base alle impostazioni di luce configurate:
   Otturatore = 0
   Sensibilità = 40
   Super = 65
3. Includi il passaggio temporale per la registrazione dei dati:
   TS = 20ms
4. Raccogliere la misura Fo campionando la fluorescenza in uno stato adattato al buio.
   F0durata = 2s;
   F0periodo = 200ms;
   NOTA: la durata F0 definisce l'intervallo di tempo in cui viene registrata la fluorescenza adattata al buio. F0period definisce l'intervallo di tempo durante il quale viene ripetuta la misurazione della fluorescenza adattata al buio.
5. Registrare le misurazioni Fo in tabelle di dati.
   <0,F0period.. F0duration>=>mfmsub
   <0s>->checkpoint,"startFo"
   =>checkpoint,"endFo";
   Dove < , > rappresenta l'insieme dei valori di fluorescenza indicizzati dal tempo; => memorizza le misurazioni in un file di sistema; mfmsub rappresenta l'intero set di dati per l'esperimento; e checkpoint crea un sottoinsieme per i dati di misurazioni specifiche come startFo.
6. Raccogliere e memorizzare la misura Fm campionando la fluorescenza dopo un impulso di saturazione.
   PulseDuration=960ms; ##
   a1=F0durata + 40ms
   a2 = a1 + 480ms;
   =>SatPulse(PulseDuration);
   =>mfmsub
   =>mfmsub;
   =>checkpoint,"startFm"
   =>checkpoint,"endFm"
   =>checkpoint,"timeVisual";
   Dove a1 e a2 sono variabili per coordinare il tempo di campionamento con l'impulso di saturazione; a1 rappresenta l'ora di inizio della misurazione Fm; e A2 rappresenta il tempo del punto medio dell'impulso.

5. Misurazione della resa quantica dei campioni trattati

1. Subito dopo il trattamento, coprire le piastre con un foglio di alluminio per 15 minuti per l'adattamento al buio. Rimuovere la pellicola per misurare la resa quantica del fotosistema II con un fluorometro modificato con ampiezza dell'impulso. Quindi, posiziona la piastra della piantina direttamente sotto la fotocamera ed esegui il protocollo di resa quantica trovato nel repository GitHub.
2. Scaricare il protocollo quantum_yield da GitHub (https://github.com/South-lab/fluorescent-screen) o utilizzare un programma progettato in modo simile dalla sezione 4. Utilizzare il software del fluorometro per aprire il file di programma facendo clic sull'icona della cartella e navigando verso la posizione del file.
3. Esegui il programma di resa quantistica facendo clic sull'icona del fulmine rosso.
4. Al termine del protocollo, passare alla finestra di preanalisi . Partizionare il piatto in singole piantine utilizzando gli strumenti di selezione per evidenziare tutti i pixel per ogni piantina sull'immagine del piatto. Fate clic su Esclusione sfondo per rimuovere tutti i pixel di sfondo evidenziati, lasciando solo l'area della piantina.
5. Fare clic su Analizza per generare dati di fluorescenza per ogni piantina sull'immagine della piastra. Regolare manualmente l'intervallo dei valori di fluorescenza per visualizzare valori minimi e massimi coerenti tra tutte le piastre.
6. Fare clic su Media numerica dalla scheda Esperimento | Esportazione | Numerico. Selezionare Tutti i dati e per colonna e fare clic su OK per generare un file di testo contenente le misurazioni QY per ogni piantina.

6. Apertura del file di dati

1. Aprire il file di testo in un foglio di calcolo per l'analisi. Tra le intestazioni che mostrano il numero di area, la dimensione dei pixel, Fm, Ft, Fq e QY, identificare il numero di area per il genotipo principale (WT o mutante di prova) e QYmax. Eseguire un test t a coppie rispetto al wild type per determinare la significatività. I dati sono interpretati come significativamente diversi quando i valori p sono inferiori a 0,05.

I risultati mostrano immagini di lastre di immagini grezze e fluorescenza dallo screening ambientale e a bassa CO2 di WT e mutanti di prova. Ogni piantina è etichettata per numero di area, con le corrispondenti letture di fluorescenza fornite come QY. I dati vengono esportati come file di testo e possono essere aperti in un foglio di calcolo per l'analisi (vedere la tabella supplementare S1). Le linee mutanti plgg1-1 e abcb26 sono state selezionate per dimostrare l'identificazione positiva e negativa di geni associati allo stress fotorespiratorio. PLGG1 codifica per il primo trasportatore nel percorso successivo all'ossigenazione di RuBP6, mentre ABCB26 è pensato per codificare per un trasportatore di antigene non noto per essere coinvolto nella fotorespirazione11. Le efficienze Fv/Fm QY adattate al buio di WT e mutanti sono visualizzate da grafici a scatola e baffi. Per testare la differenza statistica tra il WT e i mutanti di prova, è stato utilizzato un test t a coppie con un valore p < 0,05. Qui, abbiamo usato linee mutanti fotorespiratorie con QY Fv / Fm ridotto come mutanti di prova per verificare l'efficienza del metodo di screening. I risultati mostrano che i mutanti di prova hanno un'efficienza QY significativamente inferiore rispetto a WT. La figura 3B mostra una significativa riduzione del rapporto tra fluorescenza variabile e massima (Fv / Fm) per plgg1-1 ma non abcb26 a basso CO2. Questo risultato è coerente con il ruolo di PLGG1 come trasportatore coinvolto nella fotorespirazione, mentre abcb26 non dimostra un fenotipo diverso dal controllo WT in condizioni di bassa CO2 . Pertanto, questo metodo di screening può identificare i mutanti fotorespiratori utilizzando uno screening a bassa CO2 .

Figura 1: Schema di esempio del layout del piatto di semina. Vengono mostrate due repliche tecniche con sei semi posizionati in fila. Semi di controllo WT posti sopra i semi mutanti. Abbreviazione: WT = wild type. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Immagini Fv/F m adattate al buio di piantine di 9 giorni. Il controllo wild-type viene confrontato con le linee mutanti del T-DNA a livello ambientale e a bassa CO2. La scala dei colori rappresenta la media Fv / Fm di ogni piantina. Barra della scala = 1 cm. Abbreviazioni: Fv/Fm = rapporto tra fluorescenza variabile e massima; WT = wild type; plgg1-1 = traslocatore plastidale glicolato/glicerato 1; abcb26 = Cassetta B26 con legame ATP. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Osservazioni di fluorescenza. Misurazioni della resa quantica massima (Fv/Fm) effettuate sulle piantine in condizioni (A) ambientali e (B) di bassa CO2 . Le caselle rappresentano l'intervallo tra i quartili interni, le linee all'interno delle caselle rappresentano le mediane e i baffi rappresentano le osservazioni massime e minime. * Indica una differenza significativa basata su un test t a coppie rispetto a WT (n > 44, p < 0,05; Tabella supplementare S2). Abbreviazioni: Fv/Fm = rapporto tra fluorescenza variabile e massima ; WT = wild type; plgg1-1 = traslocatore plastidale glicolato/glicerato 1; abcb26 = Cassetta B26 con legame ATP. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella supplementare S1: Dati fluorescenti compilati da tutte le piastre di piantina utilizzate nell'esperimento. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare S2: Le statistiche sono riportate da un t-test tra wild type ed entrambi i genotipi mutanti. I mutanti sono considerati significativamente diversi dal wild type quando il valore p è inferiore a 0,05. La tabella A rappresenta i t-test eseguiti su piante coltivate in CO 2ambientale, mentre la tabella B rappresenta i t-test eseguiti su piante coltivate a bassa CO2. t-Test: due campioni che assumono variazioni uguali. Clicca qui per scaricare questo file.

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti o conflitti di interesse.