Qui presentiamo un protocollo per l'arricchimento delle fosfatasi fosfoproteine endogene e delle loro proteine interagenti da cellule e tessuti e la loro identificazione e quantificazione mediante proteomica basata sulla spettrometria di massa.
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Articolo metodologico
Un approccio basato sulla spettrometria di massa per identificare le fosfatasi delle fosfoproteine e i loro interattori
In questo articolo
Sommario
Abstract
La maggior parte dei processi cellulari sono regolati dalla fosforilazione dinamica delle proteine. Più di tre quarti delle proteine sono fosforilate e le fosfoproteine fosfatasi (PPP) coordinano oltre il 90% di tutta la defosforilazione cellulare di serina/treonina. La deregolazione della fosforilazione proteica è stata implicata nella fisiopatologia di varie malattie, tra cui il cancro e la neurodegenerazione. Nonostante la loro attività diffusa, i meccanismi molecolari che controllano i PPP e quelli controllati dai PPP sono scarsamente caratterizzati. Qui, viene descritto un approccio proteomico chiamato perline inibitrici della fosfatasi e spettrometria di massa (PIB-MS) per identificare e quantificare i PPP, le loro modifiche post-traduzionali e i loro interattori in appena 12 ore utilizzando qualsiasi linea cellulare o tessuto. PIB-MS utilizza un inibitore PPP non selettivo, microcistina-LR (MCLR), immobilizzato su perline di sefarosio per catturare e arricchire i PPP endogeni e le loro proteine associate (chiamate PPPome). Questo metodo non richiede l'espressione esogena di versioni marcate di PPP o l'uso di anticorpi specifici. PIB-MS offre un modo innovativo per studiare i PPP evolutivamente conservati ed espandere la nostra attuale comprensione della segnalazione di defosforilazione.
Introduzione
La fosforilazione proteica controlla la maggior parte dei processi cellulari, tra cui, ma non solo, la risposta al danno al DNA, la segnalazione del fattore di crescita e il passaggio attraverso la mitosi 1,2,3. Nelle cellule di mammifero, la maggior parte delle proteine sono fosforilate in uno o più residui di serina, treonina o tirosina ad un certo punto nel tempo, con fosfosine e fosfotreonine che costituiscono circa il 98% di tutti i siti di fosforilazione 2,3. Mentre le chinasi sono state ampiamente studiate nell....
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Protocollo
NOTA: La generazione di PIB viene effettuata come descritto da Moorhead et al., dove 1 mg di microcistina e circa 6 mL di sefarosio sono accoppiati per generare PIB con una capacità di legame fino a 5 mg/mL17.
1. Preparazione del campione
NOTA: Una quantità iniziale tipica per PIB-MS è di 1 mg di proteina totale per condizione. Per questo esperimento, circa 2,5 x 106 cellule HeLa sono state utilizzate per estrarre 1 mg di proteine. Questo calcolo deve essere eseguito per ogni linea cellulare o tessuto utilizzato in un esperimento18. Se il c....
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Risultati
Figura 2: Identificazione di specifici leganti PIB. (A) Una varietà di tipi di tessuto o cellule può essere analizzata tramite PIB-MS. Le cellule HeLa nel tripliceto biologico sono state trattate con DMSO o l'inibitore PPP MCLR, incubate con PIB e analizzate tramite LC-MS / MS. (B) Grafico vulc.......
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Discussione
PIB-MS è un approccio di proteomica chimica utilizzato per profilare quantitativamente il PPPome da varie fonti di campioni in un'unica analisi. Molto lavoro è stato fatto usando perline inibitrici della chinasi per studiare il kinome e come cambia nel cancro e in altri statipatologici 10,11,12,13. Tuttavia, lo studio del PPPome è in ritardo. Prevediamo che questo approccio sia in grado di colm.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare e nessun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
A.N.K. riconosce il supporto di NIH R33 CA225458 e R35 GM119455. Ringraziamo i laboratori Kettenbach e Gerber per la loro utile discussione.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Acetonitrile (ACN) | Honeywell | AH015-4 | ATTENZIONE: ACN è infiammabile e tossico; indossare guanti e lavorare in una cappa chimica. |
| Acetonitrile anidro | Sigma-Aldrich | 271004-100ML ATTENZIONE | : ACN è infiammabile e tossico; indossare guanti e lavorare in una cappa chimica. |
| Centrifuga da banco | Eppendorf | modello n. 5424 | |
| Acido beta-glicerofosforico, sale disodico pentaidrato | Acros Organics | 410991000 | |
| Centrifuga | Eppendorf | modello n. 5810 Versione R 15 amp | |
| Acqua | |||
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Tessuto a balza Pestelli | per pellet Fisherbrand | 12-141-363 | |
| Disco di estrazione in fase solida Empore, C18 | CDS Analytical | 76333-132 | |
| Provette Eppendorf, 1,5 mL | Eppendorf | 22363204 | CRITICO: Altre provette possono rilasciare il polimero nel campione, contaminando l'analisi. |
| Provette Eppendorf, 2 mL | Eppendorf | 22363352 | CRITICO: Altre provette possono filtrare il polimero nel campione, contaminando l'analisi. |
| Collettore per piastre di estrazione | Waters | WAT097944 | |
| Provette Falcon, 50 mL | VWR | 21008 | |
| Ago e stantuffo | |||
| Rack | |||
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Acido cloridrico (HCl) | VWR Chemicals BDH | BDH3028 | ATTENZIONE: L'HCl è corrosivo; Indossare guanti e lavorare in una cappa chimica. |
| Soluzione di idrossilammina 50% (wt/vol) | Sigma-Aldrich | 467804 | |
| Incubatore, 65 gradi C | VWR | modello n. 1380FM | |
| Koptec Etanolo puro, 200 prove | Decon Labs | V1001 | |
| Metanolo per HPLC (MeOH) | Sigma-Aldrich | 34860-4L-R | ATTENZIONE: MeOH è infiammabile e tossico; indossare guanti e lavorare in una cappa chimica. |
| Microcistina LR (MCLR) | Cayman Chemical | 10007188 | ATTENZIONE: MCLR è tossico; indossare guanti durante la manipolazione ed evitare il contatto con la pelle. |
| PBS, 1 volte senza calcio e magnesio, pH 7,4 & 0,1 | Corning | Strisce reattive per pH 21-040-CV | |
| , come le strisce reattive per pH MilliporeSigma MColorpHast e le carte indicatrici | Fisher Scientific | M1095310001 | |
| PIB | Per il protocollo per la generazione di PIB, vedere Moorhead et al., 2007. | ||
| Kit per il dosaggio delle proteine BCA Pierce | Thermo Scientific | 23225 | |
| Puntali per pipette, 10 μ L | Eppendorf | 22491504 | CRITICO: Altre punte possono rilasciare il polimero nei campioni, contaminando l'analisi. |
| Puntali per pipette, 1000 &; L | Eppendorf | 22491555 | CRITICO: Altre punte possono rilasciare il polimero nei campioni, contaminando l'analisi. |
| Puntali per pipette, 200 &; L | Eppendorf | 22491539 | CRITICO: Altre punte possono rilasciare il polimero nei campioni, contaminando l'analisi. |
| siringa di plastica, 10 mL | BD | 309604 | |
| Cocktail di inibitori della proteasi III | Research Products International | P50700-1 | |
| Q Exactive Plus Spettrometro di massa ibrido quadrupolo-orbitrap, Oribtrap Fusion, Orbitrap Fusion Lumos o Orbitrap Eclipse Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Centrifuga refrigerata da banco | Eppendorf | modello n. 5424 R | |
| Rotator (girarrosto con agitatore Labquake) | Thermo Scientific | 13-687-12Q | Rotazione a 8 giri/min |
| Piastra di raccolta campioni, 96 pozzetti, 1 mL | Waters | WAT058957 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP1311-1 | |
| Grado di sequenziamento tripsina modificata | Promega | V511C | |
| Sodio azide | EMD Chemicals | SX0299-1 | ATTENZIONE: L'azoturo di sodio è esplosivo e tossico; indossare guanti, lavorare in una cappa chimica ed evitare il contatto con i metalli. |
| Cloruro di sodio (NaCl) | Fisher Chemical | S27110 | |
| Sonicatore (sonificatore digitale Branson) | modello n. Piastra di desalinizzazione SFX 250 | ||
| SPE C18 | Waters | 186001828BA | |
| SpeedBeads particelle modificate con carbossilato magnetico (perle SP3) | Cytiva | 6.51521E+13 | |
| Thermomixer | Eppendorf | modello n. 5350 | |
| Set di reagenti per etichette isobariche TMT10plex più reagente per etichette TMT11-131C, 3 volte 0,8 mg per etichetta | ThermoFisher | A37725 | |
| Acido trifluoroacetico (TFA) | Honeywell | T6508-25ML ATTENZIONE | : Il TFA è corrosivo e irrita la pelle al contatto. Indossare guanti e protezione per gli occhi e lavorare in una cappa chimica. |
| Tris Base | Research Products International | T60040 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Centrifuga sottovuoto e trappola di vapore | Thermo Scientific | modello n. SpeedVac SPD120 e RVT5105 | |
| Vortexer (Vortex-Genie 2) | Scientific Industries Water | ||
| LC-MS | Honeywell | LC365-4 |
Riferimenti
- Nilsson, J. Protein phosphatases in the regulation of mitosis. Journal of Cell Biology. 218 (2), 395-409 (2019).
- Brautigan, D. L. Protein Ser/Thr phosphatases--the ugly ducklings of cell signalling. The FEBS Journal. 280 (2), 324-345 (2013).
- Bra....
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Ristampe e permessi
