Method Article

Chip glomerulo renale isogenico ingegnerizzato da cellule staminali pluripotenti indotte umane

DOI:

10.3791/63821

⸱

November 4th, 2022

 , 
1Department of Biomedical Engineering, Pratt School of Engineering, Duke University, 2Department of Medicine, Division of Nephrology, Duke University School of Medicine, 3Department of Cell Biology, Duke University, 4Center for Biomolecular and Tissue Engineering, Duke University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Presentato qui è un protocollo per progettare un sistema organo-on-a-chip personalizzato che ricapitola la struttura e la funzione della barriera di filtrazione glomerulare renale integrando cellule endoteliali epiteliali e vascolari geneticamente abbinate differenziate dalle cellule staminali pluripotenti indotte umane. Questo sistema bioingegnerizzato può far progredire la medicina di precisione renale e le applicazioni correlate.

Abstract

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La malattia renale cronica (CKD) colpisce il 15% della popolazione adulta degli Stati Uniti, ma l'istituzione di terapie mirate è stata limitata dalla mancanza di modelli funzionali in grado di prevedere con precisione le risposte biologiche umane e la nefrotossicità. I progressi nella medicina di precisione renale potrebbero aiutare a superare questi limiti. Tuttavia, i modelli in vitro precedentemente stabiliti del glomerulo renale umano - il sito primario per la filtrazione del sangue e un bersaglio chiave di molte malattie e tossicità dei farmaci - impiegano tipicamente popolazioni cellulari eterogenee con caratteristiche funzionali limitate e background genetici senza pari. Queste caratteristiche limitano significativamente la loro applicazione per la modellazione della malattia specifica del paziente e la scoperta terapeutica.

Questo articolo presenta un protocollo che integra l'epitelio glomerulare derivato dalle cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPS) e l'endotelio vascolare da un singolo paziente per progettare un chip glomerulo renale microfluidico isogenico e vascolarizzato. Il chip glomerulo risultante è costituito da strati di cellule endoteliali ed epiteliali derivati da cellule staminali che esprimono marcatori specifici del lignaggio, producono proteine di membrana basale e formano un'interfaccia tessuto-tessuto simile alla barriera di filtrazione glomerulare del rene. Il chip glomerulo ingegnerizzato filtra selettivamente le molecole e ricapitola il danno renale indotto da farmaci. La capacità di ricostituire la struttura e la funzione del glomerulo renale utilizzando tipi di cellule isogeniche crea l'opportunità di modellare la malattia renale con la specificità del paziente e far progredire l'utilità degli organi su chip per la medicina di precisione renale e le applicazioni correlate.

Introduction

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I dispositivi organ-on-a-chip sono modelli dinamici 3D in vitro che impiegano la stimolazione molecolare e meccanica, nonché la vascolarizzazione, per formare interfacce tessuto-tessuto che modellano la struttura e la funzione di organi specifici. I dispositivi organ-on-a-chip precedentemente stabiliti che miravano a ricapitolare il glomerulo del rene (chip di glomerulo) consistevano in linee cellulari animali1 o linee cellulari primarie e immortalizzate umane di fonti eterogenee 2,3. L'uso di fonti cellulari geneticamente eterogenee presenta variazioni che limitano significati....

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Protocol

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1. Preparare soluzioni di matrice di membrana basale e substrati rivestiti

  1. Scongelare la matrice della membrana basale 1 durante la notte su ghiaccio a 4 °C. Aliquote secondo il rapporto di diluizione suggerito dal fabbricante. Utilizzando un tubo conico da 50 mL e una pipetta, mescolare accuratamente una quantità appropriata di matrice di membrana basale 1 in 25 mL di DMEM/F12 freddo fino a completo scongelamento e dissoluzione.
    1. Per sciogliere un'aliquota congelata, prelevare ~200 μL dai 25 mL di DMEM/F12 freddo e trasferirlo nel tubo aliquote congelato. Pipettare su e giù fino a quando la matrice è completamente scongelata e sciolt....

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Results

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Qui mostriamo che un modello funzionale 3D in vitro del glomerulo può essere vascolarizzato ed epitelalizzato da una fonte isogenica di cellule iPS umane. In particolare, questo protocollo fornisce istruzioni su come applicare la tecnologia delle cellule iPS umane, in particolare la loro capacità di differenziarsi in tipi cellulari specializzati, per generare epitelio glomerulare renale (podociti) ed endotelio vascolare (viECs) che possono essere integrati con dispositivi microfluidici per modellare la struttura.......

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Discussion

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In questo rapporto, delineiamo un protocollo per derivare l'endotelio vascolare e l'epitelio glomerulare (podociti) da una linea cellulare iPS umana isogenica e l'uso di queste cellule per progettare un sistema 3D organ-on-a-chip che imita la struttura, l'interfaccia tessuto-tessuto e la funzione di filtrazione molecolare del glomerulo renale. Questo chip glomerulo è dotato di endotelio ed epitelio glomerulare che, insieme, forniscono una barriera per filtrare selettivamente le molecole.

I ri.......

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Disclosures

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S.M. è inventore di un brevetto relativo alla differenziazione dei podociti dalle cellule iPS umane. L'altro autore non ha nulla da rivelare.

Acknowledgements

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Questo lavoro è stato supportato dalla Pratt School of Engineering della Duke University, dalla Divisione di Nefrologia presso il Duke Department of Medicine, da una borsa di studio Whitehead in Biomedical Research e da un Genentech Research Award per S. Musah. Y. Roye ha ricevuto la borsa di studio della Duke University-Alfred P. Sloan Foundation e la William M. "Monty" Reichert Graduate Fellowship del Dipartimento di Ingegneria Biomedica della Duke University. La linea cellulare iPS DU11 (Duke University clone #11) è stata generata presso la Duke iPSC Core Facility e fornitaci dal Bursac Lab della Duke University. Gli autori ringraziano N. Abutaleb, J. Holmes, R. Bh....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Antibodies
Alexa Fluor 488- e Alexa Fluor 594-anticorpi secondari coniugatiThermo/Life TechnologiesA32744; A32754; A-11076; A32790; Codice A21203; A11015
Thermo/Life diCollagene IV14-9871-82
NephrinProgenGP-N2
PECAM-1R& D SystemsAF806
PodocinAbcamab50339
VE-CadherinSanta Cruzsc-9989<
strong>Matrici di membrana basale
Corning Fibronectina, HumanCorning356008Membrana basale (3)
iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) frammentoIwai Nord AmericaN8922012Matrice di membrana basale (2)
Matrice qualificata Matrigel hESC, fiala da 5 mLBD Biosciences354277 Matrice di membrana basale (1); può mostrare variazioni da lotto a lotto
cellule
DU11 celluleiPS umaneLa linea cellulare iPS DU11 (Duke University clone #11) è stata generata presso la Duke iPSC Core Facility e ci è stata fornita dal Bursac Lab della Duke University. La linea è stata testata ed è risultata priva di micoplasma (ultimo test a novembre 2021) e anomalie del cariotipo (luglio 2019)
Fattori di crescita del mezzo di coltura e integratori di terreni
0,5 M EDTA, pH 8,0Invitrogen15575020
2-MercaptoetanoloThermo/Life Technologies21985023
Albumina da siero bovino, Texas Red coniugatoThermo/Life TechnologiesA23017
Acido retinoico all-trans (500 mg)Stem Cell Technologies72262
Integratore senza siero B27Thermo/Life Technologies17504044
Integratore B-27 (50x) senza vitamina AThermo/Life Technologies12587010
Albumina sierica bovinaSigma-AldrichA9418
CHIR99021Stemgent04-0004Può mostrare variazioni da lotto a lotto
Kit completo di terreno con CultureBoost-RCell Systems4Z0-500-RTerreno di manutenzione per podociti
DMEM/F12Thermo/Life Technologies12634028
DMEM/F12 con integratore GlutaMAXThermo/Life Technologies10565042DMEM/F12 con glutammina
Forskolina (attivatore dell'adenilil ciclasi)Abcamab120058
Integratore GlutaMAXThermo/Life Technologies35050061integratore di glutammina
FBS inattivato a caldoThermo/Life Technologies10082147
soluzione di eparinaStem Cell Technologies7980
Activina umana AThermo/Life TechnologiesPHC9544
Tecnologie umane BMP4Preprotech120-05ET
Tecnologie umane BMP7Thermo/LifePHC9544
Tecnologie umane VEGFThermo/Life PHC9394
Inulina-FITCSigma-AldrichF3272
mTeSR1 medieTecnologie delle cellule staminali05850Terreni di coltura cellulare iPS umana (CCM). Aggiungere 5 integratori secondo il produttore. La CCM iPS umana può essere conservata fino a 6 mesi a -20 °C.
Integratore N-2 (100x)Thermo/Life Technologies17502048
Terreni neurobasaliThermo/Life Technologies21103049Terreni basali del mesoderma laterale
PBS (soluzione salina tamponata con fosfato)Thermo/Life Technologies14190-250
Penicillina-streptomicina, liquida (100x)Thermo/Life Technologies15140-163
ROCK inibitore (Y27632)Tocris1254
StemPro-34 SFMThermo/Life Technologies10639011Terreno di coltura cellulare endoteliale (CCM). Aggiungere l'integratore secondo il produttore. La CCM endoteliale può essere conservata per un massimo di due settimane a 4 gradi C o -20 gradi C per un massimo di 6 mesi.
Inibitore del TGF-Beta (SB431542)Stem Cell Technologies72234
Enzimi e altri reagenti
AccutaseThermo/Life TechnologiesA1110501Tampone di distacco cellulare
Dimetil solossido (DMSO)Sigma-AldrichD2438
Soluzione di etanolo, 70% (vol/vol), grado biotecnologicoVWR97065-058
Paraformaldeide (PFA)Thermo/Life Technologies28906
Acqua distillata sterileThermo/Life Technologies15230162
Triton X-100VWR97062-208
Equipment
Trypsin EDTA, 0.05%Thermo/Life Technologies25300-120
(Orb) Modulo hubEmulateORB-HM1
Piastra di Petri rotonda da 100 mm x 15 mmFisherbrandFB087579B
Piastra per coltura cellulare quadrata da 120 x 120 mmVWR688161
Accuri C6BD Biosciences
Pipette di aspirazione, confezionate singolarmenteCorning29442-462
Unità di aspirazioneSP Bel-ArtF19917-0150
Centrifuga Avanti J-15RBeckman CoulterB99516
Provetta da centrifuga conica, 15 mLCorning352097
Provetta da centrifuga conica, 50 mLCorning352098
EVOS M7000Thermo/Life TechnologiesAMF7000Microscopio a fluorescenza per scattare immagini di piante fisse e colorate cellule.
EmocitometroVWR100503-092
Heracell VIOS 160i Incubatore a CO2Thermo/Life Technologies51030403
Osservatore Zeiss Axio invertito dotato di telecamera AxioCam 503Carl Zeiss Micrscopy491916-0001-000(microscopio) ; 426558-0000-000(telecamera)
Guanti in nitrile Kimberly-ClarkVWR40101-346
Kimwipes, grandiVWR21905-049
Leoca SP8 Microscopio
Serbatoio multimediale (modulo portatile POD)EmulaPOD-1
Agitatore per micropiastreVWR12620-926
Chip d'organoEmulaS-1 Chip
porta-organoEmulaAK-CCR
P10 puntali per pipette barriera di precisioneDenville ScientificP1096-FR
Puntali per pipette barriera P100Denville ScientificP1125
P1000 puntali per pipette barrieraDenville ScientificP1121
P20 puntali per pipette barrieraDenville ScientificP1122
P200Denville ScientificP1122
Plasma AsherQuorum techK1050X RFQuesto incisore/Asher/Cleaner al plasma è stato utilizzato come parte della Shared Materials Instrumentation Facility (SMiF) della Duke University.
Provetta in polistirene a fondo tondo con tappo a scatto per filtro cellulareCorning352235
Pipetta sierologica, 10 mL, confezionata singolarmenteCorning356551
Pipetta sierologica, 25 mL, confezionata singolarmenteCorning356525
Pipetta sierologica, 5 mL, confezionata singolarmenteCorning356543
Steriflip, 0,22 &; m, PESEMD MilliporeSCGP00525
Provette sterili per microcentrifugaThomas Scientific1138W14
T75cm2 pallone per colture cellulari con tappo di sfiatoCorning430641U
Piastre a 12 pozzetti trattate per colture tissutaliCorning353043
Piastre a 6 pozzetti trattate per colture tissutaliCorning353046
Modulatore di vuoto e pompa perstaltica (Zoe Culture Module)Emulail bioreattore a chip d'organoZOE-CM1
VE-Caderina CD144 anticorpo umano - Coniugato APCMiltenyi Biotec130-126-010
Sollevatore cellulare ad ampia smussaturaCorning3008
MACS
CD144 MicroBeads, umanoMiltenyi Biotec130-097-857
CD31 Kit Microbeads, umanoMiltenyi Biotec130-091-935
Colonne LSMiltenyi Biotec130-042-401
Tecnologie confocale verticale chip

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, L., et al. A disease model of diabetic nephropathy in a glomerulus-on-a-chip microdevice. Lab on a Chip. 17 (10), 1749-1760 (2017).
  2. Musah, S., et al. Mature induced-pluripot....

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