Imaging a super-risoluzione label-free abilitato dall'imaging vibrazionale del tessuto gonfio e dall'analisi

Sommario

Combinando la chimica dell'idrogel ad espansione del campione con la microscopia a scattering Raman stimolata chimica-specifica senza marcatura, il protocollo descrive come ottenere l'imaging volumetrico a super-risoluzione senza marcatura in campioni biologici. Con un ulteriore algoritmo di segmentazione delle immagini di apprendimento automatico, sono state ottenute immagini multicomponente specifiche per le proteine nei tessuti senza marcatura degli anticorpi.

Abstract

L'utilizzo universale della microscopia a fluorescenza, in particolare della microscopia a super-risoluzione, ha notevolmente avanzato le conoscenze sulla biologia moderna. Al contrario, il requisito della marcatura con fluorofori nelle tecniche fluorescenti pone sfide significative, come il fotosbiancamento e la marcatura non uniforme delle sonde fluorescenti e l'elaborazione prolungata dei campioni. In questo protocollo, vengono presentate le procedure di lavoro dettagliate dell'imaging vibrazionale del tessuto gonfio e dell'analisi (VISTA). VISTA aggira gli ostacoli associati ai fluorofori e consente di ottenere immagini volumetriche a super-risoluzione label-free in campioni biologici con risoluzione spaziale fino a 78 nm. La procedura viene stabilita incorporando cellule e tessuti in idrogel, espandendo isotropicamente l'ibrido del campione di idrogel e visualizzando le distribuzioni proteiche endogene mediante imaging vibrazionale con microscopia a diffusione Raman stimolata. Il metodo è dimostrato sia sulle cellule che sui tessuti cerebrali di topo. Sono state osservate immagini VISTA e di immunofluorescenza altamente correlate, che convalidano l'origine proteica delle specificità di imaging. Sfruttando tale correlazione, un algoritmo di segmentazione delle immagini basato sull'apprendimento automatico è stato addestrato per ottenere la previsione multicomponente di nuclei, vasi sanguigni, cellule neuronali e dendriti da immagini cerebrali di topo prive di marcatura. La procedura è stata ulteriormente adattata per studiare gli aggregati patologici di poli-glutammina (polyQ) nelle cellule e le placche di amiloide-beta (Aβ) nei tessuti cerebrali ad alto rendimento, giustificando il suo potenziale per campioni clinici su larga scala.

Introduzione

Lo sviluppo dei metodi di imaging ottico ha rivoluzionato la comprensione della biologia moderna perché forniscono informazioni spaziali e temporali senza precedenti di bersagli su diverse scale, dalle proteine subcellulari agli organi^interi. Tra questi, la microscopia a fluorescenza è la più consolidata, con un'ampia gamma di coloranti organici con alti coefficienti di estinzione e rese quantistiche^{2, proteine} fluorescenti codificate geneticamente 3 facili da usare e metodi di super-risoluzione come STED, PALM e STORM per l'imaging di strutture su scala nanometri....

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali eseguite in questo studio sono state approvate dal California Institute of Technology Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) e le procedure del protocollo sono state conformi a tutte le normative etiche pertinenti.

1. Preparazione di soluzioni madre per la fissazione e l'espansione del campione

1. Preparare 40 mL di soluzione di fissazione sciogliendo prima 12 g di acrilammide (30% p/v) solido in 26 mL di acqua priva di nucleasi. Quindi, aggiungere alla miscela 10 ml di soluzione madre di PFA al 16%. Infine, aggiungere 4 ml di soluzione....

Risultati

Dopo aver stabilito il principio di funzionamento del metodo di imaging e analisi, è stata eseguita la registrazione dell'immagine per valutare il rapporto di espansione e garantire l'espansione isotropa durante l'elaborazione del campione (Figura 1A, B). Sia i campioni non trattati che quelli VISTA sono stati sottoposti a imaging mentre miravano alla vibrazione di legame a 2940 ^cm-1, che origina dal CH₃ delle proteine endogene. Nei campioni non trattat.......

Discussione

In sintesi, presentiamo il protocollo per VISTA, che è una modalità label-free per visualizzare strutture cellulari e subcellulari ricche di proteine di cellule e tessuti. Prendendo di mira il CH₃ endogeno dalle proteine nelle cellule e nei tessuti inclusi in idrogel, il metodo raggiunge una risoluzione di imaging efficace fino a 78 nm in campioni biologici e risolve l'estrusione minore negli aggregati di huntingtina e nelle fibrille nelle placche Aβ. Questa tecnica è il primo.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1.0 M Tris pH 8	Sigma-Aldrich	648314
16% Paraformaldeide	Scienza della microscopia elettronica	15710	diluito al 4% in
PBS 25x obiettivo ad immersione in acqua	Olympus	XLPLN25XWMP2	NA 1.05
5XFAD Mice	Mutant Mouse Resource and Research Centers and the Jackson Laboratory	B6SJL-TG (APPSwFlLon, PSEN1*M146L*L286 V) 6799Vas/Mmjax	Alzheimer cervello
60x obiettivo ad immersione in acqua	Olympus	UPLSAPO60XWIR	NA 1.2
acrilammide	Sigma-Aldrich	A9099
persolfato di ammonio	Sigma-Aldrich	A3678
anti-MAP2	Cell Signaling Technology	8707
anti-NeuN	Cell Signaling Technology	24307
vetrino coprioggetti in borosilicato #1.5	Fisher Scientific	1254581
C57BL/6J Mice	Jackson Laboratory (JAX)	664	Topi normali
D2O	Sigma-Aldrich	151882	per calibrazione SRS
DAPI	Thermo Fisher	D1306
DMEM	GIBCO	10566-016
FBS	GIBCO	A4766
vetrino 3" x 1" x 1 mm	VWR	16004-430
capra anti-pollo IgY, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21449
capra anti-topo IgG, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21236
capra anti-coniglio IgG, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11034
capra anti-ratto IgG, Alexa Fluor 568	Invitrogen	A-11077
Grace Bio-Labs Press-To-Seal isolatori in silicone	Sigma-Aldrich	GBL664108	distanziatore
per microscopio Htt-97Q-GFP Plasmide	Dono del Prof. R. Kopito e del Prof. F.-U.Hartl.
Microscopio a scansione laser	Olympus	FV3000	microscopio confocale a scansione laser
lipofectamina 3000	Thermo Fisher	L3000001	agente di trasfezione
Lycopersicon Esculentum Lectina DyLight® 594 (lectina)	Vector Laboratories	DL-1177-1
Distanziatore per microscopio	Grace Bio-Labs	621502
N,N′-metilenebisacrilammide (BIS)	Sigma-Aldrich	M1533	acquistato come soluzione al 2% in acqua
Acqua priva di nucleasi	Thermo Fisher	10977-015
Penicillina-Streptomicina	GIBCO	15140-122
perline di poli-streno	Sigma-Aldrich	43302	per la caratterizzazione della risoluzione
Acrilato di sodio	Sigma-Aldrich	408220
sodio dodecil solfato	Sigma-Aldrich	71725
pennello di lana morbida #3	TANIS	000333
SRS Laser	APE	picoEmerald	2ps larghezza
di impulsotetrametiletilendiammina	Sigma-Aldrich	T9281
Pallone per coltura tissutale 25 cm2	Corning	430639
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween-20	Pinzetta Sigma-Aldrich	P9416
	Fine Science Tool	11295-51
Vibrotomo	Leica	VT1200S	il vibratomo