Somministrazione mediata da elettroporazione di ribonucleoproteine Cas9 e mRNA in epatociti primari di topo appena isolati

Tanner Rathbone; Ilayda Ates; Callie Stuart; Tina Parker; Renee N. Cottle

doi:10.3791/63828

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Articolo metodologico

Somministrazione mediata da elettroporazione di ribonucleoproteine Cas9 e mRNA in epatociti primari di topo appena isolati

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DOI:

10.3791/63828

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2 giugno 2022

Tanner Rathbone^*¹ , Ilayda Ates^*¹ , Callie Stuart¹ , Tina Parker² , Renee N. Cottle¹

¹Department of Bioengineering, Clemson University, ²Godley Snell Research Center, Clemson University

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive le tecniche per isolare gli epatociti primari di topo dal fegato e l'elettroporazione di CRISPR-Cas9 come ribonucleoproteine e mRNA per interrompere un gene bersaglio terapeutico associato a una malattia metabolica ereditaria del fegato. I metodi descritti determinano un'elevata vitalità e alti livelli di modificazione genica dopo l'elettroporazione.

Abstract

Questo protocollo descrive un metodo rapido ed efficace per isolare gli epatociti primari del topo seguito dalla somministrazione mediata dall'elettroporazione di CRISPR-Cas9 come ribonucleoproteine (RNP) e mRNA. Gli epatociti primari di topo sono stati isolati utilizzando un metodo di perfusione retrograda in tre fasi con conseguenti rese elevate fino a 50 × 10⁶ cellule per fegato e vitalità cellulare di >85%. Questo protocollo fornisce istruzioni dettagliate per la placcatura, la colorazione e la coltura degli epatociti. I risultati indicano che l'elettroporazione fornisce un'elevata efficienza di trasfezione dell'89%, misurata dalla percentuale di cellule positive alla proteina fluorescente verde (GFP) e dalla modesta vitalità cellulare di >35% negli epatociti di topo.

Per dimostrare l'utilità di questo approccio, CRISPR-Cas9 mirato al gene dell'idrossifenilpiruvato diossigenasi è stato elettroporato in epatociti primari di topo come modifica genetica proof-of-principle per interrompere un gene terapeutico correlato a una malattia metabolica ereditaria (IMD) del fegato. Un editing on-target più elevato del 78% è stato osservato per gli RNP rispetto al 47% di efficienza di editing con mRNA. La funzionalità degli epatociti è stata valutata in vitro utilizzando un test dell'albumina che ha indicato che la somministrazione di CRISPR-Cas9 come RNP e mRNA si traduce in una vitalità cellulare comparabile negli epatociti primari di topo. Un'applicazione promettente per questo protocollo è la generazione di modelli murini per le malattie genetiche umane che colpiscono il fegato.

Introduzione

Le IMD del fegato sono malattie genetiche caratterizzate dalla carenza di un enzima epatico cruciale coinvolto nel metabolismo che porta all'accumulo di metaboliti tossici. Senza trattamento, le IMD del fegato provocano insufficienza d'organo o morte prematura ^1,2. L'unica opzione curativa per i pazienti con IMD del fegato è il trapianto di fegato ortotopico, che è limitato a causa della scarsa disponibilità di organi donatori e delle complicanze della terapia immunosoppressiva a seguito della procedura ^3,4. Secondo i recenti dati raccolti dall'Organ P....