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Articolo metodologico

Somministrazione mediata da elettroporazione di ribonucleoproteine Cas9 e mRNA in epatociti primari di topo appena isolati

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DOI:

10.3791/63828

2 giugno 2022

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive le tecniche per isolare gli epatociti primari di topo dal fegato e l'elettroporazione di CRISPR-Cas9 come ribonucleoproteine e mRNA per interrompere un gene bersaglio terapeutico associato a una malattia metabolica ereditaria del fegato. I metodi descritti determinano un'elevata vitalità e alti livelli di modificazione genica dopo l'elettroporazione.

Abstract

Questo protocollo descrive un metodo rapido ed efficace per isolare gli epatociti primari del topo seguito dalla somministrazione mediata dall'elettroporazione di CRISPR-Cas9 come ribonucleoproteine (RNP) e mRNA. Gli epatociti primari di topo sono stati isolati utilizzando un metodo di perfusione retrograda in tre fasi con conseguenti rese elevate fino a 50 × 106 cellule per fegato e vitalità cellulare di >85%. Questo protocollo fornisce istruzioni dettagliate per la placcatura, la colorazione e la coltura degli epatociti. I risultati indicano che l'elettroporazione fornisce un'elevata efficienza di trasfezione dell'89%, misurata dalla percentuale di cellule positive alla proteina fluorescente verde (GFP) e dalla modesta vitalità cellulare di >35% negli epatociti di topo.

Per dimostrare l'utilità di questo approccio, CRISPR-Cas9 mirato al gene dell'idrossifenilpiruvato diossigenasi è stato elettroporato in epatociti primari di topo come modifica genetica proof-of-principle per interrompere un gene terapeutico correlato a una malattia metabolica ereditaria (IMD) del fegato. Un editing on-target più elevato del 78% è stato osservato per gli RNP rispetto al 47% di efficienza di editing con mRNA. La funzionalità degli epatociti è stata valutata in vitro utilizzando un test dell'albumina che ha indicato che la somministrazione di CRISPR-Cas9 come RNP e mRNA si traduce in una vitalità cellulare comparabile negli epatociti primari di topo. Un'applicazione promettente per questo protocollo è la generazione di modelli murini per le malattie genetiche umane che colpiscono il fegato.

Introduzione

Le IMD del fegato sono malattie genetiche caratterizzate dalla carenza di un enzima epatico cruciale coinvolto nel metabolismo che porta all'accumulo di metaboliti tossici. Senza trattamento, le IMD del fegato provocano insufficienza d'organo o morte prematura 1,2. L'unica opzione curativa per i pazienti con IMD del fegato è il trapianto di fegato ortotopico, che è limitato a causa della scarsa disponibilità di organi donatori e delle complicanze della terapia immunosoppressiva a seguito della procedura 3,4. Secondo i recenti dati raccolti dall'Organ P....

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Protocollo

Gli esperimenti sugli animali sono stati tutti eseguiti in conformità con le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali e i protocolli approvati presso la Clemson University. Le procedure chirurgiche sono state eseguite in topi C57BL / 6J di tipo selvatico anestetizzati tra le 8 e le 10 settimane di età.

1. Chirurgia animale

  1. Preparazione di soluzioni e strumenti
    NOTA: Le soluzioni di perfusione e le ricette dei cocktail per anestesia sono mostrate nella Tabella dei materiali.
    1. Preparare la soluzione di perfusione 1 (HEPES, EGTA ed EBSS), la soluzione di perfu....

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Risultati

Isolamento degli epatociti primari piastrizzabili dal fegato
Il processo complessivo di perfusione epatica e isolamento degli epatociti è illustrato nella Figura 1. In questo esperimento sono stati utilizzati topi C57BL6/6J di tipo selvatico di 8-10 settimane. La procedura dovrebbe produrre 20-50 × 106 cellule per topo con una vitalità compresa tra l'85% e il 95%. Se la vitalità è <70%, deve essere seguito il trattamento percoll per rimuovere le cellule mort.......

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Discussione

I passaggi delineati nel protocollo per l'isolamento degli epatociti sono impegnativi e richiedono pratica per la competenza. Ci sono diversi passaggi chiave per il successo dell'isolamento degli epatociti dal fegato. In primo luogo, una corretta cannulazione della vena cava inferiore è essenziale per la completa perfusione epatica. L'assenza di sbiancamento nel fegato dopo la perfusione indica lo spostamento del catetere (Tabella 1). La vena cava inferiore (perfusione retrograda) è stata cannulata nella.......

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno interessi concorrenti da divulgare.

Ringraziamenti

RNC ha ricevuto finanziamenti dal South Carolina Bioengineering Center of Regeneration and Formation of Tissues Pilot grant sostenuto dal National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) del National Institutes of Health, dall'American Association for the Study of Liver Diseases Foundation e dall'American Society of Gene & Cell Therapy con i numeri di sovvenzione P30 GM131959, 2021000920, e 2022000099, rispettivamente. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali dell'American Society of Gene & Cell Therapy o dell'American Association for the Study of Liver Diseases Foundation. Lo schema per la ....

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Equipment
0,2 mL PCR Striscia FLEX-FREE a 8 provette, cappucci piatti trasparenti attaccati, naturaleUSA Scientific1402-4700
Piastre di collagene a 6 pozzettiAdvanced Biomatrix5073
accuSpin Micro 17RFisher Scientific13-100-675
Microscopio fluorescente all-in-oneKeyenceBZ-X810
Miscelatore a vortice analogicoVWR97043-562
ART Punte filtrate a foro largo 1.000 &; LThermoFisher Scientific2079GPK
Contatore cellulare automatizzatoBio-Rad LaboratoriesTC20
Vassoio di dissezione in cera bluBraintree Scientific Inc.DTW19" x 6,5" x 1/2"+F21
Raschietto/sollevatore cellulareArgos TechnologiesUX-04396-53Provette coniche sterili e apirogene
(15 mL)Fisher Scientific339650
Provette coniche (50 mL)Fisher Scientific14-432-22
Applicatori in cotoneFisher Scientific22-363-170
Curvo forbiciCooper Surgical62131
Piastre di Petri monousoFalcon351029100mm, sterili
Piastre di Petri monousoVWR25373-10035mm, sterili
Spettrofotometro per micropiastre EpochBioTek Instruments250082
Filtro cellulare Falcon (70 &; m)Fisher Scientific08-771-2
PinzeCooper Surgical61864Euro-Med Adson Pinze tissutali
Cateteri IV BD38261224 G x 0,75 in
set di infusione endovenosaBaxter2C6401
MyFuge 12 Mini CentrifugeBenchmark Scientific1220P38
AghiFisher Scientific05-561-2025 G
Nucleofector 2b DispositivoLonzaAAB-1001Programma T-028 è stato utilizzato per l'elettroporazione negli epatociti di topo
Pompa peristalticaMasterflex  HV-77120-42da 10 a 60 giri/min; da 90 a 260 V c.a.
Tubo per pompadi precisione MasterflexHV-96410-14silicone da 25 piedi
Corning Life Sciences353846Piastre per colture tissutali contenenti azoto
Pipette sierologiche (25 mL)Fisher Scientific12-567-604
SiringheBD3294641 mL, sterili
Termociclatore T100Bio-Rad Laboratories1861096
Bagno d'acquaALT27577Thermo Scientific Precision Controllato da microprocessore serie 280, 2,5 L
Reagents
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3IDT1081058
Beckman Coulter AMPure XP, 5 mLFisher Scientific NC9959336
CleanCap Cas9 mRNATrilink BiotechnologiesL-7606-100
CleanCap  EGFP mRNATrilink BiotechnologiesL-7201-100
Corning Matrigel MatrixCorning Life Sciences356234
DMEMThermoFisher Scientific 11885076Basso glucosio, piruvato
Etanolo 70%VWR71001-652
Siero fetale bovinoThermoscientific26140-079
Mantenimento degli epatociti Medium (MM)LonzaMM250
Terreno di placcatura degli epatociti (PM)LonzaMP100
Kit ELISA per albumina di topoFisher ScientificNC0010653
Kit per nucleocarcinoma di epatociti di topo/rattoLonzaVPL-1004
OneTaq HotStart DNA polimerasiNew England BiolabsM0481L
PBS 10x pH 7.4 Thermoscientific70011-044Senza cloruro di calcio o magnesio
Percoll (soluzione PVP)Santa Cruz Biotechnologysc-500790A
Acido periodicoSigma-AldrichP7875-25G
Mezzo di montaggio PermountVWR100496-550
Soluzione di estrazione del DNA QuickExtractLucigen CorporationQE05090
Schiff' s reagente fucsina-solfitoSigma-AldrichS5133
Tripsina-EDTA (0,25%)ThermoFisher Scientific25200056Fenolo rosso
Vybrant MTT Cell Viability AssayThermoFisher ScientificV13154
Perfusion Solution 1 (pH 7,4, filtro sterilizzato)  Stabile a 4 gradi C per 2 mesi
EBSSFisher Scientific14155063Completo a 200 mL
EGTA (0,5 M)Bioworld40520008-1200 µ L
HEPES (pH 7,3, 1 M)ThermoFisher Scientific AAJ16924AE2 mL 
Soluzione di perfusione 2 (pH 7,4, filtro sterilizzato)  Stabile a 4 gradi C per 2 mesi
CaCl2· 2H20 (1,8 mM)SigmaC7902-500G360 &; L di 1 M di magazzino 
EBSS (senza calcio, senza magnesio, senza rosso fenolo)Fisher Scientific14-155-063Completo fino a 200 mL
HEPES (1 M)ThermoFisher ScientificAAJ16924AE2 mL 
MgSO4· 7H20 (0,8 mM)Sigma30391-25G160 &; L di 1 M
stockPerfusion Solution 3  Preparato fresco prima dell'uso
Soluzione 250 mL
LiberaseRoche54011270010,094 unità Wunsch/mL
Cocktail anestetico per topi 
Acepromzine0,25 mg/mL concentrazione finale
Ketamina7,5 mg/mL concentrazione finale
Xilazina1,5 mg/mL concentrazione finale
SoftwareURL
Benchlinghttps://www.benchling.com/
ImageJhttps://imagej.nih.gov/ij/
TIDE: Tracciamento di Indels mediante decomposizionehttps://tide.nki.nl/
Piastre per colture primarie in

Riferimenti

  1. Pampols, T. Inherited metabolic rare disease. Advances in Experimental Medicine and Biology. 686, 397-431 (2010).
  2. Saudubray, J. M., Sedel, F., Walter, J. H. Clinical approach to treatable inborn metabolic diseases: an introduction. Journal of ....

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Ristampe e permessi

Tag

Isolamento degli epatocitiDelivery tramite elettroporazioneEditing CRISPR-Cas9Trasfezione di mRNAPerfusione retrogradaKnockdown genicoDosaggio dell'albuminaFluorescenza GFP