Colture neuronali ippocampali per rilevare e studiare nuovi anticorpi patogeni coinvolti nell'encefalite autoimmune

Summary

L'encefalite autoimmune è una nuova categoria di malattie mediate da anticorpi del sistema nervoso centrale. I neuroni ippocampali possono essere utilizzati per scoprire e caratterizzare questi anticorpi. Questo articolo fornisce un protocollo per la coltura cellulare primaria e l'immunocolorazione per determinare gli autoanticorpi nel siero e nel liquido cerebrospinale dei pazienti.

Abstract

Negli ultimi 15 anni, una nuova categoria di malattie mediate da anticorpi del sistema nervoso centrale (SNC) è stata caratterizzata ed è ora definita come "encefalite autoimmune" (AE). Attualmente sono note 17 sindromi AE e tutte sono associate ad anticorpi contro la superficie delle cellule neuronali o le proteine sinaptiche. Le sindromi cliniche sono complesse e variano a seconda del tipo di anticorpo associato. La più nota di queste malattie è l'encefalite anti-N-metil D-aspartato (NMDAR), che è un disturbo neuropsichiatrico di spicco associato a gravi disturbi della memoria e del comportamento. Gli anticorpi associati reagiscono con la subunità GluN1 del NMDAR nel dominio N-terminale. L'approccio più frequentemente utilizzato per la scoperta e la caratterizzazione degli anticorpi AE include la coltura di neuroni ippocampali dissociati, fetali, roditori. Durante il processo di caratterizzazione degli anticorpi, i neuroni vivi in coltura sono esposti al siero o al liquido cerebrospinale dei pazienti e il rilevamento della reattività indica che i campioni di siero o CSF del paziente contengono anticorpi contro gli antigeni di superficie neuronale. Le colture ippocampali possono anche essere utilizzate per determinare se gli anticorpi nei pazienti sono potenzialmente patogeni esaminando se causano alterazioni strutturali o funzionali dei neuroni. Il livello di successo di questi studi dipende dalla qualità delle colture e dai protocolli utilizzati per ottenere e rilevare la reattività dei campioni di pazienti. Questo articolo fornisce un protocollo ottimizzato per la coltura cellulare primaria di neuroni ippocampali di ratto fetale combinato con immunocolorazione per determinare la presenza di anticorpi nel siero o nel liquido cerebrospinale dei pazienti. Viene inoltre presentato un esempio di come esaminare i potenziali effetti patogeni degli anticorpi NMDAR utilizzando neuroni in coltura e imaging del calcio.

Introduction

L'encefalite autoimmune (AE) è una categoria recentemente scoperta di malattie del sistema nervoso centrale (SNC) mediate da anticorpi che colpiscono la superficie neuronale o le proteine sinaptiche ^1,2. Le caratteristiche cliniche variano a seconda dell'anticorpo, ma comunemente includono disturbi della memoria e della cognizione, comportamento alterato e sintomi psichiatrici, movimenti anormali, disfunzione del sonno, diminuzione del livello di coscienza e convulsioni. Questi disturbi possono colpire individui di tutte le età, con alcuni tipi di AE che colpiscono prevalentemente bambini e giovani adulti².

Negli ultimi 15 anni sono state descritte 17 sindromi AE con anticorpi contro specifiche proteine di superficie neuronale/sinaptica (Tabella 1). Alcuni esempi dei bersagli neuronali includono i recettori eccitatori sinaptici NMDAR^3,4 e AMPAR⁵, il recettore inibitorio sinaptico GABAbR^6, la proteina secreta neuronale LGI1⁷ e la molecola di adesione cellulare IgLON5⁸. Per la maggior parte di questi eventi avversi, gli studi hanno dimostrato che gli anticorpi interrompono la struttura o la funzione del loro antigene bersaglio, sostenendo fortemente un ruolo patogeno. Ad esempio, nell'encefalite anti-NMDAR, gli anticorpi reagiscono con il dominio N-terminale della subunità GluN1 del NMDAR, producendo un'internalizzazione selettiva e reversibile di questi recettori che si traduce in alterazioni neuropsichiatriche prominenti 4,9,10,11. Pertanto, l'identificazione di uno qualsiasi dei 17 anticorpi noti nel siero o nel liquido cerebrospinale di un paziente può anche essere utilizzata come test diagnostico che stabilisce la diagnosi di un evento avverso specifico.

Una delle tecniche più frequentemente utilizzate per l'identificazione e la caratterizzazione di questi anticorpi include l'uso di colture di neuroni ippocampali dissociati, fetali, roditori. Queste colture sono utili per diversi motivi: il cervello embrionale è facile da dissociare e contiene un basso livello di cellule gliali, la principale fonte di contaminazione nelle colture neuronali¹²; la popolazione cellulare dell'ippocampo è relativamente omogenea rispetto alla maggior parte delle altre regioni del SNC, con cellule piramidali che rappresentano la stragrande maggioranza^13,14; le colture sono preparate da embrioni in stadio avanzato quando la generazione di neuroni piramidali è completa, ma le cellule granulari non si sono ancora sviluppate, aumentando ulteriormente l'omogeneità della coltura; Quando coltivati, i neuroni piramidali esprimono la maggior parte delle loro principali caratteristiche fenotipiche, sono in grado di formare dendriti ben sviluppati e stabilire reti sinapticamente connesse che possono essere utilizzate per indagini strutturali ed elettrofisiologiche^12,13; Poiché gli anticorpi non possono penetrare nei neuroni vivi, l'uso di colture vive consente l'identificazione di bersagli antigenici che risiedono sulla superficie cellulare; e l'immunoprecipitazione del complesso anticorpo-antigene da colture neuronali consente l'identificazione dell'antigene bersaglio⁵.

Il successo degli studi che utilizzano colture neuronali dipende fortemente dalla qualità delle colture e dai protocolli utilizzati per valutare l'immunoreattività del siero o del liquido cerebrospinale (CSF) di un paziente. Le variabili che possono influenzare le colture includono le procedure per l'isolamento dell'ippocampo prima dello sviluppo della coltura, la dissociazione del tessuto, la densità di placcatura, la superficie di crescita utilizzata e la composizione dei terreni^13,15,16. Questo articolo fornisce un protocollo ottimizzato per la coltura cellulare primaria di neuroni ippocampali di ratto fetale combinato con immunocolorazione fluorescente che può essere utilizzata per determinare la presenza di anticorpi contro antigeni AE noti e potenzialmente nuovi bersagli di superficie. Fornisce anche un esempio di come esaminare gli effetti patogeni degli anticorpi NMDAR mediante tecniche di imaging di cellule vive utilizzando neuroni ippocampali in coltura che esprimono un indicatore di calcio geneticamente codificato (GECI) della famiglia GCaMP, GCaMP5G.

Proteina bersaglio	Funzione proteica	Compartimento celle	Sindrome principale
NMDAR	Ion Chanel	Proteina sinaptica	Encefalite anti-NMDAR
AMPAR	Ion Chanel	Proteina sinaptica	Encefalite limbica
GluK2	Ion Chanel	Proteina sinaptica	Encefalite
GABAaR	Ion Chanel	Proteina sinaptica	Encefalite
GABAbR	Recettore metabotropico	Proteina sinaptica	Encefalite limbica
mGluR1	Recettore metabotropico	Proteina sinaptica	Encefalite
mGluR2	Recettore metabotropico	Proteina sinaptica	Encefalite
mGluR5	Recettore metabotropico	Proteina sinaptica	Encefalite
D2R	Recettore metabotropico	Proteina sinaptica	Encefalite da gangli della base
LGI1	Molecola di adesione	Proteine della superficie cellulare	Encefalite limbica
CASPR2	Molecola di adesione	Proteine della superficie cellulare	Encefalite limbica
IgLON5	Molecola di adesione	Proteine della superficie cellulare	Malattia anti-IgLON5
Neurexin-3α	Molecola di adesione	Proteine della superficie cellulare	Encefalite
DNER (Tr)	Proteina transmembrana	Proteine della superficie cellulare	Encefalite
SEZ6L	Proteina transmembrana	Proteine della superficie cellulare	Encefalite
Anfifisina	Molecola strutturale	Proteine della superficie cellulare	Encefalite limbica
DPPX	Peptidasi	Proteine della superficie cellulare	Encefalite

Tabella 1: Anticorpi contro la superficie delle cellule neuronali e le proteine sinaptiche.

Protocol

Tutte le procedure sono state approvate dal comitato etico locale dell'Università di Barcellona seguendo le normative europee (2010/63/UE) sull'uso e la cura degli animali da esperimento. Il consenso informato scritto è stato ottenuto dai pazienti e lo studio è stato approvato dal comitato di revisione istituzionale locale per l'uso di campioni umani (Hospital Clínic, HCB / 2018/0192).

NOTA: ci sono tre parti nel protocollo corrente. Il primo è per stabilire le colture neuronali, il secondo è per la rilevazione di anticorpi di superficie usando colture vive di neuroni e il terzo è per determinare la patogenicità di questi anticorpi.

PARTE 1: Istituzione di colture neuronali dell'ippocampo dissociato, fetale, roditore

1. Fasi preparatorie

1. Rivestimento in poli-L-lisina delle superfici galvaniche (3 giorni prima della dissezione)
   1. Preparare il tampone borato aggiungendo 2,38 g di acido borico e 1,27 g di borace a 500 ml di acqua distillata e mescolando per 15 minuti fino a quando non si scioglie. Sotto un cappuccio, sterilizzare la soluzione tampone filtrando (dimensione dei pori 0,2 μm), etichettare e conservare a temperatura ambiente (RT).
      NOTA: Questa soluzione è stabile e può essere utilizzata per 6 mesi.
      ATTENZIONE: Quando si prepara il tampone borato, indossare i dispositivi di protezione individuale raccomandati.
   2. Preparare la soluzione madre di poli-L-lisina (PLL) (100 mg/ml) aggiungendo 1 g di PLL a 10 ml di acqua distillata e mescolando fino a quando non si scioglie. Preparare 500 μL di aliquote di soluzione madre PLL. Per raggiungere una concentrazione finale di 1 mg/ml, aggiungere 500 μL di aliquota PLL a 50 mL di tampone borato e agitare fino a dissoluzione, e sterilizzare la soluzione filtrando (dimensione dei pori 0,2 μm).
      NOTA: Questa soluzione è stabile e può essere utilizzata per 6 mesi.
   3. Preparare le superfici per il rivestimento. Utilizzare vetrini di copertura da 12 mm di diametro per procedure di immunocolorazione e piatti con fondo di vetro per studi che includeranno l'imaging di neuroni vivi. Se si utilizzano copertine, autoclavare e quindi posizionare cinque vetrine in ogni piatto (diametro 3,5 cm).
      NOTA: Lo spessore del coprislip influisce sulla qualità e sull'intensità del segnale delle immagini acquisite. La maggior parte degli obiettivi per microscopi sono progettati per i vetrini #1.5. Scegliere le copertine appropriate in base alla configurazione e alle tecniche di imaging.
   4. Sotto un cappuccio, aggiungere 1,5 ml di soluzione PLL a ciascun piatto (piatto con fondo di vetro o piatto da 3,5 cm con cinque vetrini). Assicurati che tutti i coprivetrini siano sommersi e conservati presso RT per 24 ore.
   5. 2 giorni prima della dissezione, aspirare la soluzione PLL e lavare con acqua sterile priva di endotossine, assicurandosi che i vetrini di copertura siano immersi. Conservare l'acqua nei piatti e conservare a RT per 24 ore.
   6. 1 giorno prima della dissezione, aspirare l'acqua e sostituirla con terreni di coltura NB + B27 (vedi sotto), e posizionare i piatti in un'incubatrice a 37 °C per 24 ore.
2. Preparazione dei terreni di coltura e della soluzione madre (1 giorno prima della dissezione)
   1. Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM): A 500 mL di DMEM High Glucose (4,5 g/L) senza L-glutammina e rosso fenolo, aggiungere 50 mL di siero di cavallo, 50 mL di siero fetale bovino (FBS), 10 mL di L-glutammina (200 mM), 10 mL di piruvato di sodio (100 mM), 10 mL di penicillina-streptomicina (10.000 U/mL). Filtrare (dimensione dei pori 0,2 μm) e conservare in 5 mL di aliquote a 4 oC con tappo ben chiuso.
      NOTA: questa soluzione è stabile e può essere utilizzata per 1 mese.
   2. Terreno neurobasale (NB) integrato con B27 (NB + B27): A 50 ml di terreno NB senza rosso fenolo, aggiungere 1 mL di integratore B27.
   3. Hibernate-E medium integrato con B27 (Hibernate + B27): A 50 mL di Hibernate-E mezzo, aggiungere 1 mL di B27 supplemento.
   4. Soluzione fisiologica extracellulare (EPS): A 1 L di acqua sterile, aggiungere quanto segue alle concentrazioni finali specificate: NaCl (140 mM), KCl (3,5 mM), HEPES (10 mM), glucosio (20 mM) e CaCl 2 (₂ mM). Mescolare fino a dissoluzione e regolare il pH a 7,4 aggiungendo NaOH (0,5 M) o HCl (0,5 M). Sotto il cofano, sterilizzare filtrando (dimensione dei pori di 0,2 μm) e conservare a 4 oC.
3. Attrezzature e altri materiali di laboratorio (giorno della dissezione)
   1. Impostare un bagnomaria a 37 °C. Riscaldare le seguenti aliquote: 50 mL di HBSS e 5 mL di DMEM.
   2. Sterilizzare i seguenti strumenti immergendoli in un becher contenente etanolo assoluto (Figura 1B): pinze, pinze curve, forbici, pinze a curva fine, pinze dritte fini, forbici chirurgiche, pinze ad angolo fine e forbici a molla di precisione.
      NOTA: per proteggere gli utensili, posizionare un materiale morbido (ad esempio, salviette di precisione scientifiche) sul fondo del becher.
   3. Riempi due vassoi con ghiaccio e posiziona i seguenti elementi.
      1. Vassoio del ghiaccio 1 (Figura 1C): posizionare gli strumenti chirurgici nel becher con etanolo assoluto, un becher con HBSS per il risciacquo degli strumenti chirurgici, un piatto da 10 cm con HBSS per posizionare gli embrioni, un piatto da 6 cm con HBSS per posizionare le teste degli embrioni e un piatto da 6 cm con ibernazione + B27 per posizionare il cervello degli embrioni.
      2. Vassoio del ghiaccio 2: Posizionare un'aliquota da 1 mL di tripsina al 2,5% e un piatto da 3,5 cm con ibernazione + B27 per l'ippocampo sezionato.
         NOTA: Il tempo necessario per questa procedura dipende dall'esperienza dello sperimentatore e dal numero di embrioni da sezionare. Pertanto, il ghiaccio deve rimanere congelato per il tempo necessario. I vassoi in polistirolo sono raccomandati per questo scopo.

2. Dissezione e semina (Figura 1)

1. Isolamento ippocampale
   NOTA: I ratti gravidi con embrioni a E18 vengono sottoposti a eutanasia immediatamente prima dell'inizio del protocollo in conformità con il comitato etico locale dell'Università di Barcellona, seguendo le normative europee (2010/63 / UE) sull'uso e la cura degli animali da esperimento. In questo protocollo, l'inalazione di anidride carbonica (CO₂) è stata utilizzata come metodo di eutanasia.
   1. Sezionare il ratto a livello del peritoneo addominale usando pinze e forbici. Estrarre l'utero con gli embrioni E18 e metterlo in un piatto di 10 cm che è stato raffreddato sul ghiaccio.
      NOTA: È importante evitare che i peli di ratto si attacchino agli embrioni. Si consiglia di utilizzare abbondanti quantità di etanolo al 70% per sterilizzare l'addome. Da questo passaggio in poi, lavorare all'interno della cappa sul vassoio del ghiaccio 1.
   2. Aprire le sacche embrionali e trasferire gli embrioni nel piatto da 10 cm con HBSS, assicurandosi che gli embrioni siano completamente immersi.
   3. Rimuovere la testa dell'embrione con le forbici e posizionarla nel piatto da 6 cm con HBSS. Ripeti questo processo con tutti gli embrioni.
      NOTA: Per evitare la contaminazione, tutti i tessuti ad eccezione delle teste embrionali devono essere gettati in un contenitore con tappo a vite.
   4. Tenere la testa dell'embrione con una pinza finemente curva e perforare le orbite con un paio di pinze finemente dritte, entrando con un angolo di 45°, quindi rilasciare la pinza finemente curva.
      NOTA: La pinza non deve passare attraverso il cervello, quindi è importante mantenere l'angolo quando si entra.
   5. Sezionare la pelle e il cranio con le forbici chirurgiche, partendo dall'osso occipitale fino all'osso frontale. Rimuovere il cervello con un paio di pinze a ricurva fine e posizionarlo nel piatto da 6 cm con ibernazione + B27. Ripeti questo processo fino a quando tutti i cervelli non vengono recuperati.
   6. Separare Sagittalmente i telencefaloni con la pinza fine-dritta.
      NOTA: Da questo passo in poi, la dissezione dell'ippocampo viene effettuata sotto uno stereomicroscopio. Si consiglia di utilizzare lampade articolate in modo che la luce illumini la superficie di dissezione dai lati. Si consiglia inoltre di utilizzare uno sfondo nero in quanto ciò fornisce più contrasto, consentendo di distinguere meglio l'ippocampo.
   7. Preparare un piatto da 10 cm posizionando gocce di Hibernate + B27 a distanze di 1 cm (ad esempio, in un cerchio). Posizionare un telencefalo per goccia di Hibernate + B27 e visualizzare attraverso il cannocchiale di dissezione (si consiglia un ingrandimento dell'obiettivo 1,25x).
   8. Sbucciare con cura le meningi e rimuovere il talamo per visualizzare meglio l'ippocampo.
   9. Sezionare l'ippocampo con le forbici a molla di precisione e posizionarlo nel piatto da 3,5 cm con ibernazione + B27 nella vaschetta del ghiaccio 2. Ripetere per ogni telencefalo fino a quando tutti gli ippocampi sono raccolti.
   10. Raccogliere con cura tutti gli ippocampi con una pipetta Pasteur e trasferirli in un tubo da 50 ml.
       NOTA: Prendere il volume minimo di Hibernate + B27 quando si raccoglie l'ippocampo in modo da non diluire la tripsina.
2. Dissociazione cellulare
   1. Dissociazione enzimatica dell'ippocampo
      1. Nel tubo da 50 mL contenente l'ippocampo, aggiungere 1 mL di tripsina al 2,5% e portarlo a un volume di 5 mL con HBSS. Incubare per 15 minuti a bagnomaria a 37 °C.
      2. Per diluire la tripsina, aggiungere 10 ml di HBSS preriscaldato e incubare per 5 minuti a bagnomaria a 37 °C.
      3. Trasferire gli ippocampi che ora appaiono come una massa di muco in un tubo da 50 mL con una micropipetta da 1.000 μL, aggiungere 6 mL di HBSS preriscaldato e incubare per 5 minuti a bagnomaria a 37 °C.
   2. Dissociazione meccanica dell'ippocampo
      1. Trasferire la massa in un tubo da 2 mL con fondo conico, prendendo il volume minimo. Aggiungere 1 mL di materiale DMEM preriscaldato. Omogeneizzare il pellet con una micropipetta da 1.000 μL aspirando delicatamente su e giù.
         NOTA: È fondamentale evitare di generare bolle durante l'aspirazione poiché le bolle possono lisare le cellule.
      2. Ripetere l'aspirazione su e giù con una pipetta di vetro pre-tirata (10x-20x), con la punta a contatto con il fondo conico del tubo. Evitare di generare bolle. Alla fine di questo passaggio, la miscela deve essere traslucida.
      3. Una volta miscelata in modo omogeneo in modo che la miscela sia traslucida, trasferire la miscela in un tubo contenente 4 mL di fluido DMEM a 37 °C e omogeneizzare con una pipetta di vetro mediante pipettaggio su e giù.
3. Semina cellulare
   1. Contare le celle. Il numero di neuroni nella soluzione può essere contato secondo le procedure di laboratorio standard.
      NOTA: Negli esperimenti di imaging per il rilevamento degli anticorpi e l'attività del calcio, una concentrazione di 50.000 cellule per piatto di 3,5 cm è ottimale.
   2. Mantenere le celle sospese, ritirare il volume calcolato e placcare in piatti da 3,5 cm contenenti vetrini rivestiti in PLL o nelle piastre con fondo di vetro rivestite in PLL.
   3. Distribuire uniformemente le celle sui piatti agitando delicatamente con movimenti incrociati (avanti e indietro, poi da un lato all'altro; ripetere se necessario) e posizionare i piatti nell'incubatore di CO₂ (5%).
      NOTA: È importante utilizzare movimenti incrociati per evitare che le cellule si depositino nella periferia del piatto.
   4. Ogni settimana, aggiungere circa 1 ml di NB + B27, in modo che la coltura non si asciughi.
      NOTA: Dopo 2 settimane (14 giorni in vitro [div]), i neuroni sono maturi ed esprimono tutti i fattori da utilizzare per la sperimentazione. Il numero medio totale di neuroni ottenuti utilizzando questo protocollo è di circa 2,5 x 10⁶ neuroni provenienti da una media di 12 embrioni E18 per rata gravida.

   
PARTE 2: Utilizzo di colture neuronali ippocampali per la rilevazione di anticorpi nelle proteine della superficie delle cellule neuronali

NOTA: Questa parte del protocollo dimostra come le colture ippocampali vengono utilizzate per identificare gli anticorpi anti-NMDAR nel siero e / o nel liquido cerebrospinale di pazienti con encefalite anti-NMDAR. L'immunocolorazione fluorescente viene utilizzata per visualizzare la reattività nei neuroni vivi, ma potrebbero essere utilizzati anche altri metodi di visualizzazione. Un controllo appropriato per questo esperimento sarebbe siero o liquido cerebrospinale da un individuo sano. Quando si utilizzano campioni umani, tenere presente che potrebbe essere necessaria l'approvazione del comitato etico istituzionale.

3. Immunocolorazione fluorescente dal vivo

1. Utilizzare 14 div cell che sono state coltivate su coprivetrini (50.000 celle per piatto da 3,5 cm contenente cinque copertine).
2. All'interno del cappuccio, sciacquare i vetrini con NB preriscaldato a 37 °C.
3. Aggiungere il campione che in questo caso contiene anticorpi anti-NMDAR (usati come anticorpo primario) diluiti in terreni NB a 1:200 per il siero o 1:2 per il CSF e incubare 1 ora a 37 °C (all'interno dell'incubatore di CO₂ (5%).
4. Risciacquare accuratamente con PBS 3x a RT.
5. Aggiungere la soluzione di fissazione (4% di formaldeide in PBS) e incubare a RT per 5 minuti.
   ATTENZIONE: Quando si maneggia formaldeide al 4%, lavorare all'interno del cappuccio e indossare i dispositivi di protezione individuale raccomandati.
6. Lavare 3 volte con PBS per 5 minuti ciascuno.
7. Aggiungere l'anticorpo secondario Goat anti-Human AF488 alla diluizione 1:1000 e incubare a RT per 1 ora.
   NOTA: Durante l'incubazione, proteggere dall'esposizione alla luce coprendo con un foglio di alluminio.
8. Lavare 3 volte con PBS per 5 minuti ciascuno. Risciacquare con acqua distillata
9. Montare i coperchi con un mezzo di montaggio liquido (ad esempio, supporti di montaggio antisbiadimento con DAPI; circa 7 μL), aspirare il liquido residuo e risciacquare con acqua distillata. I neuroni sono ora pronti per l'imaging a fluorescenza.
   ATTENZIONE: Quando si maneggia il mezzo di montaggio, indossare i dispositivi di protezione individuale consigliati.

   

PARTE 3: Dimostrazione degli effetti patogeni degli anticorpi mediante imaging del calcio

NOTA: Questa parte del protocollo dimostra come determinare se gli anticorpi nei pazienti hanno un effetto funzionale sulle colture, il che suggerirebbe patogenicità. Al fine di aumentare la significatività degli effetti, è stato utilizzato un pool di CSF di otto pazienti. L'attività del calcio delle colture vive è stata registrata dopo stimolazione chimica (NMDA + Glicina) utilizzando l'indicatore di calcio a fluorescenza GECI (GCaMP5G). Questi studi richiedono un microscopio a fluorescenza invertita con una camera cellulare in grado di mantenere le condizioni fisiologiche richieste dei neuroni.

4. Imaging del calcio

1. Utilizzare 14-18 div cell che sono state coltivate su coprivetrini (50.000 celle per piatto da 3,5 cm con cinque copertine)
2. 1 settimana prima dell'imaging, aggiungere il vettore virale pAAV2-CAG-GCaMP5G a 2,5 x 10¹⁰ GC/mL alle cellule e incubare per 5-7 giorni.
   NOTA: Questo vettore AAV sierotipo 2 preconfezionato disponibile in commercio sovraesprime l'indicatore di calcio geneticamente codificato GCaMP5G sotto un promotore CAG.
3. 1 giorno prima dell'imaging, aggiungere il campione del paziente (in questo esempio, un pool di CSF diluito 1:25 in NB + B27) e incubare per 24 ore. Filtrare sempre campioni umani (dimensione dei pori di 0,2 μm) prima dell'uso per evitare la contaminazione.
   NOTA: Per questi studi, il CSF di controllo da soggetti sani deve essere eseguito in parallelo.
4. Il giorno dell'imaging, preparare la configurazione di imaging e impostare la camera cellulare del microscopio a 37 °C, riempire la corsia con acqua distillata e infondere con il 5% di CO₂ per mantenere le condizioni fisiologiche della cellula.
5. Nella cappa, lavare le celle dalla fase 3 con 3 ml di EPS preriscaldato a 37 °C
6. Coprire le cellule con 2,45 ml di EPS e trasferirle nella camera cellulare del microscopio. Aggiungere NBQX (10 μM) per bloccare i recettori AMPA e KA per visualizzare esclusivamente la risposta del recettore NMDA.
7. Nel microscopio a fluorescenza invertita dotato di una lampada al mercurio e di un cubo filtrante FITC, acquisire un filmato di 2 minuti con fotogrammi registrati ogni 100 ms (attività spontanea).
   NOTA: è stato utilizzato un obiettivo aereo 20x NA 0,75 e le immagini (512 x 512 pixel, scala di grigi a 16 bit) sono state scattate ogni 100 ms con una fotocamera sCMOS.
8. Acquisire il secondo filmato di 4 min con fotogrammi registrati ogni 100 ms. Poco dopo aver iniziato l'acquisizione, aggiungere la soluzione di stimolazione (NMDA [100 μM] + glicina [1 μM]) al piatto.
   NOTA: l'aggiunta di supporti nella parabola genererà turbolenze che potrebbero interrompere le condizioni di imaging (messa a fuoco, intensità di fluorescenza e/o segnale di fondo non specifico). Non aggiungere più di 50 μL di soluzione nel piatto riempito da 2,5 mL per ridurre la probabilità di tali alterazioni.
9. Utilizzando un software di elaborazione delle immagini (qui è stato utilizzato ImageJ), estrarre il segnale di fluorescenza nel tempo, ottenuto dopo la stimolazione, dalle colture incubate con il paziente e controllare i campioni di CSF.
   NOTA: Le sonde GCaMP, quando si legano agli ioni calcio liberi, subiscono un cambiamento conformazionale che le fa diventare più luminose. Pertanto, l'aumento dell'intensità della fluorescenza è correlato con un afflusso di calcio dovuto alla depolarizzazione neuronale.
10. Determinare le regioni di interesse (ROI) da analizzare. Segmentare manualmente i somi dei neuroni e aggiungere i ROI al gestore del ROI (Analizza > Strumenti > Gestione ROI > Aggiungi). Salva il ROI dal menu ROI Manager (Altro > Salva).
11. Impostare le misurazioni (Analizza > Imposta misurazioni) e selezionare il valore di grigio medio. Estrarre il profilo di intensità media della fluorescenza dai somi cellulari facendo clic su Altro > Multi misura, quindi salvare la tabella generata come foglio di calcolo .xls.
12. Eseguire analisi statistiche per confrontare la fluorescenza tra i gruppi (CSF dei pazienti vs. CSF di controllo).

Results

Istituzione di colture neuronali ippocampali dissociate, fetali, roditori
Il protocollo qui presentato si basa sugli studi influenti sulla coltura delle cellule nervose eseguiti da Banker e Goslin¹⁵. Il protocollo è stato perfezionato per ottenere colture neuronali con morfologia, densità e purezza ottimali per l'esecuzione di studi di rilevamento degli anticorpi di superficie neuronale. Il protocollo di dissezione e semina è diviso in tre parti (Figura 1A). La prima parte, l'isolamento ippocampale, consiste nell'estrazione chirurgica del tessuto vivente (Figura 1A, pannello di sinistra). Come indicato dalla figura, i ratti Wistar gravidi con embrioni E18 sono il materiale di partenza chiave per una coltura di successo. Una volta estratto il cervello dagli embrioni E18, la microchirurgia viene eseguita con uno stereomicroscopio. Con strumenti appropriati (Figura 1B) e una manipolazione precisa, è possibile separare l'ippocampo dal resto del tessuto nervoso. La disposizione dei tessuti nei mezzi specifici è illustrata nella Figura 1C. La seconda parte del protocollo consiste nella dissociazione delle cellule ippocampali. È suddiviso in due fasi (Figura 1A, pannello centrale): dissociazione enzimatica e dissociazione meccanica dell'ippocampo, che si traducono in singole cellule intatte, dissociate. Utilizzando questa metodologia, è possibile ottenere colture cellulari senza aggregati cellulari, come rappresentato nella Figura 2A-D. La terza parte del protocollo consiste nella semina cellulare (Figura 1A, pannello di destra). Questa parte del protocollo è fondamentale per regolare la densità e l'omogeneità della coltura neuronale nella piastra. Contare le cellule e seminare 50.000 neuroni in un'area di un piatto di 3,5 cm fornisce una densità ottimale per effettuare esperimenti non solo per determinare la presenza di anticorpi contro le proteine della superficie delle cellule neuronali (Figura 3) ma anche per analizzare la patogenicità di questi anticorpi con imaging del calcio (Figura 4).

Figura 1: Protocollo visivo per colture primarie di neuroni ippocampali. (A) Diagramma di flusso che mostra le tre parti del protocollo per la preparazione di colture cellulari dissociate di neuroni ippocampali da ratti embrionali a E18. Il protocollo è diviso in 1. Isolamento ippocampale, 2. Dissociazione cellulare, e 3. Semina cellulare. (B) Selezione degli strumenti raccomandati per l'isolamento ippocampale raggruppati in tre categorie: (1- Forcipe, 2- Pinze curve, 3- Forbici) per la raccolta degli embrioni, (4- Pinze a curva fine, 5- Pinze dritte fini, 6- Forbici chirurgiche) per l'estrazione del cervello e (7- Pinze ad angolo fine, 8- Forbici a molla di precisione) per l'isolamento dell'ippocampo. (C) Rappresentazione schematica del vassoio del ghiaccio 1 con piastre e supporti necessari per l'isolamento dell'ippocampo. Gli embrioni e le teste sono collocati in HBSS, mentre i cervelli sono collocati in Hibernate medium + B27. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Le colture di neuroni ippocampali a 18 div sono mature, interconnesse ed esprimono proteine strutturali e funzionali.
Nella crescita e maturazione delle colture neuronali si possono apprezzare due fasi differenziate: la fase di polarizzazione del neurone (Figura 2A,B) e la fase di sviluppo dendritico e costruzione della rete sinaptica (Figura 2C,D). Le cellule su 1 div sono distribuite uniformemente e hanno aderito alla piastra, sviluppando una lamella attorno al corpo cellulare con neuriti minori che iniziano ad estendersi (Figura 2A). Dopo alcuni giorni in coltura, i neuriti si estendono per una breve distanza. Le cellule mostrano una polarizzazione significativa, ma c'è poca crescita netta (Figura 2B). Dopo questa fase, la sinaptogenesi è prominente e i neuroni iniziano a interconnettersi. La rete neuronale continua a crescere e diventa più complessa (Figura 2C). A 18 div, i neuroni sono maturi e interconnessi; la rete neuronale è costruita (Figura 2D). Una volta che le spine sinaptiche sono formate e collegate, i neuroni sono completamente polarizzati ed esprimono tutte le proteine funzionali e strutturali. Tra le molte proteine espresse dai neuroni maturi in coltura, il recettore neuronale NMDA (Figura 2E) e la proteina sinaptica PSD95 (Figura 2F) sono stati scelti qui come marcatori rappresentativi. Inoltre, è possibile visualizzare selettivamente gli assoni marcando i neurofilamenti (NF) (Figura 2G) e visualizzando i dendriti prendendo di mira la proteina MAP2 (Figura 2H).
Figura 2: Andamento temporale della maturazione di colture cellulari dissociate di neuroni ippocampali. (A-D) Immagini a contrasto di fase dei neuroni ippocampali durante i primi 18 giorni di coltura. (A) Neuroni a 1 div al momento dell'attaccamento al substrato rivestito di PLL. (B) L'emergere di piccoli neuriti nei neuroni a 5 div. (C) I neuroni a 11 div hanno sviluppato neuriti lunghi che si allungano e acquisiscono caratteristiche assonali. (D) I neuroni a 18 div sono maturi e hanno formato una rete neurale. Barra di scala (A-D) = 40 μm. (E-H) Immagini fluorescenti rappresentative prese al microscopio a scansione laser confocale utilizzando marcatori selettivi per mostrare neuroni maturi a 18 div. Le colture neuronali sono state fissate e immunocolorate con anticorpi che colorano selettivamente (E) il recettore neuronale (NMDAR), (F) il marcatore sinaptico (PSD95), (G) il marcatore assonale (neurofilamento, NF) e (H) il marcatore dendritico (MAP2). Barra di scala (E-H) = 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Gli anticorpi nei campioni di pazienti reagiscono con gli antigeni di superficie delle cellule neuronali
I campioni (siero e CSF) ottenuti da pazienti affetti da encefalite anti-NMDAR contengono autoanticorpi che riconoscono il NMDAR presente sulla superficie dei neuroni. L'incubazione delle colture con i campioni del paziente produce un intenso segnale di fluorescenza sulla superficie cellulare e sui dendriti (Figura 3A,C). Al contrario, i campioni di controllo non producono alcun segnale di fluorescenza quando somministrati alle colture neuronali (Figura 3B,D). Questi risultati mostrano come le colture possono essere utilizzate per lo screening di campioni di pazienti per gli anticorpi e possono portare all'identificazione di nuovi anticorpi che colpiscono la superficie delle cellule neuronali. 

Il campione di CSF del paziente diminuisce la concentrazione intracellulare di calcio nelle colture indotte da NMDA di neuroni ippocampali
Per valutare l'effetto degli anticorpi dei pazienti sull'attività neurale (dopo 24 ore di trattamento), i transitori intracellulari di calcio sono stati monitorati otticamente dai neuroni coltivati in tempo reale dopo stimolazione mediata da NMDA. L'applicazione di NMDA genera un aumento dell'intensità della fluorescenza, come indicato da un cambiamento nella fluorescenza verde intracellulare (Figura 4A e Video supplementare 1). I neuroni trattati con il campione di CSF di controllo hanno mostrato una maggiore differenza nell'intensità della fluorescenza (56%) quando lo stimolatore è stato applicato rispetto alle cellule trattate con il campione di CSF del paziente. Sono state misurate le differenze nell'intensità della fluorescenza e sono state confrontate le curve di stimolazione mediate da NMDA dai dati estratti dal soma delle cellule (Figura 4B, C). Le curve di stimolazione mostrano che c'è stato un afflusso intracellulare di calcio in entrambi gli scenari, ma le colture trattate con il CSF dei pazienti (linea grigia) hanno mostrato una risposta inferiore rispetto alle colture trattate con controllo (linea nera). Questi risultati dimostrano che gli anticorpi presenti nel liquido cerebrospinale dei pazienti diminuiscono l'attività cellulare a causa dell'interazione degli anticorpi con il NMDAR, e quindi causano un effetto patogeno.

Figura 3: Gli anticorpi dei pazienti reagiscono con la superficie delle colture neuronali. (A,E) Il siero e il liquido cerebrospinale di pazienti con encefalite anti-NMDAR reagiscono con la superficie cellulare dei neuroni ippocampali vivi di ratto, (B,F), mentre il siero e il liquido cerebrospinale dei soggetti di controllo non mostrano reattività. Barra di scala (A,B,E,F) = 20 μm. Immagine di ingrandimento più elevato di un dendrito (63x) che mostra il tipico pattern superficiale di reattività per (C,G) il siero e il liquido cerebrospinale del paziente e (D,H) negativo per i controlli. Le immagini sono state scattate al microscopio a scansione laser confocale. Barra di scala = 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Gli anticorpi dei pazienti riducono l'afflusso di calcio nei neuroni di ratto che esprimono GCaMP5G. (A) La somministrazione di soluzione di stimolazione (NMDA [100 μM] + Glicina [1 μM]) in colture di neuroni ha innescato un afflusso di calcio, come indicato dall'aumento della fluorescenza verde intracellulare (picco di stimolazione), rispetto all'immagine ripresa prima della stimolazione (pre-stimolazione). Dopo 120 s, l'intensità della fluorescenza diminuisce e si stabilizza (post-stimolazione). Le colture trattate con il CSF dei pazienti hanno mostrato una riduzione significativa (56%) dell'aumento del calcio mediato da NMDA rispetto al CSF del controllo. Le immagini sono state prese al microscopio a fluorescenza. Barra della scala = 20 μm. (B) Un grafico di uno dei tre esperimenti indipendenti che rappresentano l'intensità della fluorescenza nel tempo (180 s) per le colture trattate con CSF di controllo (linea nera) e CSF dei pazienti (linea grigia) dopo stimolazione NMDA (freccia blu). n(CSF dei controlli) = 20 celle; n(CSF dei pazienti) = 28 cellule. I dati sono rappresentati come media ± SEM. (C) I grafici a scatola mostrano la mediana, il 25° e il 75° percentile. I baffi indicano i valori minimo e massimo. La valutazione della significatività è stata effettuata mediante analisi bidirezionale della varianza (ANOVA; p < 0,0001) e test U di Mann-Whitney (p < 0,0001). Un valore di p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Video supplementare 1: Video che mostra due neuroni ippocampali che esprimono GCaMP5G fianco a fianco: neurone trattato con CSF di controllo (a sinistra) vs neurone trattato con CSF dei pazienti (a destra). L'applicazione di NMDAR (stimolazione) genera un aumento dell'intensità della fluorescenza intracellulare in entrambi i casi, ma con un livello significativamente più alto nel neurone trattato con il CSF del controllo rispetto a quello trattato con il CSF dei pazienti. Le immagini sono state prese al microscopio a fluorescenza e modificate con ImageJ applicando la tabella di ricerca (LUT) Fire. 1700 telai (170 s); accelerato 5 volte. Barra di scala = 10 μm. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

Il crescente campo dell'autoimmunità mediata da anticorpi ha aperto una finestra di opportunità per l'identificazione di autoanticorpi neuronali che possono essere utilizzati per migliorare la diagnosi e il trattamento dei pazienti. Le colture di neuroni ippocampali sono uno strumento essenziale per l'identificazione degli anticorpi; Pertanto, è importante eseguire un protocollo standardizzato per ottenere risultati affidabili e riproducibili. I passaggi più importanti da considerare, le limitazioni e la risoluzione dei problemi, sono discussi qui.

I passaggi critici di questo protocollo possono essere raggruppati in tre categorie a seconda che influenzino la purezza, l'omogeneità o la vitalità dei neuroni ippocampali.

Purezza - Per ottenere colture cellulari primarie ottimali, lo sperimentatore deve essere sicuro, addestrato e in grado di lavorare rapidamente, soprattutto per ridurre al minimo il tempo della dissezione. Anche se i neuroni piramidali sono il tipo di cellula principale, l'ippocampo contiene una varietà di interneuroni¹⁴. Per generare colture con cellule gliali minime, l'ippocampo deve essere estratto con il minimo tessuto circostante. L'uso di uno sfondo nero durante la dissezione aiuta a identificare i limiti dell'ippocampo sotto lo stereomicroscopio. Inoltre, si dovrebbe tener conto del fatto che densità cellulari più basse si traducono in un minore supporto paracrino e rendono più difficile mantenere la coltura¹³. Quindi, è importante tenere a mente questo equilibrio. Questo è importante negli studi di imaging che utilizzano un basso numero di cellule (50.000 neuroni per piatto di 3,5 cm). Per poter avere più tempo per l'estrazione dell'ippocampo, è necessario utilizzare Hibernate media che preserva il tessuto¹⁷. Anche lavorare con strumenti chirurgici adeguati è essenziale. Gli strumenti di alta precisione sono delicati, quindi la riproducibilità della tecnica dovrebbe essere garantita proteggendoli attentamente.

Omogeneità - Per sviluppare una coltura senza aggregati cellulari, la dissociazione meccanica delle cellule è stata migliorata combinando l'uso di pipette di vetro pre-tirate con una pipetta standard da 1.000 μL.

Viabilità - In questo protocollo, non sono stati aggiunti antibiotici perché influenzano l'eccitabilità neuronale e alterano le proprietà elettrofisiologiche dei neuroni coltivati¹⁸. Pertanto, la contaminazione è molto probabile se non vengono mantenuti i più alti standard di sterilità. Anche la temperatura è un fattore chiave. Mantenere il tessuto freddo durante l'isolamento dell'ippocampo rallenta il metabolismo e diminuisce la degradazione cellulare. Il tessuto è stato, quindi, tenuto sul ghiaccio fino al processo di dissociazione cellulare. Inoltre, è fondamentale trovare il corretto equilibrio durante la dissociazione enzimatica cellulare che disaggrega le cellule senza marcata lisi cellulare. In questo protocollo, i tempi di incubazione con tripsina e le successive fasi di lavaggio sono stati ottimizzati per ottenere singole cellule con spazio sufficiente per consentire la creazione di una rete neuronale appropriata.

I passaggi critici si trovano anche nelle registrazioni fluorescenti di immunocolorazione dal vivo e dell'attività del calcio dalle colture neuronali. Per eseguire con successo l'immunocolorazione dal vivo per determinare la presenza di anticorpi contro le proteine della superficie cellulare nei campioni di pazienti, è necessario evitare la permeabilizzazione delle cellule che consentirebbe agli anticorpi di accedere alle proteine intracellulari. Inoltre, in base al titolo degli anticorpi, il tempo di incubazione e la diluizione del campione devono essere regolati di conseguenza (ad esempio, anticorpi con titoli molto alti possono dare una colorazione di fondo che rende difficile l'interpretazione dei risultati). Quando si esegue la valutazione della patogenicità degli autoanticorpi con imaging del calcio, è necessario utilizzare un mezzo ottimale per le misurazioni dell'attività cellulare (ad esempio, la soppressione di Mg²⁺ nel terreno di coltura è importante per buone prestazioni). Inoltre, per l'imaging a fluorescenza, i mezzi con indicatori di pH come il rosso fenolo dovrebbero essere evitati in quanto introducono un segnale di fondo non specifico.

Ci sono due principali limitazioni dell'uso delle colture neuronali ippocampali. In primo luogo, rispetto alle linee cellulari stabili, le colture primarie devono essere generate continuamente, e questo implica l'uso regolare di animali da laboratorio. Le linee di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) potrebbero sostituire la necessità di utilizzare modelli animali, ma i protocolli di differenziazione per iPSC non sono ancora ottimali. In secondo luogo, i neuroni derivati da iPSC non esprimono gli spettri completi delle proteine di superficie e, quindi, se utilizzati, l'assenza di reattività non implica necessariamente la negatività del campione¹⁹.

Esistono tre metodi per lo screening della presenza di autoanticorpi nel siero o nel liquido cerebrospinale di pazienti sospettati di avere AE: test basato sui tessuti (TBA) utilizzando tessuto cerebrale di ratto, saggio basato su cellule (CBA) utilizzando cellule HEK trasfettate per esprimere proteine neuronali e l'applicazione riportata qui utilizzando colture vive di neuroni ippocampali¹⁹. L'importanza del metodo del neurone ippocampale in coltura risiede nella sua capacità di differenziare la reattività con antigeni di superficie e intracellulari che non possono essere facilmente distinti dal TBA. Inoltre, le colture neuronali primarie, a differenza del CBA nelle cellule trasfettate HEK, non sono limitate dal repertorio di proteine trasfettate. Inoltre, i neuroni ippocampali in coltura possono essere utilizzati per identificare nuovi anticorpi e i loro antigeni bersaglio quando combinati con immunoprecipitazione e spettrometria di massa e, quindi, ampliare lo spettro di anticorpi identificabili. Infine, consente la valutazione degli effetti patogeni degli autoanticorpi mediante metodi di imaging live in grado di monitorare le alterazioni dell'attività cellulare. In conclusione, l'identificazione di nuovi autoanticorpi consente infine l'avvio di immunoterapie specifiche per migliorare gli esiti dei pazienti.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Piatto per coltura cellulare da 10 cm	Nunc	12-565-020
Coprioggetti rotondo da 12 mm	Fisher	NC9708845
20x NA 0,75 S Obiettivo ad aria fluorescente	Nikon	CFI Super Fluor 20X
3,5 cm Piatto per coltura cellulare	Nunc	12-565-90
Piatto per coltura cellulare da 6 cm	Supplemento Nunc	12-565-94
B27	Gibco	17504-044
Becher 100 mL	Pirex-Borax
	Sigma-Aldrich	B9876
Acido borico	Sigma-Aldrich	B0252
CaCl2	Sigma-Aldrich	C1016
Pinza curva	FST	11009-13
D-Glucosio	Sigma-Aldrich	D9434
DMEM Alto glucosio (4,5 g/L), senza L-glutammina, senza fenolo Rosso	Capricorno	DMEM-HXRXA
Femmina di ratto Wistar (18 giorni di gravidanza)		fetale Janvier
(FBS)	Biowest	S181B-500
Pinza ad angolo fine	FST	11251-35
Pinza a curva fine	FST	11272-30
Pinza fine-diritta	FST	11251-23
Cubo filtro FITC	Nikon	Serie
Standard Pinze	FST	11000-12
Capra anti-Umano AF488	Invitrogen	A11013
HBSS	Capricorno	HBSS-1A
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Hibernate-E medium	Gibco	A12476-01
Siero di cavallo (HS)	Thermofisher	26050088
Anticorpo umano anti-NMDAR (CSF)	Campione del	paziente-Anticorpo
umano anti-NMDAR (Siero)	Immagine del campione
pazienteJ/Fiji	NIH	v1.50i
Microscopio a fluorescenza invertita	Nikon	Eclipse TE2000-U
KCl	Sigma-Aldrich	44675
L-Glutammina	Biowest	X0550-100
Lampada al mercurio	Nikon	C-HGFI
Camera cellulare per microscopio	Custom-build-NaCl
	Sigma-Aldrich	S9887
NBQX	Tocris	373
Neurobasale senza fenolo rosso	Gibco	12348-017
NMDA	Sigma-Aldrich	M3262
pAAV2-CAG-GCaMP5G	VectorBiolabs-Paraformaldeide
4%	Thermo scientifico	J199943-K2
Penicillina-Streptomicina	Biowest	L0022-100
Soluzione salina	tamponata con fosfatoGibco	10010023
Poli-L-Lisina (PLL)	Peptide internazionale	OKK-35056
Vaschetta per il ghiaccio in polistirene	-		tappo riutilizzato di una scatola di polistirene
Forbici a molla di precisione	FST	15000-08
ProLong Gold con DAPI (mezzi di montaggio antisbiadimento)	Sonde molecolari	P36941
Forbici	FST	14068-12
Piruvato di sodio	Biowest	L0642-100
Stereomicroscopio	Zeiss	Stemi 2000
Forbici chirurgiche	FST	14081-09
Tripsina 2,5%	Gibco	15090046
Acqua, sterile senza endotossine	Sigma-Aldrich	W3500