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Articolo metodologico

Isolamento di lisati proteici a cellule intere da processi facciali di topo e cellule mesenchimali palatali coltivate per l'analisi delle fosfoproteine

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DOI:

10.3791/63834

⸱

1 aprile 2022

 ,  , 
1Department of Craniofacial Biology, School of Dental Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Il protocollo presenta un metodo per isolare lisati proteici di cellule intere da processi facciali embrionali di topo sezionati o cellule mesenchimali palatali embrionali di topo in coltura ed eseguire il successivo western blotting per valutare i livelli di proteine fosforilate.

Abstract

Lo sviluppo craniofacciale dei mammiferi è un processo morfologico complesso durante il quale più popolazioni cellulari si coordinano per generare lo scheletro frontonasale. Questi cambiamenti morfologici sono iniziati e sostenuti attraverso diverse interazioni di segnalazione, che spesso includono la fosforilazione proteica da parte delle chinasi. Qui vengono forniti due esempi di contesti fisiologicamente rilevanti in cui studiare la fosforilazione delle proteine durante lo sviluppo craniofacciale dei mammiferi: i processi facciali del topo, in particolare i processi mascellari E11.5, e le cellule mesenchimali palatali embrionali embrionali di topo in coltura derivate da scaffali palatali secondari E13.5. Per superare la barriera comune della defosforilazione durante l'isolamento proteico, vengono discussi gli adattamenti e le modifiche ai metodi di laboratorio standard che consentono l'isolamento delle fosfoproteine. Inoltre, vengono fornite le migliori pratiche per un'analisi e una quantificazione adeguate delle fosfoproteine a seguito del western blotting dei lisati proteici di cellule intere. Queste tecniche, in particolare in combinazione con inibitori farmacologici e/o modelli genetici murini, possono essere utilizzate per ottenere una maggiore comprensione delle dinamiche e dei ruoli di varie fosfoproteine attive durante lo sviluppo craniofacciale.

Introduzione

Lo sviluppo craniofacciale dei mammiferi è un processo morfologico complesso durante il quale più popolazioni cellulari si coordinano per generare lo scheletro frontonasale. Nel topo, questo processo inizia al giorno embrionale (E) 9.5 con la formazione della prominenza frontonasale e coppie di processi mascellari e mandibolari, ognuno dei quali contiene cellule della cresta neurale cranica post-migratoria. I processi nasali laterali e mediali derivano dalla prominenza frontonasale con la comparsa delle fosse nasali e alla fine si fondono per formare le narici. Inoltre, i processi nasali mediali e i processi mascellari si fondono per generare il labbro superiore. Allo stesso tempo, la palatogenesi viene avviata con la formazione di escrescenze distinte - gli scaffali palatali secondari - dal lato orale dei processi mascellari a E11.5. Nel corso del tempo, i ripiani palatali crescono verso il basso su entrambi i lati della lingua, si elevano in una posizione opposta sopra la lingua e alla fine si fondono sulla linea mediana per formare un palato continuo che separa le cavità nasali e orali da E16.51.

Questi cambiamenti morfologici durante lo sviluppo craniofacciale sono iniziati e sostenuti attraverso diverse interazioni di segnalazione, che spesso includono la fosforilazione proteica da parte delle chinasi. Ad esempio, i recettori della membrana cellulare, come le sottofamiglie di recettori del fattore di crescita trasformante (TGF)-β, compresi i recettori delle proteine morfogenetiche ossee (BMMR) e varie famiglie di tirosin-chinasi (RTK), sono autofosforilati dopo il legame del ligando e l'attivazione nelle cellule della cresta neurale cranica 2,3,4 . Inoltre, il recettore transmembrana accoppiato alla proteina G Smoothened diventa fosforilato nelle cellule della cresta neurale cranica e nell'ectoderma craniofacciale a valle del ligando Sonic hedgehog (SHH) che si lega al recettore Patched1, con conseguente accumulo smoothened alla membrana ciliare e attivazione della via SHH5. Tali interazioni ligando-recettore possono avvenire attraverso la segnalazione autocrina, paracrina e/o juxtacrine in contesti craniofacciali. Ad esempio, BMP6 è noto per segnalare in modo autocrino durante la differenziazione dei condrociti6, mentre il fattore di crescita dei fibroblasti (FGF) 8 è espresso nell'ectoderma dell'arco faringeo e si lega ai membri della famiglia FGF di RTK espressi nel mesenchima dell'arco faringeo in modo paracrino per avviare il patterning e la crescita degli archi faringei7, 8,9,10. Inoltre, la segnalazione di Notch viene attivata sia nei condrociti che negli osteoblasti durante lo sviluppo scheletrico craniofacciale attraverso la segnalazione juxtacrine quando i ligandi Delta transmembrana e/o Jagged si legano ai recettori Notch transmembrana sulle cellule vicine, che vengono successivamente scissi e fosforilati11. Tuttavia, ci sono altre coppie di ligando e recettori importanti per lo sviluppo craniofacciale che hanno la flessibilità di funzionare sia nella segnalazione autocrina che paracrina. Ad esempio, durante la morfogenesi dei denti murini, è stato dimostrato che il ligando del fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF)-AA segnala in modo autocrino l'attivazione del PDGFRα RTK nell'epitelio12 dell'organo dello smalto. Al contrario, nei processi facciali murini durante la gestazione media, i trascritti che codificano i ligandi PDGF-AA e PDGF-CC sono espressi nell'ectoderma craniofacciale, mentre il recettore PDGFRα è espresso nel mesenchima derivato dalla cresta neurale cranica sottostante, con conseguente segnalazione paracrina 13,14,15,16,17 . Indipendentemente dal meccanismo di segnalazione, questi eventi di fosforilazione del recettore spesso provocano il reclutamento di proteine adattatrici e/o molecole di segnalazione, che spesso si fosforilano per avviare cascate di chinasi intracellulari come la via della chinasi proteica attivata dai mitogeni (MAPK)18,19.

Gli effettori intracellulari terminali di queste cascate possono quindi fosforilare una serie di substrati, come fattori di trascrizione, legame con l'RNA, proteine della matrice citoscheletrica ed extracellulare. Runx220, Hand121, Dlx3/5 22,23,24, Gli1-3 25 e Sox926 sono tra i fattori di trascrizione fosforilati nel contesto dello sviluppo craniofacciale. Questa modifica post-traduzionale (PTM) può influenzare direttamente la suscettibilità a PTM alternativi, dimerizzazione, stabilità, scissione e / o affinità di legame con il DNA, tra le altre attività 20,21,25,26. Inoltre, la proteina legante l'RNA Srsf3 è fosforilata nel contesto dello sviluppo craniofacciale, portando alla sua traslocazione nucleare27. In generale, è stato dimostrato che la fosforilazione delle proteine leganti l'RNA influisce sulla loro localizzazione subcellulare, sulle interazioni proteina-proteina, sul legame con l'RNA e/o sulla specificità della sequenza28. Inoltre, la fosforilazione dell'actomiosina può portare a riarrangiamenti citoscheletrici durante lo sviluppo craniofacciale29,30 e la fosforilazione delle proteine della matrice extracellulare, come le glicoproteine legate al ligando N legate all'integrina, contribuisce alla biomineralizzazione durante lo sviluppo scheletrico31. Attraverso quanto sopra e numerosi altri esempi, è evidente che ci sono ampie implicazioni per la fosforilazione delle proteine durante lo sviluppo craniofacciale. Aggiungendo un ulteriore livello di regolazione, la fosforilazione delle proteine è ulteriormente modulata dalle fosfatasi, che contrastano le chinasi rimuovendo i gruppi fosfato.

Questi eventi di fosforilazione sia a livello di recettore che di molecola effettrice sono fondamentali per la propagazione delle vie di segnalazione e alla fine provocano cambiamenti nell'espressione genica nel nucleo, guidando attività cellulari specifiche, come la migrazione, la proliferazione, la sopravvivenza e la differenziazione, che si traducono in una corretta formazione del volto dei mammiferi. Data la specificità del contesto delle interazioni proteiche con chinasi e fosfatasi, i conseguenti cambiamenti nelle PTM e i loro effetti sull'attività cellulare, è fondamentale che questi parametri siano studiati in un contesto fisiologicamente rilevante per ottenere una comprensione completa del contributo degli eventi di fosforilazione allo sviluppo craniofacciale. Qui vengono forniti esempi di due contesti in cui studiare la fosforilazione delle proteine e, quindi, l'attivazione delle vie di segnalazione durante lo sviluppo craniofacciale dei mammiferi: i processi facciali dei topi, in particolare i processi mascellari E11.5, e le cellule mesenchimiche palatali embrionali di topo in coltura derivate da scaffali palatali secondari E13.5 - entrambi primari32 e immortalati33 . A E11.5, i processi mascellari sono in fase di fusione con i processi nasali laterali e mediali1, rappresentando così un punto temporale critico durante lo sviluppo craniofacciale del topo. Inoltre, i processi mascellari e le cellule derivate dagli scaffali palatali sono stati scelti qui perché queste ultime strutture sono derivati delle prime, fornendo così ai ricercatori l'opportunità di interrogare la fosforilazione proteica in vivo e in vitro in contesti correlati. Tuttavia, questo protocollo è applicabile anche a processi facciali alternativi e punti temporali di sviluppo.

Un problema critico nello studio delle proteine fosforilate è che sono facilmente defosforilate durante l'isolamento proteico da abbondanti fosfatasi ambientali. Per superare questa barriera, vengono discussi gli adattamenti e le modifiche ai metodi di laboratorio standard che consentono l'isolamento delle proteine fosforilate. Inoltre, vengono fornite le migliori pratiche per un'analisi e una quantificazione adeguate delle proteine fosforilate. Queste tecniche, in particolare in combinazione con inibitori farmacologici e/o modelli genetici murini, possono essere utilizzate per ottenere una maggiore comprensione delle dinamiche e dei ruoli delle varie vie di segnalazione attive durante lo sviluppo craniofacciale.

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Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università del Colorado Anschutz Medical Campus ed eseguite in conformità con le linee guida e i regolamenti istituzionali. Per la raccolta di embrioni sono stati utilizzati topi femmina 129S4 a 1,5-6 mesi di età e alloggiati a una temperatura sub-termoneutrica di 21-23 °C. Un flusso di lavoro schematico del protocollo è rappresentato nella Figura 1. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, le attrezzature, il software, i reagenti e gli animali utilizzati in questo protocollo.

1. Raccolta di embrioni di topo E11.5

  1. Eutanasia di topo femmina incinta 11,5 giorni dopo il rilevamento del tappo vaginale durante l'accoppiamento temporizzato inuna camera di CO2 utilizzando la portata di CO 2 approvata da IACUC necessaria per circa il 50% di spostamento (2,95 L / min in una camera 360 in3 ) e la durata dell'esposizione (vedere Tabella dei materiali). Eseguire la lussazione cervicale come metodo secondario di eutanasia. Procedere immediatamente alla dissezione.
  2. Appoggia il corpo del mouse su una tavola di dissezione con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Spruzzare l'addome del topo con il 70% di etanolo.
  3. Aprire la cavità addominale pizzicando e sollevando la pelle anteriore all'apertura vaginale con pinze Semken dritte e tagliando la pelle sollevata e gli strati sottostanti con forbici chirurgiche a lama dritta con un angolo di 45 ° su entrambi i lati per generare una forma a "V" che si estende a ciascuna superficie laterale all'incirca a metà strada tra gli arti anteriori e posteriori.
  4. Usando la pinza di Semken, afferrare una delle corna uterine e tagliare sotto l'ovidotto e sopra la cervice con le forbici chirurgiche. Tagliare via il mesometrio per consentire la completa rimozione del corno uterino.
  5. Trasferire il corno uterino sezionato a 10 mL di soluzione salina tamponata con fosfato istologico (PBS) [0,137 M NaCl, 2,68 mM KCl, 1,76 mM KH2PO4 monobasico, 10,14 mM Na2HPO4 dibasico, pH 7,4] in una capsula di Petri di 10 cm.
  6. Rimuovere il secondo corno uterino sul lato opposto della cavità addominale utilizzando la stessa procedura descritta nei passaggi 1.4-1.5.
  7. Posizionare la capsula di Petri di 10 cm contenente entrambe le corna uterine sul ghiaccio se non si procede immediatamente alla dissezione dei singoli embrioni (cioè se verrà sezionato un secondo topo femmina).
  8. Sotto uno stereomicroscopio sezionante, seziona attentamente ogni embrione dalle corna uterine con una pinza fine Dumont #5. Allontana lentamente il miometrio, la decidua e il corion. Strappare e rimuovere l'amnione relativamente trasparente che circonda l'embrione e recidere il cordone ombelicale che collega l'embrione alla placenta.
  9. Trasferire ogni embrione sezionato a 2,5 ml di PBS istologico in un pozzetto individuale di una piastra di coltura cellulare a 12 pozzetti su ghiaccio utilizzando un pipetto di trasferimento di plastica tagliato o un cucchiaio di embrione.
    NOTA: Se si lavora con una cucciolata che può contenere embrioni di più di un genotipo, salvare l'amnione che circonda ciascun embrione per la genotipizzazione mettendo ciascuno nel proprio tubo microcentrifuga da 0,5 mL preetichettato sul ghiaccio.

2. Dissezione dei processi mascellari da embrioni di topo E11.5

  1. Preparare tre piastre di Petri da 10 cm contenenti 10 ml di PBS istologico e tenerle sul ghiaccio per essere utilizzate nella rotazione tra gli embrioni.
  2. Trasferire un embrione da un pozzetto individuale della piastra di coltura cellulare a 12 pozzetti a una delle piastre di Petri da 10 cm con PBS istologico su ghiaccio utilizzando un pipetto di trasferimento di plastica tagliato o un cucchiaio di embrione.
  3. Sotto il microscopio di dissezione, separare ogni processo mascellare dal viso usando la pinza fine. In primo luogo, tagliare il lato anteriore di un processo mascellare lungo la rientranza naturale che separa il processo nasale laterale e il processo mascellare (Figura 2A).
  4. In secondo luogo, tagliare il lato posteriore del processo mascellare lungo la rientranza naturale che separa il processo mascellare e il processo mandibolare (Figura 2A).
  5. In terzo luogo, per separare completamente il processo mascellare, effettuare un taglio verticale dai lati anteriore a quello posteriore del processo mascellare sul lato oculare del processo mascellare dove terminano le rientranze naturali di cui sopra (Figura 2A-C).
  6. Ripeti questi tre tagli per il processo mascellare sul lato opposto del viso.
  7. Utilizzando un pipetto Pasteur da 9" con un piccolo bulbo di lattice da 2 mL, trasferire la coppia sezionata di processi mascellari e una piccola goccia di circa 30 μL di PBS istologico su una capsula di Petri da 35 mm etichettata su ghiaccio (Figura 2D).
  8. Seguire i passaggi 2.3-2.7 per ogni embrione, ruotando le tre piastre di Petri da 10 cm contenenti PBS istologico su ghiaccio tra gli embrioni. Posizionare singole coppie di processi mascellari sezionati in piastre di Petri separate da 35 mm sul ghiaccio.
    NOTA: La separazione del processo mascellare ectoderma e mesenchima (fasi 2.9-2.17) può essere eseguita dopo aver sezionato i processi mascellari di tutti gli embrioni nella lettiera. Se si desiderano processi mascellari intatti contenenti sia l'ectoderma che il mesenchima, procedere al passaggio 2.18 di seguito.
  9. Preparare 250 μL di tripsina fresca al 2% in PBS di coltura tissutale e 250 μL di siero bovino fetale al 10% (FBS) in PBS di coltura tissutale e conservare su ghiaccio.
  10. Posizionare una seconda, piccola goccia di circa 30 μL di tripsina al 2% nella capsula di Petri da 35 mm separata dalla prima, piccola goccia di istologia PBS contenente i processi mascellari. Trasferire la coppia di processi mascellari alla piccola goccia di tripsina al 2% utilizzando il pipetto Pasteur (Figura 2D).
  11. Incubare il piatto su ghiaccio per 15 min.
  12. Rimuovere la capsula di Petri da 35 mm dal ghiaccio e posizionarla sotto il microscopio di dissezione.
  13. Usando la pinza fine, estrarre lentamente e con attenzione lo strato di ectoderma da ogni processo mascellare (Figura 2E).
    NOTA: Se l'ectoderma non si separa dal mesenchima in un foglio intatto, incubare in tripsina al 2% a temperatura ambiente (RT) per un massimo di 5 minuti aggiuntivi prima di continuare con la separazione. Se il tessuto inizia a disintegrarsi nella tripsina al 2%, spostare i processi mascellari al 10% FBS come descritto di seguito per neutralizzare la tripsina e terminare la separazione dell'ectoderma e del mesenchima.
  14. Una volta separati il processo mascellare ectoderma e mesenchima (Figura 2F), trasferire i tessuti desiderati dalla coppia di processi mascellari a una terza goccia piccola di circa 30 μL di FBS al 10% - separata dalle due piccole goccioline precedenti - utilizzando il pipetto Pasteur (Figura 2D).
  15. Posizionare la capsula di Petri da 35 mm sul ghiaccio per fermare la tripsinizzazione.
  16. Incubare i tessuti del processo mascellare sul ghiaccio in FBS al 10% per 1-2 minuti, quindi trasferire i tessuti da entrambi i processi mascellari a una quarta, piccola goccia di circa 30 μL di PBS istologico prechilled su ghiaccio - separata dalle tre precedenti piccole goccioline - usando il pipetto Pasteur (Figura 2D).
  17. Incubare i tessuti del processo mascellare in istologia PBS per 1 minuto mentre ruota delicatamente il PBS istologico attorno ai tessuti del processo mascellare con la punta del pipetto Pasteur per garantire che tutto FBS venga risciacquato dal tessuto.
  18. Trasferire la coppia di tessuti di processo mascellare in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL etichettato su ghiaccio utilizzando il pipetto Pasteur, riducendo al minimo il trasferimento di PBS istologico. Rimuovere l'eventuale istologia in eccesso PBS nel tubo microcentrifuga da 1,5 mL con il pipetto Pasteur.
  19. Seguire i passaggi precedenti per sezionare i processi mascellari da ciascun embrione nella lettiera.
  20. Elaborare immediatamente i campioni per isolare lisati di proteine a cellule intere (sotto) o conservarli a -80 °C a lungo termine. Prima della conservazione a lungo termine, congelare a scatto il tubo microcentrifuga da 1,5 ml in un bagno di EtOH al 100% su ghiaccio secco per 5 minuti.

3. Isolare i lisati proteici delle cellule intere dai processi mascellari del topo

  1. Se i processi mascellari sono stati precedentemente congelati a -80 °C, scongelarli sul ghiaccio.
  2. Aggiungere 0,1 mL di tampone di lisi NP-40 ghiacciato (20 mM Tris HCl pH 8, 150 mM NaCl, 10% glicerolo, 1% Nonidet P-40, 2 mM EDTA; conservato a 4 °C) con inibitori della proteasi e della fosfatasi (1x cocktail completo di mini inibitori della proteasi [disciolto in acqua; conservato a -20 °C], 1 mM PMSF [disciolto in isopropanolo; conservato a 4 °C], 10 mM NaF [conservato a -20 °C; evitare il congelamento/scongelamento], 1 mM Na3VO4 [conservato a -20 °C], 25 mM β-glicerofosfato [conservato a 4 °C]) aggiunto immediatamente prima dell'uso su ghiaccio.
    NOTA: Il frazionamento cellulare può essere eseguito in alternativa per isolare frazioni proteiche citoplasmatiche, nucleari, di membrana o mitocondriali.
  3. Pipettare su e giù 10 volte con un pipetman da 200 μL.
  4. Vortice per 10 s, e poi pipettare su e giù 10 volte con un pipetman da 200 μL. Evitare di generare bolle.
  5. Incubare a 4 °C per 2 ore ruotando da un'estremità all'altra utilizzando una paletta da 1,5 ml/2 mL con un revolver a tubo.
  6. Centrifugare i campioni a 13.500 × g per 20 minuti a 4 °C.
  7. Raccogliere il surnatante in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 ml sul ghiaccio con un pipetman da 200 mL.
  8. Quantificare la concentrazione proteica con il kit di analisi proteica, utilizzando 10 μL di lisato proteico + 10 μL di tampone di lisi NP-40 per campioni sperimentali e 3-5 diluizioni di albumina sierica bovina (frazione V) (BSA) in tampone di lisi NP-40 in un intervallo di 0,25-2,0 mg / mL come standard proteici.
  9. Procedere con l'elettroforesi su gel di sodio dodecilsolfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) (fase 5) o congelare rapidamente i lisati rimanenti su ghiaccio secco e conservare a -80 °C a lungo termine.

4. Isolare i lisati proteici a cellule intere dalle cellule mesenchima palatali embrionali di topo primarie e/o immortalizzate (MEPM)

NOTA: L'isolamento e la coltura di cellule MEPM primarie da embrioni di topo E13.5 e cellule MEPM immortalizzate sono stati precedentemente descritti 32,33,34. La stimolazione delle cellule con fattore di crescita (fasi 4.1-4.7) può essere eseguita prima della lisi cellulare. Se si desiderano cellule non stimolate, procedere al passaggio 4.8 di seguito.

  1. Aspirare il mezzo di crescita [Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) con 50 U/mL di penicillina, 50 μg/mL di streptomicina, 2 mM L-glutammina, 10% FBS] dalle cellule MEPM a ~ 70% di confluenza in una capsula di coltura cellulare di 6 cm utilizzando un pipetto Pasteur da 5,75" attaccato a un sistema di vuoto.
  2. Lavare le cellule con 1 mL di coltura tissutale PBS.
  3. Aggiungere 3 mL di siero di terreno di fame [DMEM con 50 U/mL di penicillina, 50 μg/mL di streptomicina, 2 mM di L-glutammina, 0,1% FBS] preriscaldati a bagnomaria a 37 °C.
  4. Incubare a 37 °C e 5% CO2 per 23 ore.
  5. Sostituire il mezzo di fame sierico con 3 ml di siero da fame fresco e preriscaldato.
  6. Incubare a 37 °C e 5% CO2 per 1 ora.
  7. Stimolare le cellule con il fattore di crescita di scelta ad una concentrazione determinata empiricamente per il periodo di tempo desiderato.
  8. Aspirare il mezzo dalle celle MEPM all'80%-100% di confluenza utilizzando un pipetto Pasteur da 5,75" collegato a un sistema di vuoto.
  9. Lavare le cellule due volte con coltura tissutale ghiacciata PBS (1 mL per una palazzetta di coltura cellulare di 6 cm); inclinare la piastra di lato durante l'ultimo lavaggio per garantire che tutta la coltura tissutale PBS sia aspirata.
  10. Lisare le cellule aggiungendo un tampone di lisi NP-40 ghiacciato con inibitori della proteasi e della fosfatasi aggiunti immediatamente prima dell'uso (0,1 ml per una capsula di coltura cellulare di 6 cm) sul ghiaccio.
  11. Incubare la piastra su ghiaccio per 5 minuti con rotazione circa ogni minuto per garantire una copertura completa della piastra.
  12. Raschiare le cellule dalla piastra usando un sollevatore di celle preraffreddato e trasferire la sospensione cellulare in un tubo microcentrifuga da 1,5 ml preraffreddato su ghiaccio.
  13. Incubare la sospensione cellulare a 4 °C per 30 minuti ruotando da un'estremità all'altra utilizzando una paletta da 1,5 ml/2 mL con un revolver a tubo.
  14. Procedere con i passaggi 3.6-3.9 descritti sopra.

5. Western blotting di lisati proteici a cellule intere da processi facciali di topo e/o cellule MEPM per fosfoproteine

  1. Preparare campioni di lisato proteico cellulare intero per SDS-PAGE.
    1. Determinare la quantità di proteine da caricare, a seconda dell'abbondanza di proteine nel tessuto / cellula; 12,5 μg sono di solito sufficienti per proteine espresse in modo robusto nei lisati proteici a cellule intere.
    2. Aggiungere un volume uguale di 2 tamponi Laemmli [20% glicerolo, 4% SDS, 0,004% blu bromofenolo, 0,125 M Tris HCl pH 6,8] con il 10% di β-mercaptoetanolo aggiunto immediatamente prima dell'uso.
      ATTENZIONE: β-mercaptoetanolo è corrosivo per la pelle o per gli occhi, tossico, pericoloso se ingerito e ha tossicità acquatica. Maneggiare indossando guanti, un cappotto da laboratorio, una visiera e occhiali di sicurezza in un cappuccio di fumi chimici. Smaltire secondo le linee guida per la salute e la sicurezza ambientale.
    3. Mescolare vorticando.
    4. Riscaldare i campioni a 100 °C per 5 minuti in un mini bagno secco.
    5. Mescolare vorticosamente e posizionare i campioni sul ghiaccio.
    6. Centrifugare a 9.400 × g per 5 min a 4 °C.
    7. Posizionare brevemente i campioni sul ghiaccio prima di caricarli nel gel SDS-PAGE o conservare a -20 °C a lungo termine.
  2. Eseguire SDS-PAGE utilizzando una cella di elettroforesi con un gel proteico prefabbricato al 4%-15% e tampone di elettroforesi35.
  3. Elettrotrasferire le proteine in una membrana di polivinilidene fluoruro (PVDF) utilizzando un tampone di trasferimento con metanolo 0%-20% (0%-10% per proteine superiori a 100 kDa; 20% per proteine inferiori a 100 kDa) aggiunto immediatamente prima dell'uso35.
  4. Bloccare la membrana e la sonda per la fosfoproteina di interesse.
    1. Dopo il trasferimento, lavare la membrana in 1x soluzione salina tris-buffered (TBS) [20 mM Tris, 0,137 M NaCl, pH 7,6] per 5 minuti in una scatola western blot.
    2. Incubare la membrana in 5 mL di tampone bloccante [1x TBS, 0,1% Tween 20, 5% p/v BSA; miscelata bene e filtrata attraverso un filtro a siringa da 25 mm con pori da 0,2 μm utilizzando una siringa da 10 mL con punta luer] per 1 ora in una scatola western blot con agitazione su uno shaker orbitale.
      NOTA: Non usare il latte come agente bloccante quando si caratterizzano le fosfoproteine in quanto contiene la fosfoproteina caseina, che può causare un segnale di fondo elevato e non specifico.
    3. Lavare la membrana tre volte per 5 minuti ciascuna in TBS-T [1x TBS, 0,1% Tween 20] in una scatola western blot con agitazione su uno shaker orbitale.
    4. Incubare la membrana in 5 mL di anticorpo primario diluito in tampone bloccante a 4 °C durante la notte in un tubo conico da 50 mL utilizzando una paletta da 50 mL con un revolver a tubo.
      NOTA: Consultare la scheda tecnica degli anticorpi per la concentrazione appropriata per il western blotting.
    5. Lavare la membrana tre volte a RT per 5 minuti ciascuna in TBS-T in una scatola western blot con agitazione su uno shaker orbitale.
    6. Incubare la membrana in 5 mL di appropriato anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano (HRP) diluito in tampone bloccante per 1 ora in una scatola western blot con agitazione su uno shaker orbitale.
    7. Lavare la membrana tre volte per 5 minuti ciascuna in TBS-T in una scatola western blot con agitazione su uno shaker orbitale.
    8. Incubare la membrana in substrato western blotting a chemiluminescenza avanzata (ECL) [mescolando volumi uguali dalle bottiglie 1 e 2; 0,5 ml di ciascuno per membrane di grandi dimensioni (8,6 cm x 6,7 cm)] per 1 minuto, assicurando che l'intera membrana sia continuamente esposta al substrato di blotting occidentale ECL.
    9. Drenare la membrana del substrato di blotting occidentale ECL in eccesso e sviluppare immediatamente utilizzando un imager a chemiluminescenza.
  5. Spogliare la membrana e riprovare per la proteina totale di interesse.
    1. Posizionare la membrana pvDF in un sacchetto trasparente con rivestimento in polietilene contenente 5 mL di tampone di stripping [2% SDS, 62,5 mM Tris HCl pH 6,8] con 8 μL/mL di β-mercaptoetanolo aggiunto immediatamente prima dell'uso.
    2. Incubare a 50 °C per 30 min con dondolo in forno di ibridazione a 11 giri al minuto.
    3. Lavare la membrana tre volte a RT per 5 minuti ciascuna in TBS-T in una scatola western blot con agitazione su uno shaker orbitale.
    4. Procedere con i passaggi 5.4.2-5.4.9 descritti sopra.
  6. Quantitare le densità della banda western blot utilizzando il software ImageJ, normalizzando i livelli della proteina fosforilata di interesse ai livelli della proteina totale di interesse36.

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Risultati

Quando si tenta di caratterizzare la fosforilazione di proteine isolate da processi facciali di topo e/o cellule mesenchimali palatali in coltura, i risultati rappresentativi riveleranno idealmente una banda distinta e riproducibile dopo il western blotting con un anticorpo antifosfoproteico che corre all'altezza o vicino all'altezza della corrispondente banda proteica totale (Figura 3 ). Tuttavia, se si verifica un'estesa fosforilazione della proteina, potrebbe esserci un leggero spostament...

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Discussione

Il protocollo qui descritto consente ai ricercatori di sondare eventi critici di segnalazione dipendenti dalla fosforilazione durante lo sviluppo craniofacciale in modo robusto e riproducibile. Ci sono diversi passaggi critici in questo protocollo che garantiscono una corretta raccolta di dati e l'analisi dei risultati. Che si tratti di isolare le fosfoproteine dai processi facciali dei topi e / o dalle cellule mesenchimali palatali in coltura, è imperativo muoversi in modo rapido ed efficiente mantenendo tutti i reagent...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

129S4 topi sono stati un dono del Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine del Monte Sinai. Questo lavoro è stato sostenuto con fondi dal National Institutes of Health (NIH) / National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) R01 DE027689 e K02 DE028572 a K.A.F., F31 DE029976 a M.A.R. e F31 DE029364 a B.J.C.D.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Equipment
Block per mini bagno a seccoResearch Products International Corp400783
Sistema di imaging ChemiDoc XRS+ con software Image LabBio-Rad1708265imager a chemiluminescenza
CO2 incubatore, camicia d'ariaVWR10810-902
scheda, 11 x 13 inFisher Scientific09 002 12
Cella di elettroforesi, 4 gel, per mini gel prefabbricati con modulo mini trans-blotBio-Rad1658030
Forno di ibridazioneScientificUVP95003001
Microcentrifuga 5415 D con rotore F45-24-11 (Eppendorf)Sigma AldrichZ604062
Mini bagno secco International Corp400780
Agitatore orbitaleVWR89032-092
Misuratore di pHVWR89231-662
Alimentatore per SDS-PAGEBio-Rad1645050
Vaschetta di ghiaccio rettangolare, maxi 9 LFisher Scientific07-210-093
Stereomicroscopio Stemi 508 con supporto K LAB, luce anulare a LEDZeissMicroscopioda dissezione
TimerVWR62344-641
Revolver a tuboFisher Scientific11 676 341
Miscelatore a vorticeFisher Scientific02 215 414
Bagno d'acquaVWR89501-472
Western blot boxFisher ScientificNC9358182
Materiali
Piastre per colture cellulari, 6 cmFisher Scientific12-565-95
Piastre per colture cellulari, 12 pozzettiFisher Scientific07-200-82
Sollevatori cellulariFisher Scientific08-100-240
CO2AirgasCD USP50
Provette coniche, polipropilene, 50 mLFisher Scientific05-539-13
Dumont #5 pinze finiFine Science Tools11254-20
Cucchiaio per embrioniFine Science Tools10370-17
Provette per microcentrifuga, 0,5 mLVWR89000-010
Provette per microcentrifuga, 1,5 mLVWR20170-038
Pipetta Pasteur, 5,75"Fisher Scientific13-678-6A
Pipetta Pasteur, 9"VWR14672-380
piastre di Petri, 10 cmFisher Scientific08-757-100D
Piastre di Petri, 35 mmFisher ScientificFB0875711YZ
Buste, trasparente, fodera in polietileneFisher Scientific01-812-25B
Membrana PVDFFisher ScientificIPVH00010
Pinza SemkenFine Science Tools11008-13
Piccolo bulbo in lattice, 2 mLVWR82024-554
Forbici chirurgicheFine Science Tools14002-12
Filtro per siringa, 25 mm, 0,2 μ m pori FisherScientific09-740-108
Siringa con punta luer, 10 mLVWRBD309604
Pipetta di trasferimentoFisher Scientific13-711-22
Leva di apertura della cassetta Western blotBio-Rad4560000
Whatmann 3MM carta per cromatografia ChrFisher Scientific05-714-5
Reagenti
4-15% Gel proteici prefabbricati, 10 pozzetti, 30 µ LBio-Rad4561083
β-glicerofosfato sale disodico idratoSigma AldrichG5422-25Gconcentrazione madre 1 M
β-mercaptoetanoloSigma AldrichM3148-100ML
Albumina sierica bovina, frazione V, testata per shock termicoFisher ScientificBP1600-100
Blu di bromofenoloFisher Scientific
Cocktail completo di mini inibitori della proteasiSigma Aldrich11836153001concentrazione stock 25x
Kit di dosaggio delle proteine DC IIBio-Rad500-0112
DMEM, Gibco ad alto contenuto di glucosio11965092
E7, anticorpo primario beta tubulina monoclonale di topo, concentrato 0,1 mLStudi sullo sviluppo Banca degli ibridomiE71:1.000
Substrato di blotting occidentale ECLFisher ScientificPI32106substrato di
blotting occidentale ECLGenesee Scientific20-302Bgamma di femtogrammi bassi
Tampone per elettroforesi, 5 LBio-Rad1610772concentrazione di stock 10x
etanolo, 200 proof, 1 galloneDecon Laboratories, Inc.2705HCEtOH
Acido etilendiamminotetraacetico, diidrico salino Di Na. (potenza cristallina/elettrofora.)Fisher ScientificBP120-500EDTA
Siero fetale bovino, caratterizzato, origine USA, 500 ml diHyCloneSH30071.03
Glicerolo (certificato ACS)Fisher ScientificG33-4
Anticorpo secondario coniugato HRP, capra anti-topo IgGJackson ImmunoResearch Laboratories115-035-1461:20.000
HRP-66 anticorpo secondario coniugato HRP, capra anti-coniglio IgGJackson ImmunoResearch Laboratories111-035-0031:20.000
Soluzione di acido cloridrico, 6N (certificato)Fisher ScientificSA56-500HCl
Igepal Ca - 630 detergente non ionicoFisher ScientificICN19859650Nonidet P-40
Isopropanolo (HPLC)Fisher ScientificA451-1
L-glutamminaGibco25030081concentrazione stock 200 mM
MetanoloFisher ScientificA454-4
p44/42 MAPK (Erk1/2) anticorpo primarioCell Signaling Technology9102S1:1.000; ligando ricombinante anti-Erk1/2
PDGF-BB, rattoFisher Scientific520BB050
PDGF Receptor & beta; anticorpo primarioCell Signaling Technology3169Ss1:1.000
Penicillina-StreptomicinaGibco15140122concentrazione madre 100 U/mL, 100 &; g/mL
Fenilmetansulfonilfluoruro, 99%ScientificAC215740100PMSF; concentrazione madre 100 mM
Fosfo-p44/42 MAPK (Erk1/2) anticorpo primarioCell Signaling Technology9101S1:1.000, recettore anti-fosfo-Erk1/2
Phospho-PDGF & alfa; /PDGF recettore & beta; anticorpo primarioCell Signaling Technology3170S1:1.000
Cloruro di potassio (cristalli bianchi)Fisher ScientificBP366-500KCl
Fosfato di potassio monobasico (cristalli bianchi)Fisher ScientificBP362-500KH2PO4
SDS, 10%Bio-Rad161-0416
Cloruro di sodio (cristallino/biologico, certificato)Fisher ScientificS671-3NaCl
Fluoruro di sodio (polvere/certificato ACS)Fisher ScientificS299-100NaF; aliquota per un solo utilizzo; concentrazione madre 1 M
Ortovanadato di sodio, 99%Fisher ScientificAC205330500Na3VO4; concentrazione stock 100 mM
Fosfato di sodio bibasico anidro (granulare o in polvere/certificato ACS)Fisher ScientificS374-500Na2HPO4
Coltura tissutale PBSFisher Scientific21-031-CV
Tampone di trasferimento, 5 LBio-Rad1610771concentrazione stock 10x
base Tris (cristalli bianchi o polvere cristallina/biologia molecolare)Fisher ScientificBP152-1
TripsinaBioWorld21560033
Tween 20Fisher ScientificBP337-500
Marcatore di peso molecolare Western blotBio-Rad1610374
Software
ImageJ softwareNational Institutes of Health
Animals
Female 129S4 topidono del Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine al Mount Sinai
Fisher 4350649020000000AC403140050 a bassa gamma di picogrammi Fisher di

Riferimenti

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