Il protocollo qui descritto fornisce istruzioni dettagliate su come analizzare le regioni genomiche di interesse per il potenziale di codifica delle microproteine utilizzando PhyloCSF sul browser del genoma UCSC di facile utilizzo. Inoltre, si raccomandano diversi strumenti e risorse per studiare ulteriormente le caratteristiche di sequenza delle microproteine identificate per ottenere informazioni sulle loro presunte funzioni.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Un approccio integrato per l'identificazione delle microproteine e l'analisi delle sequenze
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il sequenziamento di nuova generazione (NGS) ha spinto in avanti il campo della genomica e ha prodotto sequenze di genoma intero per numerose specie animali e organismi modello. Tuttavia, nonostante questa ricchezza di informazioni sulla sequenza, gli sforzi completi di annotazione genica si sono dimostrati impegnativi, specialmente per le piccole proteine. In particolare, i metodi convenzionali di annotazione delle proteine sono stati progettati per escludere intenzionalmente le proteine putative codificate da brevi frame di lettura aperti (SORF) di lunghezza inferiore a 300 nucleotidi per filtrare il numero esponenzialmente più elevato di SORF non codificanti spuri in tutto il genoma. Di conseguenza, centinaia di piccole proteine funzionali chiamate microproteine (<100 amminoacidi di lunghezza) sono state erroneamente classificate come RNA non codificanti o completamente trascurate.
Qui forniamo un protocollo dettagliato per sfruttare strumenti bioinformatici gratuiti e pubblicamente disponibili per interrogare le regioni genomiche per il potenziale di codifica delle microproteine basato sulla conservazione evolutiva. In particolare, forniamo istruzioni dettagliate su come esaminare la conservazione della sequenza e il potenziale di codifica utilizzando le frequenze di sostituzione filogenetica dei codone (PhyloCSF) sul browser del genoma dell'Università della California Santa Cruz (UCSC). Inoltre, descriviamo in dettaglio i passaggi per generare in modo efficiente allineamenti di più specie di sequenze di microproteine identificate per visualizzare la conservazione della sequenza di aminoacidi e raccomandiamo risorse per analizzare le caratteristiche delle microproteine, comprese le strutture di dominio previste. Questi potenti strumenti possono essere utilizzati per aiutare a identificare presunte sequenze di codifica microproteica in regioni genomiche non canoniche o per escludere la presenza di una sequenza di codifica conservata con potenziale traslazionale in una trascrizione non codificante di interesse.
Introduzione
L'identificazione del set completo di elementi codificanti nel genoma è stato un obiettivo importante sin dall'inizio del Progetto Genoma Umano, e rimane un obiettivo centrale verso la comprensione dei sistemi biologici e l'eziologia delle malattie a base genetica 1,2,3,4. I progressi nelle tecniche NGS hanno portato alla produzione di sequenze di genoma intero per un vasto numero di organismi, tra cui vertebrati, invertebrati, lieviti e piante5. Inoltre, i metodi di sequenziamento trascrizionale ad alto rendimento ha....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Il protocollo descritto di seguito descrive i passaggi per caricare e navigare le tracce del browser PhyloCSF sul browser del genoma UCSC (generato da Mudge et al.49). Per domande generali riguardanti il browser del genoma UCSC, una guida per l'utente del browser Genome completa può essere trovata qui: https://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/hgTracksHelp.html.
1. Caricamento dell'hub di traccia PhyloCSF sul browser del genoma UCSC
- Aprire una finestra del browser Internet e passare al browser del genoma UCSC (
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Qui useremo la microproteina convalidata mitoregulina (Mtln) come esempio per dimostrare come un sORF conservato genererà un punteggio PhyloCSF positivo che può essere facilmente visualizzato e analizzato sul browser del genoma UCSC. La mitoregulina è stata precedentemente annotata come RNA non codificante (precedentemente gene umano ID LINC00116 e gene di topo ID 1500011K16Rik). La genomica comparativa e i metodi di analisi della conservazione delle sequenze hanno svolto un ruolo fondamentale nella sua.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Il protocollo qui presentato fornisce istruzioni dettagliate su come interrogare le regioni genomiche di interesse per il potenziale di codifica delle microproteine utilizzando PhyloCSF sul browser del genoma UCSC 48,49,50,51. Come descritto sopra, PhyloCSF è un potente algoritmo di genomica comparativa che integra modelli filogenetici e frequenze di sostituzione dei codone per identificare le .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del National Institutes of Health (HL-141630 e HL-160569) e della Cincinnati Children's Research Foundation (Trustee Award).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Sito web | Indirizzo del sito web | Requisiti | |
| Clustal Omega Multiple Sequence Alignment Tool | https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ | Browser | WebProgramma di allineamento di sequenze multiple per l'allineamento efficiente delle sequenze FASTA (ad es. per il confronto tra specie di microproteine identificate) |
| COXPRESSdb | https://coxpresdb.jp | Web browser | Fornisce relazioni geniche co-regolate per stimare le funzioni geniche |
| Domande frequenti sugli strumenti di bioinformatica EMBL-EBI | https://www.ebi.ac.uk/seqdb/confluence/display/JDSAT/Bioinformatics+Tools+FAQ | Web browser | Domande frequenti (FAQ) per gli strumenti EMBL-EBI. Include la chiave di codifica a colori per gli allineamenti delle sequenze proteiche |
| Istituto europeo di bioinformatica (EMBL-EBI), Strumenti e risorse di dati | https://www.ebi.ac.uk/services/all | Browser Web | Elenco completo di siti Web, strumenti e risorse di dati disponibili gratuitamente |
| Expasy - Swiss Bioinformatics Resource Portal | https://www.expasy.org | Web browser | Suite di strumenti bioinformatici e risorse per l'analisi delle sequenze proteiche gestita dall'Istituto svizzero di bioinformatica (SIB)Centro |
| nazionale per l'informazione biotecnologica (NCBI) | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi | Strumento | di ricerca del browser Web per identificare domini conservati all'interno di sequenze proteiche o nucleotidiche codificanti |
| Pfam 35 | http://pfam.xfam.org | browser Web | , fornisce allineamenti e classificazione di Famiglie e domini di proteine |
| PhyloCSF Track Hub Descrizione | https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTrackUi?hgsid=1267045267_TEc99h2oW5Q edaCd4ir8aZ65ryaD&db=mm10 &c=chr2&g=hub_109801_ PhyloCSF_smooth | Browser web | Descrizione dettagliata delle tracce PhyloCSF levigate e del PhyloCSF Track Hub |
| SignalP 6.0 | https://services.healthtech.dtu.dk/service.php? SignalP-6.0 | Web browser | Prevede la presenza di peptidi segnale e la posizione dei loro siti di scissione |
| TMHMM - 2.0 | https://services.healthtech.dtu.dk/service.php? TMHMM-2.0 | Web browser | Previsione delle eliche transmembrana nelle proteine |
| UCSC Genome Browser BLAT Search | https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat | Web browser | Strumento utilizzato per trovare regioni genomiche utilizzando le informazioni sul DNA o sulla sequenza proteica |
| UCSC Genome Browser Gateway | https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway | Web browser | Collegamento diretto al Browser Genoma dell'UCSC Gateway Genoma dell'UCSC |
| Home < | a href="https://genome.ucsc.edu/">https://genome.ucsc.edu/ | Web browser | Home sito web per l'UCSC Genome |
| Browser Traccia gli hub dei dati | https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgHubConnect#publicHubs | Browser Web | Collegamento diretto al database Track Data Hubs/Public Hubs per cercare e caricare la Guida per l'utente del browser PhyloCSF Tracks |
| UCSC | https://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/hgTracksHelp.html | Browser Web | Guida utente completa che descrive in dettaglio come navigare nel browser del genoma UCSC |
| WoLF PSORT | a href="https://wolfpsort.hgc.jp">https://wolfpsort.hgc.jp | Browser Web | Strumento di previsione della localizzazione subcellulare delle proteine |
Riferimenti
- Collins, F. S., Morgan, M., Patrinos, A. The human genome project: lessons from large-scale biology. Science. 300 (5617), 286-290 (2003).
- Lander, E. S., et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409 (6822), 860-921 (2001).
- Sachidanandam, R., <....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
