Maggiore riproducibilità e precisione della quantificazione ad alto rendimento dei dati di crescita batterica utilizzando un lettore di micropiastre

Summary

Qui viene presentato un protocollo ad alto rendimento per misurare i dati di crescita, comprese le curve di crescita, il tasso di crescita e il tasso di crescita massimo. Il protocollo è stato verificato e convalidato utilizzando due batteri produttori di biofilm. I risultati e l'approccio applicati in questo studio possono essere estesi ad altri protocolli ad alto rendimento che utilizzano lettori di micropiastre.

Abstract

Questo studio mirava a sviluppare un protocollo ripetibile, affidabile e ad alto rendimento per monitorare la crescita batterica in piastre a 96 pozzetti e analizzare il tasso di crescita massimo. Sono state determinate le curve di crescita e i tassi di crescita massimi di due specie batteriche. Sono stati studiati problemi tra cui (i) condensazione del coperchio, (ii) correzione della lunghezza del percorso, (iii) dimensione dell'inoculazione, (iv) intervallo di tempo di campionamento e (v) distorsione spaziale. La ripetibilità del protocollo è stata valutata con tre repliche tecniche indipendenti, con una deviazione standard di 0,03 tra le esecuzioni. I tassi massimi di crescita di Bacillus mycoides e Paenibacillus tundrae sono stati determinati rispettivamente in (media ± DS) 0,99 ^h-1 ± 0,03 ^h-1 e 0,85 ^h-1 ± 0,025 ^h-1. Questi batteri sono più difficili da monitorare otticamente a causa della loro affinità a raggrupparsi. Questo studio dimostra l'importanza critica delle dimensioni dell'inoculazione, della correzione della lunghezza del percorso, del riscaldamento del coperchio, degli intervalli di tempo di campionamento e della distorsione spaziale della piastra per ottenere dati affidabili, accurati e riproducibili sui lettori di micropiastre. Il protocollo sviluppato e le sue fasi di verifica possono essere estesi ad altri metodi utilizzando lettori di micropiastre e protocolli ad alta produttività, riducendo gli errori innati dei ricercatori e i costi dei materiali.

Introduction

Lo sviluppo dell'interesse per la manipolazione multi-omica, compresi gli studi sui meccanismi e sul metabolismo dei batteri, sottolinea l'importanza di metodi automatizzati e ad alto rendimento come la registrazione dei dati di crescita ^1,2. I dati di crescita che comprendono parametri cinetici, come i tassi di crescita massimi, possono aiutare a caratterizzare le risposte batteriche a diverse condizioni fisiche, chimiche e antibatteriche. I dati sul tasso di crescita sono una variabile di risposta standard utilizzata per scoprire potenziali collegamenti....

Protocol

NOTA: Tutti i passaggi di questo protocollo devono essere seguiti in condizioni sterili (ad esempio, tra due fiamme o una cappa di biosicurezza). Tutti i materiali e gli strumenti vengono sterilizzati in autoclave per 20 minuti. Consulta la Tabella dei materiali per i dettagli su tutti i materiali, le attrezzature e il software utilizzati in questo protocollo. Le mani guantate vengono disinfettate, mantenute bagnate con disinfettante per le mani o soluzione alcolica al 70% per almeno 1 minuto e successivamente non rimosse dall'armadio di sicurezza. In caso contrario, la procedura di disinfezione deve essere ripetuta prima di reinserire le mani nell'ar....

Results

Validazione della lettura OD e fattore di correzione della lunghezza del percorso
Campioni divisi di coltura di B. mycoides sono stati prelevati in diversi punti temporali e misurati utilizzando il lettore di micropiastre e lo spettrofotometro (Figura 1A). Questo passaggio è stato eseguito per convalidare i risultati su diversi dispositivi. I dati di OD₆₀₀ erano correlati ma non corrispondevano (Figura 1B). La correlazione.......

Discussion

I lettori di micropiastre consentono di ottenere tassi di crescita costanti e ripetibili. Questa tecnologia riduce al minimo l'errore umano e consente il campionamento ad alto rendimento. La piccola quantità di coltura richiesta per campione rende questo approccio un'alternativa interessante e a basso costo alla conta cellulare con fiasche o provette. I lettori di micropiastre consentono di ottenere campioni di grandi dimensioni, aumentando la potenza statistica e facilitando successivam.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuga	Eppendorf	5810 R
Provette per centrifuga - 15 mL	ThermoFisher - Scientifico	339650	Provette sterili
per centriguge - 50 mL	ThermoFisher - Scientifico	339652	Ansa di
inoculazione monouso sterile , 10 & micro; L	Cole-Parmer	UZ-06231-08	Palloni sterili
di Erlenmeyer - 250 mL	Cole-Parmer	UZ-34502-59	Vetro
Isopropanolo	ThermoFisher - Scientifico	396982500	≥ 99.0
Soluzione salina tampone fosfato	Sigma-Aldrich	P4417
Punte di pipetta 1.000 &; L	ThermoFisher- Scientifico	UZ-25001-76
Punte di pipetta 10 mL	ThermoFisher - Scientifico	UZ-25001-83
Punte di pipetta 200 & micro; L	ThermoFisher- Scientifico	UZ-25001-85
Punte di pipetta 5 mL	ThermoFisher - Scientifico	UZ-25001-80
Pipettatore 1.000 &; L	Cole-Parmer	UZ-07909-11
Pipettatore 10 ml	Cole-Parmer	UZ-07909-15
Pipettatore 200 µ L	Cole-Parmer	UZ-07909-09
Pipettatore 5 mL	Cole-Parmer	UZ-07859-30
Brodo di soia triptico	Millipore	22091	Adatto per microbiologia