Numerose nuove sequenze simili a virus sono state trovate nelle zanzare a causa dell'ampio uso di tecnologie di sequenziamento. Forniamo una procedura efficace per isolare e amplificare i virus utilizzando linee cellulari di vertebrati e zanzare, che potrebbero servire come base per studi futuri sui virus associati alle zanzare, compresi i virus trasmessi dalle zanzare e specifici per le zanzare.
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Articolo metodologico
Isolamento del virus associato alle zanzare dalle zanzare raccolte sul campo
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Con l'ampia applicazione delle tecnologie di sequenziamento, molte nuove sequenze simili a virus sono state scoperte negli artropodi, comprese le zanzare. Le due categorie principali di questi nuovi virus associati alle zanzare sono "virus trasmessi dalle zanzare (MBV)" e "virus specifici delle zanzare (MSV)". Questi nuovi virus potrebbero essere patogeni sia per i vertebrati che per le zanzare, o potrebbero semplicemente essere simbiotici con le zanzare. I virus entità sono essenziali per confermare i caratteri biologici di questi virus. Pertanto, qui è stato descritto un protocollo dettagliato per l'isolamento e l'amplificazione del virus dalle zanzare raccolte sul campo. In primo luogo, i campioni di zanzara sono stati preparati come surnatanti di omogenati di zanzare. Dopo due centrifugazioni, i surnatanti sono stati poi inoculati nella linea cellulare di zanzara C6/36 o nella linea cellulare di vertebrati BHK-21 per l'amplificazione del virus. Dopo 7 giorni, i surnatanti sono stati raccolti come supernatanti P1 e conservati a -80 °C. Successivamente, i supernatanti P1 sono stati fatti passare altre due volte nelle cellule C6/36 o BHK-21 mentre lo stato della cellula veniva controllato quotidianamente. Quando è stato scoperto l'effetto citopatogeno (CPE) sulle cellule, questi surnatanti sono stati raccolti e utilizzati per identificare i virus. Questo protocollo serve come base per la ricerca futura sui virus associati alle zanzare, inclusi MBV e MSV.
Introduzione
Le zanzare sono un gruppo di importanti vettori di artropodi patogeni. Ci sono circa 3.500 specie di zanzare nella famiglia Culicidae 1,2. Lo sviluppo di tecnologie di sequenziamento ad alto rendimento ha portato alla scoperta di molte nuove sequenze simili a virus nelle zanzare provenienti da diverse parti del mondo3. Generalmente, questi virus associati alle zanzare possono essere classificati in due gruppi principali: MBV e MSV.
Gli MBV sono un gruppo di virus diversi che sono agenti causali di molte malattie umane o animali, come il virus della febbre gia....
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Protocollo
1. Campionamento e selezione delle zanzare
- Intrappola le zanzare adulte attraverso le trappole luminose MXA-02 o le trappole per zanzare ad anidride carbonica sul campo.
- Uccidere le zanzare raccolte immergendo nell'azoto liquido10,11. Trasportarli in laboratorio con il sistema logistico della catena del freddo12.
NOTA: il ghiaccio secco è stato utilizzato principalmente nel sistema logistico della catena del freddo. - (Facoltativo) Se i siti di campionamento erano vicini al laboratorio, inviare direttamente le zanzare vive nelle trappole d....
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Risultati
Dopo l'inoculazione con i surnatanti degli omogenati di zanzara (P0), le cellule C6/36 hanno mostrato un ampio spazio intercellulare e le cellule esfoliate sono state osservate a 120 ore (Figura 1A) rispetto alle cellule non inoculate (controllo) allo stesso tempo (Figura 1B). Dopo aver incubato le cellule BHK-21 con i supernatanti P3, è stato osservato CPE visibile nelle cellule BHK-21 a 48 ore (Figura 1C) in contrasto con le cellu.......
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Discussione
L'obiettivo di questo metodo era quello di offrire un modo pratico per isolare i virus associati alle zanzare utilizzando varie linee cellulari. È fondamentale aggiungere l'antibiotico-antimicotico (penicillina-streptomicina-amfotericina) ai surnatanti degli omogenati di zanzara per evitare la contaminazione da batteri o funghi. Le zanzare e i supernatanti virali ottenuti sul campo devono essere refrigerati a -80 °C per evitare ripetuti cicli di gelo-disgelo.
Un altro passo fondamentale nel pr.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal Wuhan Science and Technology Plan Project (2018201261638501).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,22 µ m filtro a membrana | Millipore | SLGP033RB | Film polimerici con specifiche valutazioni dei pori. Per rimuovere detriti cellulari e batteri. |
| Piastre a 24 pozzetti | CORNING | 3524 | Contenitori per cellule |
| 75 cm2 | Flaconi CORNING | 430641 | Contenitori per cella |
| una provetta sterile da 2 mL con perle in ceramica da | |||
| Antibiotico-Antimicotico | Gibco | 15240-062 | Antibiotico nel terreno per prevenire la contaminazione da batteri e funghi |
| Acido nucleico automatizzato sistema di estrazione | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 cellule | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| C6/36 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Macchina centrifuga | Himac | CF16RN | Strumento per la centrifugazione di campioni di zanzara |
| CO2 | |||
| Dulbecco' s terreno essenziale minimo (DMEM) | di C11995500BT | Gibco | per linee cellulari di vertebrati |
| Virus | Isolamento Cu20-XJ | ||
| Siero bovino di feta (FBS) | Gibco | 10099141C | Fornire nutrimento per le cellule |
| omogeneizzatore tissutale ad alta velocità e bassa | temperaturabio | KZ-III-F | Strumento per la macinazione |
| incubatrice (28 ° C) | Panasonic | MCO-18AC | Strumento per incubatore per colture cellulari |
| (37 ° C) | Panasonic | MCO-18AC | Strumento per colture cellulari |
| PCR provetta | |||
| penicillina-streptomicina | Gibco | 15410-122 | Antibiotico nel terreno per prevenire la contaminazione da batteri |
| Penicillina-Streptomicina-Amfotericina B Soluzione | Gibco | 15240096 | |
| Frigorifero (-80 ° C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Roswell Park Memorial Institute terreno (RPMI) | di C11875500BT | Gibco | per linee cellulari mosiquto |
| Provette di conservazione con tappo a vite (2 mL) | biofil | ||
| pestelli sterili | Tiangen | OSE-Y004 | Materiali di consumo per la macinazione |
| TGrinder OSE-Y30 trituratore elettrico | per tessuti Tiangen | OSE-Y30 | Strumento per la macinazione |
| Il microscopio da dissezione | ZEISS | stemi508 | |
| le trappole luminose MXA-02 | Maxttrac | ||
| La macchina | per assorbire le zanzareNingbo Bangning | ||
| Le punte della pipetta | Axygen | TF | |
| Il mini kit di RNA virale QIAamp QIAGEN | 52906 | ||
| Pinzetta | Dumont | 0203-5-PO |
Riferimenti
- Xia, H., Wang, Y., Atoni, E., Zhang, B., Yuan, Z. Mosquito-associated viruses in China. Virologica Sinica. 33 (1), 5-20 (2018).
- Atoni, E., et al. A dataset of distribution and diversity of mosquito-associated viruses and their mosquito vectors in China. ....
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Ristampe e permessi
