Method Article

Miglioramento dell'imaging ad alta risoluzione di assemblaggi di virus in liquidi e ghiaccio

DOI:

10.3791/63856

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July 20th, 2022

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1Department of Biomedical Engineering, Pennsylvania State University, 2Department of Materials Science and Engineering, McMaster University, 3Bioinformatics and Genomics Graduate Program, Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 4Molecular, Cellular, and Integrative Biosciences Graduate Program, Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 5Materials Research Institute, Pennsylvania State University, 6Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 7Applications team, Direct Electron, 8Application Scientist, Protochips, Inc., 9Department of Biology, Wake Forest University

In This Article

Retraction Notice

This article, Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice, has been retracted at the request of the Editors-in-Chief due to concerns about the integrity of the data presented. These concerns included: (a) Figure 3 was found to contain noise without structural features expected for a protein capsid; (b) critical half-map data necessary to verify resolution claims were not deposited; (c) there was a lack of system logs or controls to rule out stage drift regarding observed movements in Figure 3; and (d) the absence of protocols to address Brownian motion and beam-induced drift significantly weakened the reliability of the findings.<br/><br/>The corresponding author's indication she principally relied on RMEASURE program did not sufficiently address the publisher's concerns. After consulting external experts, the Editors-in-Chief concluded that the issues remain unresolved, and the data do not meet JoVE's standards for scientific reliability and reproducibility, requiring retraction. The corresponding author disagrees with the grounds for retraction. Co-authors DiCecco, Grandfield and Bator agree with the retraction. Other co-authors were unavailable for comment.

Summary

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Qui vengono descritti i protocolli per preparare assemblaggi di virus adatti per l'analisi liquido-EM e crio-EM su scala nanometrica utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione.

Abstract

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L'interesse per la microscopia a elettroni liquidi (liquid-EM) è salito alle stelle negli ultimi anni, poiché gli scienziati possono ora osservare i processi in tempo reale su scala nanometrica. È estremamente desiderabile accoppiare informazioni crio-EM ad alta risoluzione con osservazioni dinamiche poiché molti eventi si verificano su scale temporali rapide - nell'intervallo di millisecondi o più velocemente. Una migliore conoscenza delle strutture flessibili può anche aiutare nella progettazione di nuovi reagenti per combattere i patogeni emergenti, come SARS-CoV-2. Ancora più importante, la visualizzazione di materiali biologici in un ambiente fluido offre uno sguardo unico delle loro prestazioni nel corpo umano. Qui sono presentati metodi recentemente sviluppati per studiare le proprietà su scala nanometrica degli assemblaggi di virus nel ghiaccio liquido e vetroso. Per raggiungere questo obiettivo, sono stati utilizzati campioni ben definiti come sistemi modello. Vengono presentati confronti affiancati dei metodi di preparazione dei campioni e delle informazioni strutturali rappresentative. Le caratteristiche sub-nanometriche sono mostrate per le strutture risolte nell'intervallo di ~ 3,5-Å-10 Å. Altri risultati recenti che supportano questo quadro complementare includono approfondimenti dinamici dei candidati vaccini e delle terapie basate su anticorpi visualizzate in liquido. Nel complesso, queste applicazioni correlate migliorano la nostra capacità di visualizzare le dinamiche molecolari, fornendo un contesto unico per il loro uso nella salute umana e nelle malattie.

Introduction

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La ricerca biomedica migliora la nostra comprensione della salute umana e delle malattie attraverso lo sviluppo di nuove tecnologie. L'imaging ad alta risoluzione sta trasformando la nostra visione del nanomondo, permettendoci di studiare cellule e molecole in dettaglio squisito 1,2,3,4,5. Le informazioni statiche di componenti dinamici come polimeri molli, assemblaggi proteici o virus umani rivelano solo un'istantanea limitata della loro complessa narrazione. Per comprendere meglio come operano le entità m....

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Protocol

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1. Caricamento del portacampioni per liquid-EM

  1. Pulire i microchip di nitruro di silicio (SiN) incubando ciascun chip in 150 ml di acetone per 2 minuti, seguito dall'incubazione in 150 ml di metanolo per 2 minuti. Lasciare asciugare i trucioli nel flusso d'aria laminare.
  2. Pulire al plasma i trucioli essiccati utilizzando uno strumento a scarica di bagliore operante in condizioni standard di 30 W, 15 mA per 45 s utilizzando gas Argon.
  3. Caricare un microchip a base asciutta nella punta del supporto del campione. Aggiungere ~0,2 μL di campione (0,2-1 mg/ml di gruppi virali in 50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl 2; 10 m....

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Results

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Un TEM liquido funzionante a 200 kV è stato utilizzato per tutti gli esperimenti di imaging liquid-EM e un crio-TEM funzionante a 300 kV è stato utilizzato per tutta la raccolta di dati crio-EM. Vengono presentate immagini rappresentative e strutture di più virus per dimostrare l'utilità dei metodi in vari soggetti del test. Questi includono il virus adeno-associato ricombinante sottotipo 3 (AAV), gli assemblaggi subvirali SARS-CoV-2 derivati dal siero del paziente e le particelle a doppio strato (DLP) del rotavirus dell.......

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Discussion

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Vengono presentate nuove opportunità per semplificare gli attuali flussi di lavoro liquid-EM utilizzando nuovi strumenti automatizzati e tecnologie adattate dal campo crio-EM. Le applicazioni che coinvolgono la nuova tecnica a sandwich di microchip sono significative rispetto ad altri metodi perché consentono l'analisi di imaging ad alta risoluzione in ghiaccio liquido o vetroso. Uno dei passaggi più critici del protocollo è la produzione di campioni con lo spessore liquido ideale per visualizzare dettagli squisiti a liv.......

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Disclosures

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti. L'autrice, Madeline J. Dressel-Dukes, è un dipendente di Protochips, Inc. e Michael Spilman è un dipendente di DirectElectron.

Acknowledgements

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Gli autori riconoscono il Dr. Luk H. Vandenberghe (Harvard Medical School, Dipartimento di Oftalmologia) per aver fornito AAV-3 purificato. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health e dal National Cancer Institute (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700 a D.F.K.).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AcetoneFisher Scientific  A11-1Strumento
di ritaglio per caricatore automaticoThermoFisher ScientificN/AAnche SubAngstrom
fornitore Clip per griglia per caricatori automaticiThermoFisher ScientificN/A clip superiori e inferiori
Griglie EM in oro rivestite di carbonio Microscopiaelettronica ScienzeCF400-AU-50400 mesh, spessore 5 nm
paziente COVID-19RayBiotechCoV-Pos-S-500500 microlitri di siero PCR+
MetanoloFisher Scientific  A412-1
Microchip integrati in micropozzetti daProtochips, Inc.EPB-42A1-10Array di finestre 10x10 mm
TEMWindows microchipSimpore Inc.SN100-A10Q33B9 grandi finestre, 10-nn di spessore
TEMWindows microchipSimpore, Inc.SN100-A05Q33A9 piccole finestre, 5 nm di spessore
Top microchipProtochips, Inc.EPT-50W500 mm x 100 mm finestra
Whatman #1 carta da filtroWhatman1001 090100 pezzi, 90 mm
Attrezzatura  Rivelatore di elettroni diretti
DirectViewElettroneSpaziatura dei pixel di 6 micron
Falcon 3 Rilevatore di elettroni diretti ECThermoFisher ScientificSpaziatura dei pixel di 14 micron
Gatan 655 Stazione di pompaggio a seccoGatan, Inc.  Punta portapompa a 10-6 range
Mark IV VitrobotThermoFisher Scientificdi preparazione campioni all'avanguardia 
PELCO easiGlow, unità di scarica a baglioreTed Pella, Inc.  Modalità a polarità negativa
Poseidon Select portacampioniProtochips, Inc.  Compatibile FEI; portacampioni
Talos F200C TEMThermoFisher Scientific200 kV; Liquid-TEM
Titan Krios G3ThermoFisher Scientific300 kV; Cryo-TEM
strong>Software disponibile gratuitamenteCollegamento al sito webCommenti (opzionale)
cryoSPARChttps://cryosparc.com/altri software di elaborazione delle immagini
CTFFIND4https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4programma di ricerca CTF
MotionCorr2
RELIONhttps://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page
SerialEMhttps://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
UCSF Chimerahttps://www.cgl.ucsf.edu/chimera/software per l'analisi della struttura molecolare
da 1 litro Siero 1 litro diretto unità <https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software pacchetto

References

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  1. Deng, W., et al. Assembly, structure, function and regulation of type III secretion systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (6), 323-337 (2017).
  2. Oikonomou, C. M., Chang, Y. -W., Jensen, G. J. A new view into prokaryotic cell biolo....

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