Method Article

Miglioramento dell'imaging ad alta risoluzione di assemblaggi di virus in liquidi e ghiaccio

DOI:

10.3791/63856

⸱

July 20th, 2022

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1Department of Biomedical Engineering, Pennsylvania State University, 2Department of Materials Science and Engineering, McMaster University, 3Bioinformatics and Genomics Graduate Program, Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 4Molecular, Cellular, and Integrative Biosciences Graduate Program, Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 5Materials Research Institute, Pennsylvania State University, 6Huck Institutes of the Life Sciences, Pennsylvania State University, 7Applications team, Direct Electron, 8Application Scientist, Protochips, Inc., 9Department of Biology, Wake Forest University

In This Article

Retraction Notice

This article, Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice, has been retracted at the request of the Editors-in-Chief due to concerns about the integrity of the data presented. These concerns included: (a) Figure 3 was found to contain noise without structural features expected for a protein capsid; (b) critical half-map data necessary to verify resolution claims were not deposited; (c) there was a lack of system logs or controls to rule out stage drift regarding observed movements in Figure 3; and (d) the absence of protocols to address Brownian motion and beam-induced drift significantly weakened the reliability of the findings.<br/><br/>The corresponding author's indication she principally relied on RMEASURE program did not sufficiently address the publisher's concerns. After consulting external experts, the Editors-in-Chief concluded that the issues remain unresolved, and the data do not meet JoVE's standards for scientific reliability and reproducibility, requiring retraction. The corresponding author disagrees with the grounds for retraction. Co-authors DiCecco, Grandfield and Bator agree with the retraction. Other co-authors were unavailable for comment.

Summary

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Qui vengono descritti i protocolli per preparare assemblaggi di virus adatti per l'analisi liquido-EM e crio-EM su scala nanometrica utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'interesse per la microscopia a elettroni liquidi (liquid-EM) è salito alle stelle negli ultimi anni, poiché gli scienziati possono ora osservare i processi in tempo reale su scala nanometrica. È estremamente desiderabile accoppiare informazioni crio-EM ad alta risoluzione con osservazioni dinamiche poiché molti eventi si verificano su scale temporali rapide - nell'intervallo di millisecondi o più velocemente. Una migliore conoscenza delle strutture flessibili può anche aiutare nella progettazione di nuovi reagenti per combattere i patogeni emergenti, come SARS-CoV-2. Ancora più importante, la visualizzazione di materiali biologici in un ambiente fluido offre uno sguardo unico delle loro prestazioni nel corpo umano. Qui sono presentati metodi recentemente sviluppati per studiare le proprietà su scala nanometrica degli assemblaggi di virus nel ghiaccio liquido e vetroso. Per raggiungere questo obiettivo, sono stati utilizzati campioni ben definiti come sistemi modello. Vengono presentati confronti affiancati dei metodi di preparazione dei campioni e delle informazioni strutturali rappresentative. Le caratteristiche sub-nanometriche sono mostrate per le strutture risolte nell'intervallo di ~ 3,5-Å-10 Å. Altri risultati recenti che supportano questo quadro complementare includono approfondimenti dinamici dei candidati vaccini e delle terapie basate su anticorpi visualizzate in liquido. Nel complesso, queste applicazioni correlate migliorano la nostra capacità di visualizzare le dinamiche molecolari, fornendo un contesto unico per il loro uso nella salute umana e nelle malattie.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La ricerca biomedica migliora la nostra comprensione della salute umana e delle malattie attraverso lo sviluppo di nuove tecnologie. L'imaging ad alta risoluzione sta trasformando la nostra visione del nanomondo, permettendoci di studiare cellule e molecole in dettaglio squisito 1,2,3,4,5. Le informazioni statiche di componenti dinamici come polimeri molli, assemblaggi proteici o virus umani rivelano solo un'istantanea limitata della loro complessa narrazione. Per comprendere meglio come operano le entità molecolari, la loro struttura e funzione devono essere studiate congiuntamente.

I recenti progressi nella produzione di materiali come il grafene atomicamente sottile o i microchip a base di silicio offrono nuove opportunità per l'analisi struttura-funzione in tempo reale utilizzando microscopi elettronici a trasmissione (TEM). Questi materiali possono creare camere ermeticamente sigillate per l'imaging EM live 6,7,8,9,10,11. Il nuovo campo di liquido-EM, la temperatura ambiente correlata alla crio-EM, fornisce una visione senza precedenti di materiali duri o morbidi in soluzione, consentendo agli scienziati di studiare simultaneamente la struttura e la dinamica del loro campione. Le applicazioni liquid-EM includono registrazioni in tempo reale di nanoparticelle terapeutiche che interagiscono con le cellule staminali tumorali e cambiamenti nelle complessità molecolari dei patogeni virali12,13,14.

Proprio come i progressi metodologici hanno stimolato la rivoluzione della risoluzione nel campo della crio-EM, sono necessarie nuove tecniche e metodi per estendere l'uso di liquid-EM come strumento ad alto rendimento per la comunità scientifica. L'obiettivo generale dei metodi qui presentati è quello di semplificare i protocolli di preparazione dei campioni liquidi-EM. La logica alla base delle tecniche sviluppate è quella di impiegare nuovi progetti di microchip e dispositivi di autoloader, adatti sia per la raccolta di dati liquidi che crio-EM (Figura 1) 7,14,15,16,17. I gruppi sono sigillati meccanicamente utilizzando clip a griglia standard per strumenti automatizzati, come Krios, che possono ospitare più campioni per sessione o un TEM F200C (Figura 2). Questa metodologia espande l'uso dell'imaging ad alta risoluzione oltre le applicazioni crio-EM standard, dimostrando scopi più ampi per l'analisi dei materiali in tempo reale.

Nell'attuale articolo video, vengono presentati i protocolli per la preparazione di assemblaggi di virus in liquido con e senza portacampioni disponibili in commercio. Utilizzando il portacampioni specializzato per liquido-EM, i campioni liquidi sottili possono fornire informazioni strutturali paragonabili ai campioni crio-EM, nonché approfondimenti dinamici dei campioni. Vengono inoltre dimostrati metodi per la preparazione di campioni liquidi utilizzando strumenti di caricamento automatico per routine ad alta produttività. Il vantaggio principale rispetto ad altre tecniche è che la produzione automatizzata di campioni consente all'utente di valutare rapidamente i propri campioni per lo spessore e il dosaggio di elettroni ottimali prima della raccolta dei dati. Questa tecnica di screening identifica rapidamente le aree ideali per le registrazioni in tempo reale in liquido o ghiaccio12,14,18,19. Ai fini della determinazione della struttura 3D, liquid-EM può integrare i metodi crio-EM di lunga data implementati nella crio-EM. I lettori che impiegano tecnologie TEM o crio-EM convenzionali possono prendere in considerazione l'utilizzo di flussi di lavoro liquid-EM per fornire nuove osservazioni dinamiche dei loro campioni in un modo che integri le loro attuali strategie.

I campioni di virus utilizzati in questo protocollo includono il sottotipo 3 del virus adeno-associato purificato (AAV) ottenuto come dono e coltivato in condizioni standard12. Sono stati utilizzati anche assemblaggi subvirali non infettivi di SARS CoV-2 derivati dal siero di pazienti COVID-1912 e ottenuti da una fonte commerciale. Infine, le particelle purificate a doppio strato (DLP) del rotavirus delle scimmie (ceppo SA11) sono state ottenute dal laboratorio della dottoressa Sarah M. McDonald Esstman presso la Wake Forest University e coltivate utilizzando condizioni standard 6,17. I pacchetti software qui descritti sono disponibili gratuitamente e i collegamenti sono stati forniti nella sezione Tabella dei materiali.

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Protocol

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1. Caricamento del portacampioni per liquid-EM

  1. Pulire i microchip di nitruro di silicio (SiN) incubando ciascun chip in 150 ml di acetone per 2 minuti, seguito dall'incubazione in 150 ml di metanolo per 2 minuti. Lasciare asciugare i trucioli nel flusso d'aria laminare.
  2. Pulire al plasma i trucioli essiccati utilizzando uno strumento a scarica di bagliore operante in condizioni standard di 30 W, 15 mA per 45 s utilizzando gas Argon.
  3. Caricare un microchip a base asciutta nella punta del supporto del campione. Aggiungere ~0,2 μL di campione (0,2-1 mg/ml di gruppi virali in 50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl 2; 10 mM CaCl2) al chip di base. Dopo una fase di incubazione di 1-2 minuti, posizionare il chip superiore sul chip di base umido contenente il campione.
  4. Bloccare insieme il gruppo per formare un involucro ermeticamente sigillato, tenuto in posizione meccanicamente da tre viti in ottone. Dopo aver sigillato il gruppo, pompare la punta a 10-6 Torr utilizzando una stazione di pompaggio a secco turbopompata. Il supporto è ora pronto per essere inserito nel TEM.
    NOTA: Il supporto di selezione non ha capacità di raffreddamento e non viene utilizzato per crio-EM.

2. Produzione di assemblaggi sandwich con microchip

NOTA: Diversi microchip SiN o biossido di silicio (SiO) possono essere utilizzati direttamente dalle confezioni di gel spedite. Le griglie d'oro rivestite in carbonio possono anche essere utilizzate direttamente come fornite.

  1. Pulire al plasma i microchip e le griglie di carbonio utilizzando uno strumento a scarica di bagliore operante in condizioni standard di 30 W, 15 mA per 45 s utilizzando gas Argon.
  2. Aggiungere ~ 2 μL di campione contenuto in 50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 10 mM MgCl2; 10 mM CaCl2 su un microchip a scarica luminosa posto su un impacco di gel. Rimuovere la soluzione in eccesso (~ 50%) utilizzando una carta da filtro o una pipetta. Dopo una fase di incubazione di 1-2 minuti, aggiungere la griglia di carbonio scaricata a bagliore al microchip umido contenente il campione.
  3. Fissare insieme il gruppo utilizzando un portacampioni a inclinazione singola o clip a griglia con caricatore automatico a temperatura ambiente per formare un involucro ermeticamente sigillato. Per i morsetti del caricatore automatico, posizionare il gruppo sandwich sulla clip a C inferiore, posizionare la clip superiore sulla parte superiore del gruppo e utilizzare lo strumento di serraggio standard per sigillare il gruppo.
    NOTA: La procedura di serraggio eseguita qui utilizza gli stessi passaggi del bloccaggio della griglia crio-EM, ma a temperatura ambiente. I campioni bloccati possono essere conservati per 2 mesi o più prima dell'imaging mantenendo il liquido nell'involucro. Non viene utilizzato alcun controllo delle perdite con un portacampioni a temperatura ambiente o con il caricatore automatico.
  4. Il campione è ora pronto per essere inserito nel TEM. Esaminare i campioni posti in caricatori automatici in condizioni criogeniche o a temperatura ambiente.

3. Imaging di campioni utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione

  1. Imaging liquido-EM
    1. Caricare il portacampioni nel TEM dotato di una pistola a emissione di campo (FEG) e funzionante a 200 kV.
    2. Accendere la pistola e regolare l'altezza eucentrica dello stadio del microscopio rispetto al campione utilizzando la funzione oscillante, inclinando il campione da -15° a +15° nella colonna. Questa procedura regola lo stadio nella direzione Z per adattarsi allo spessore del campione. E aiuta a garantire un ingrandimento accurato durante la registrazione delle immagini.
    3. Registra le immagini come filmati a fotogrammi lunghi utilizzando il pacchetto in situ integrato con un rilevatore diretto con una spaziatura dei pixel di 6 μm (Video 1 e Video 2). Le singole immagini possono anche essere registrate utilizzando il pacchetto software di raccolta dati seriale20, implementando routine di imaging automatizzate. Acquisisci immagini in condizioni di basso dosaggio con ingrandimenti compresi tra 28.000x-92.000x e 40 fotogrammi al secondo.
    4. Regolare i tempi di esposizione (0,25-1 s) per ridurre al minimo i danni del fascio al campione. Utilizzare un intervallo di sfocatura di -1-4 μm all'ingrandimento specificato. Se viene rilevata una soluzione spessa, utilizzare valori di sfocatura più elevati o selezionare un'area di interesse diversa.
    5. Assicurarsi che la soluzione sia presente nei campioni durante tutta la sessione di imaging focalizzando il fascio di elettroni su un'area sacrificale non utilizzata per la raccolta dei dati, fino a quando non si formano bolle (Figura supplementare 1).
  2. Imaging crio-EM
    1. Caricare le griglie EM tagliate o i sandwich con microchip nel TEM dotato di un FEG e funzionante a 300 kV. Accendere la pistola e regolare l'altezza eucentrica dello stadio del microscopio, usando una procedura simile descritta per il TEM liquido sopra (passo 3.1.2).
    2. Registra singole immagini utilizzando il sistema di analisi delle singole particelle integrato nel sistema del microscopio implementando routine di imaging automatizzate. Registra immagini in condizioni di basse dosi utilizzando il rilevatore di elettroni diretti con analisi a singola particella con una spaziatura dei pixel di 14 μm con un ingrandimento di 59.000x e 40 fotogrammi al secondo.
    3. Utilizzare un intervallo di sfocatura di 1-4 μm all'ingrandimento specificato. Se si incontrano spessi strati di ghiaccio vitreo, utilizzare valori di sfocatura più elevati o selezionare una regione diversa per la raccolta dei dati.

4. Analisi dei dati e confronti di strutture 3D

  1. Analisi del virus adeno-associato (AAV) nel ghiaccio liquido e vitreo
    1. Elaborare filmati per particelle AAV in liquido e ghiaccio utilizzando il programma RELION-3.0821 o altro software di elaborazione delle immagini22. Eseguire la correzione del movimento utilizzando MotionCor2 v1.2.3.
    2. Una volta corrette, estrarre le particelle utilizzando lo strumento di auto-picking nel pacchetto software del programma. Le dimensioni tipiche delle scatole sono 330 pixel per i campioni liquidi e 350 pixel per i campioni di ghiaccio.
    3. Calcola le ricostruzioni iniziali utilizzando la simmetria C1 utilizzando la routine del modello iniziale 3D del programma e / o le opzioni del modello ab-initio nel pacchetto software di elaborazione dati. Nel programma, utilizzare un parametro di regolarizzazione di T = 4 e una dimensione dei pixel di 1,01 Å per i campioni liquidi e 1,13 Å per i campioni di ghiaccio.
    4. Utilizzare un valore maschera di 300 Å durante le procedure di perfezionamento. Eseguire protocolli di perfezionamento nel software di elaborazione dati utilizzando la simmetria I1 per ottenere più mappe EM. La risoluzione strutturale prevista può essere compresa tra 4 Å e superiore. Utilizzare l'equivalenza delle particelle implementando la simmetria icosaedrica a 16.800 per il liquido e 15.240 per il ghiaccio12,14.
      NOTA: le stime della risoluzione si basano sui criteri di correlazione del guscio di Fourier (FSC) gold standard.
    5. Mascherare le mappe EM a ~250 Å ed esaminare i risultati utilizzando un pacchetto software di analisi della struttura molecolare23,24. Nella Figura 3, le sezioni sono mostrate con incrementi di ~5 nm.
    6. Estrarre le subunità della proteina del capside (VP1) dalle mappe EM per il confronto. Quantificare i cambiamenti dinamici tra le strutture EM in base alle misurazioni del diametro delle particelle (Figura supplementare 2) e quindi visualizzarli utilizzando la funzione di mappa Morph nel software.
  2. Analisi di assemblaggi subvirali di SARS-CoV-2 in liquido
    1. Elabora filmati utilizzando il programma RELION-3.08. Correzione della deriva dell'immagine e del movimento indotto dal fascio utilizzando MotionCor2 v1.2.3. Correggere la funzione di trasferimento del contrasto (CTF) del microscopio.
    2. Utilizzare lo strumento di selezione automatica nel programma per selezionare assemblaggi virali con una dimensione della casella di 800 pixel. Per l'efficienza computazionale, le particelle estratte possono essere ridimensionate a 256 pixel. Ottenere un modello iniziale utilizzando la simmetria C1 nel programma con un parametro di regolarizzazione di T = 2 e 1,66 Å dimensione pixel.
    3. Eseguire il perfezionamento 3D nel programma per ottenere una mappa EM, un esempio è mostrato a ~ 8,25 Å secondo i criteri FSC standard (Figura 4). Visualizza le mappe EM utilizzando il software di analisi della struttura molecolare con fette incrementate a 25 nm, come dimostrato nella Figura 4.
  3. Analisi delle particelle a doppio strato di rotavirus (DLP) nel ghiaccio vitreo
    1. Elabora filmati per DLP di rotavirus utilizzando altri software di elaborazione delle immagini. Utilizzare MotionCor2 v1.2.3 per correggere la deriva nelle immagini. Utilizzate la stima CTF della patch per correggere gli effetti dell'obiettivo sulle immagini.
    2. Estrai le particelle utilizzando lo strumento di prelievo automatico nel software con una dimensione della scatola di 950 pixel. Eseguire il down-sampling delle dimensioni della scatola in base alle esigenze informatiche.
    3. Calcola i modelli iniziali usando le opzioni ab-initio e la simmetria C1. Usa i parametri di perfezionamento, tra cui una dimensione in pixel di 1,47 Å e un valore di maschera di 800 Å.
    4. Esegui routine di perfezionamento aggiuntive imponendo la simmetria I1. I risultati di esempio includono una mappa EM di 10,15 Å, secondo i criteri FSC gold standard. Le particelle totali utilizzate erano 2050, che equivale a 123.000 unità protomeriche a causa dell'operatore di simmetria icosaedrica (Figura 5).
    5. Maschera le mappe finali a ~ 750 Å e visualizza i risultati nel pacchetto software di analisi della struttura molecolare. Le sezioni di esempio attraverso la mappa EM sono mostrate nella Figura 5 con incrementi di ~10 nm.

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Results

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Un TEM liquido funzionante a 200 kV è stato utilizzato per tutti gli esperimenti di imaging liquid-EM e un crio-TEM funzionante a 300 kV è stato utilizzato per tutta la raccolta di dati crio-EM. Vengono presentate immagini rappresentative e strutture di più virus per dimostrare l'utilità dei metodi in vari soggetti del test. Questi includono il virus adeno-associato ricombinante sottotipo 3 (AAV), gli assemblaggi subvirali SARS-CoV-2 derivati dal siero del paziente e le particelle a doppio strato (DLP) del rotavirus dell...

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Discussion

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Vengono presentate nuove opportunità per semplificare gli attuali flussi di lavoro liquid-EM utilizzando nuovi strumenti automatizzati e tecnologie adattate dal campo crio-EM. Le applicazioni che coinvolgono la nuova tecnica a sandwich di microchip sono significative rispetto ad altri metodi perché consentono l'analisi di imaging ad alta risoluzione in ghiaccio liquido o vetroso. Uno dei passaggi più critici del protocollo è la produzione di campioni con lo spessore liquido ideale per visualizzare dettagli squisiti a liv...

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Disclosures

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti. L'autrice, Madeline J. Dressel-Dukes, è un dipendente di Protochips, Inc. e Michael Spilman è un dipendente di DirectElectron.

Acknowledgements

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Gli autori riconoscono il Dr. Luk H. Vandenberghe (Harvard Medical School, Dipartimento di Oftalmologia) per aver fornito AAV-3 purificato. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health e dal National Cancer Institute (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700 a D.F.K.).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AcetoneFisher Scientific  A11-1Strumento
di ritaglio per caricatore automaticoThermoFisher ScientificN/AAnche SubAngstrom
fornitore Clip per griglia per caricatori automaticiThermoFisher ScientificN/A clip superiori e inferiori
Griglie EM in oro rivestite di carbonio Microscopiaelettronica ScienzeCF400-AU-50400 mesh, spessore 5 nm
paziente COVID-19RayBiotechCoV-Pos-S-500500 microlitri di siero PCR+
MetanoloFisher Scientific  A412-1
Microchip integrati in micropozzetti daProtochips, Inc.EPB-42A1-10Array di finestre 10x10 mm
TEMWindows microchipSimpore Inc.SN100-A10Q33B9 grandi finestre, 10-nn di spessore
TEMWindows microchipSimpore, Inc.SN100-A05Q33A9 piccole finestre, 5 nm di spessore
Top microchipProtochips, Inc.EPT-50W500 mm x 100 mm finestra
Whatman #1 carta da filtroWhatman1001 090100 pezzi, 90 mm
Attrezzatura  Rivelatore di elettroni diretti
DirectViewElettroneSpaziatura dei pixel di 6 micron
Falcon 3 Rilevatore di elettroni diretti ECThermoFisher ScientificSpaziatura dei pixel di 14 micron
Gatan 655 Stazione di pompaggio a seccoGatan, Inc.  Punta portapompa a 10-6 range
Mark IV VitrobotThermoFisher Scientificdi preparazione campioni all'avanguardia 
PELCO easiGlow, unità di scarica a baglioreTed Pella, Inc.  Modalità a polarità negativa
Poseidon Select portacampioniProtochips, Inc.  Compatibile FEI; portacampioni
Talos F200C TEMThermoFisher Scientific200 kV; Liquid-TEM
Titan Krios G3ThermoFisher Scientific300 kV; Cryo-TEM
strong>Software disponibile gratuitamenteCollegamento al sito webCommenti (opzionale)
cryoSPARChttps://cryosparc.com/altri software di elaborazione delle immagini
CTFFIND4https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4programma di ricerca CTF
MotionCorr2
RELIONhttps://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page
SerialEMhttps://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
UCSF Chimerahttps://www.cgl.ucsf.edu/chimera/software per l'analisi della struttura molecolare
da 1 litro Siero 1 litro diretto unità <https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software pacchetto

References

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