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Articolo metodologico

Misurazione del numero di copie del DNA mitocondriale a singola cellula e dell'eteroplasmia utilizzando la reazione a catena della polimerasi digitale a goccia

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DOI:

10.3791/63870

⸱

12 luglio 2022

 , 
1Department of Clinical Neurosciences, School of Clinical Medicine, University of Cambridge, Cambridge Biomedical Campus, 2Medical Research Council Mitochondrial Biology Unit, University of Cambridge, Cambridge Biomedical Campus

In questo articolo

Sommario

Qui presentiamo un protocollo per misurare il numero assoluto di copie del DNA mitocondriale (mt) e i livelli di eteroplasmia di delezione del mtDNA in singole cellule.

Abstract

Il DNA mitocondriale (mt) dei mammiferi è una piccola molecola di DNA mitocondriale circolare, a doppio filamento, che codifica per 13 subunità della catena di trasporto degli elettroni. A differenza del genoma nucleare diploide, la maggior parte delle cellule contiene molte più copie del mtDNA, che vanno da meno di 100 a oltre 200.000 copie a seconda del tipo di cellula. Il numero di copie del mtDNA è sempre più utilizzato come biomarcatore per una serie di condizioni degenerative e malattie legate all'età e, quindi, la misurazione accurata del numero di copie del mtDNA sta diventando uno strumento chiave sia nella ricerca che nelle impostazioni diagnostiche. Le mutazioni nel mtDNA, che spesso si verificano come polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) o delezioni, possono esistere in tutte le copie del mtDNA all'interno della cellula (chiamate omoplasmia) o come una miscela di copie del mtDNA mutato e WT (definita eteroplasmia). Le mutazioni eteroplasmatiche del mtDNA sono una delle principali cause di patologia mitocondriale clinica, sia nelle malattie rare che in un numero crescente di malattie comuni ad esordio tardivo come il morbo di Parkinson. Determinare il livello di eteroplasmia presente nelle cellule è un passo fondamentale nella diagnosi delle malattie mitocondriali rare e nella ricerca volta a comprendere i disturbi comuni ad esordio tardivo in cui i mitocondri possono svolgere un ruolo. Il numero di copie del mtDNA e l'eteroplasmia sono stati tradizionalmente misurati mediante saggi quantitativi basati sulla (q) PCR o sequenziamento profondo. Tuttavia, la recente introduzione della tecnologia ddPCR ha fornito un metodo alternativo per misurare entrambi i parametri. Offre diversi vantaggi rispetto ai metodi esistenti, tra cui la capacità di misurare il numero assoluto di copie del mtDNA e una sensibilità sufficiente per effettuare misurazioni accurate da singole cellule anche a basso numero di copie. Presentato qui è un protocollo dettagliato che descrive la misurazione del numero di copie del mtDNA in singole cellule usando ddPCR, indicato come droplet generation PCR d'ora in poi, con l'opzione per la misurazione simultanea dell'eteroplasmia in cellule con delezioni del mtDNA. Viene anche discussa la possibilità di espandere questo metodo per misurare l'eteroplasmia in cellule con SNP del mtDNA.

Introduzione

Il DNA mitocondriale (mt) dei mammiferi è un piccolo (circa 16,5 Kb) genoma circolare del DNA residente nella matrice mitocondriale che codifica per 37 geni, comprendenti due rRNA, 22 tRNA e 13 geni codificanti proteine1. A differenza del genoma nucleare, che contiene una (aploide) o due copie (diploidi) di ciascun gene per cellula, il mtDNA è presente in più copie nei mitocondri di ogni cellula, che vanno da decine di copie (ad esempio, spermatociti maturi) a centinaia di migliaia di copie (ad esempio, ovociti)2,3. Una conseguenza di questa natura multi-copia è che le mutazioni nel genoma del mtDNA, che possono esistere come polimorfismi a singolo nucleotide (SNP), delezioni o duplicazioni, possono essere presenti a vari livelli in ogni cellula, costituendo ovunque dallo 0% al 100% della popolazione totale di mtDNA della cellula. L'esistenza di genomi del mtDNA wild-type e mutanti nella stessa cellula è definita eteroplasmia, e le mutazioni del mtDNA eteroplasmatico patogeno sono una delle principali cause di malattia mitocondriale, con diverse sindromi neurologiche comuni legate alle mutazioni eteroplasmatiche del mtDNA sottostante4.

Due parametri chiave che contribuiscono alla probabilità di una mutazione eteroplasmatica del mtDNA che causa la malattia clinica sono il livello di eteroplasmia e il numero di copie del mtDNA. Molte mutazioni eteroplasmatiche mostrano un effetto soglia, con fenotipi biochimici e clinici che diventano evidenti solo al di sopra di un certo livello di eteroplasmia, tipicamente intorno all'80%5, e successivamente peggiorano con l'aumento dell'eteroplasmia4. Tuttavia, è anche importante considerare il numero di copie del mtDNA presenti nella cellula, poiché ciò influenzerà il numero di genomi di mtDNA wild-type (cioè "sani") presenti a un dato livello di eteroplasmia. Studi in pazienti con malattia mitocondriale hanno evidenziato l'importanza di questa interazione tra eteroplasmia e numero di copie5,6, e Filograna et al. hanno recentemente riportato un aumento del numero di copie del mtDNA che allevia i sintomi nonostante l'eteroplasmia invariata in un modello murino di malattia mitocondriale7.

Mentre molto è stato fatto negli ultimi anni per migliorare la comprensione della patogenesi e della trasmissione delle malattie causate dall'eteroplasmia del mtDNA, la maggior parte di questo lavoro è stato condotto a livello di tessuti piuttosto che di cellule, confrontando i livelli medi di eteroplasmia tissutale e le misurazioni del numero di copie acquisite da biopsie tissutali di massa e campioni di sangue. Alcune tecniche consolidate, come la microdissezione a cattura laser, consentono tali misurazioni a livello cellulare 8,9; tuttavia, la recente esplosione dei metodi di analisi a singola cellula ad alto rendimento, o le cosiddette "omiche a singola cellula"10, ha creato un requisito per metodi in grado di misurare con precisione questi parametri cruciali del mtDNA a livello di singola cellula.

Il metodo PCR per la generazione di goccioline sfrutta i recenti progressi nella tecnologia microfluidica per migliorare i metodi esistenti di quantificazione delle concentrazioni di DNA sconosciute tramite l'amplificazione PCR di specifici ampliconi bersaglio nel DNA campione11. A differenza della qPCR, dove il DNA del campione viene amplificato in una singola reazione, con il relativo tasso di accumulo del prodotto PCR che funge da lettura, questo metodo divide il campione iniziale in migliaia di singole goccioline, compartimentando così le molecole di DNA del campione in reazioni spazialmente separate12. La successiva reazione PCR procede in ogni singola goccia, con il prodotto PCR che si accumula solo in goccioline che contengono il DNA bersaglio. Il risultato di questa reazione è un'uscita digitale sotto forma di un pool di goccioline che contengono una copia del DNA bersaglio e del prodotto PCR amplificato o non contengono DNA bersaglio. Utilizzando sonde fluorescenti di DNA o un colorante legante il DNA a doppio filamento (ds), è possibile contare le goccioline contenenti prodotto amplificato e il rapporto tra goccioline "positive" e "negative" può essere utilizzato per calcolare il numero assoluto di copie di DNA presenti nel campione iniziale. Questa misurazione assoluta, al contrario della misura relativa acquisita da una reazione qPCR, è il fattore chiave che consente di utilizzare questa metodologia per la misurazione accurata del numero di copie del mtDNA e dell'eteroplasmia in singole cellule11, e diversi studi recenti hanno già utilizzato la tecnologia PCR per la generazione di goccioline per questo scopo13,14 . Questo articolo presenta un metodo per misurare il numero di copie del mtDNA e l'eteroplasmia da delezione in singole cellule da tessuto umano e murino.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti hanno seguito le linee guida ARRIVE e sono stati approvati dall'Animal Welfare Ethical Review Body (AWERB) dell'Università di Cambridge.

NOTA: Tutte le fasi di preparazione del campione prima della generazione di goccioline devono essere eseguite in un'area di lavoro pulita pre-PCR, idealmente in un armadio sterilizzato UV, ove possibile. Il protocollo qui descritto utilizza specifiche apparecchiature PCR per la generazione di goccioline (vedi Tabella dei materiali) e, sebbene il metodo generale dovrebbe essere applicabile ad altri sistemi, si raccomanda di consultare le linee guida del produttore relative alle concentrazioni di primer / sonda, alle condizioni di ciclo PCR, ecc., In quanto potrebbero differire da quelle descritte qui. Le linee cellulari / cellule primarie utilizzate in questo studio sono state le seguenti: cellule HeLa umane (ottenute commercialmente), cellule umane HEK 293T (ottenute commercialmente), cellule primarie di fibroblasti dermici umani (ottenute dalla Biobanca di Newcastle), cibridi umani (WT & ΔH2.1 delezione15, ottenuta da C. Moraes, Università di Miami), fibroblasti embrionali di topo (immortalizzati, da topi C57Bl / 6, ottenuti da J. Stewart, Università di Newcastle), cellule germinali primordiali di topo (ottenute da embrioni di topo C57Bl/6) e ovociti MII di topo (ottenuti da topi adulti femmina C57Bl/6). Tutte le cellule in coltura sono state mantenute in DMEM ad alto contenuto di glucosio (4,5 g / L) integrato con siero bovino fetale al 10% a 37 ° C con CO2 al 5%. Le cellule primarie di topo utilizzate in questo studio sono state isolate da animali tenuti secondo l'Animal (Scientific Procedures) Act 1986 sotto Home Office Project License P6C97520A.

1. Progettare e sintetizzare set di primer e sonde mirati alle sequenze di DNA di interesse

NOTA: La PCR per la generazione di goccioline può anche essere eseguita utilizzando un colorante legante il dsDNA al posto delle sonde specifiche per ampliconi.

  1. Progettare le sequenze di primer e sonda secondo le linee guida fornite dal produttore del sistema. Le sequenze di primer e sonda convalidate adatte per misurare l'eteroplasmia del numero di copie del mtDNA a singola cellula/eteroplasmia da delezione in entrambe le cellule umane 16,17 e 18 di topo sono fornite nella Tabella 1. Quando si selezionano sequenze di destinazione alternative, considerare i seguenti punti.
    1. Multiplex due set di primer/sonda in un singolo test PCR, ma assicurarsi che i due test utilizzino una sonda marcata FAM e una sonda marcata HEX in modo che gli ampliconi target possano essere differenziati dal lettore di gocce. Questo protocollo presenta un saggio di sonda duplex. Con un'attenta progettazione sperimentale, il multiplexing può essere aumentato fino a quattro target e piattaforme alternative possono ottenere multiplexing di dimensioni più elevate.
    2. Quando si multiplexano set di primer/sonda mirati a sequenze di mtDNA separate, assicurarsi che gli ampliconi generati dai due set di primer non si sovrappongano.
    3. Quando si misura l'eteroplasmia in campioni portatori di delezioni del mtDNA, assicurarsi che un amplicone bersaglio rientri nella regione eliminata prevista e l'altro non rientri nella regione eliminata prevista.
      NOTA: Le condizioni ottimali di ciclo della PCR per i test alternativi possono differire da quelle citate nella fase 5.1; vedere la discussione per ulteriori dettagli sull'ottimizzazione del test.

2. Isolamento del DNA da singole cellule

NOTA: questo metodo può essere utilizzato anche per piccoli campioni di massa fino a 100 celle.

  1. Raccogliere singole cellule utilizzando un metodo appropriato, come il Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)19 o la microdissezione20 a cattura laser, nel minor volume possibile in un recipiente adatto (ad esempio, piastra a 96 pozzetti). L'uso di un colorante di vitalità cellulare prima o durante l'isolamento di singole cellule ridurrà al minimo la probabilità di isolare le cellule morte. Se lo si desidera, ordinare le singole cellule direttamente nel tampone di lisi e conservare a -80 °C (fino a 6 mesi) prima dell'analisi.
  2. Lisare le cellule in un piccolo volume (<10 μL) di un tampone di lisi adatto (il tampone utilizzato in questo studio è descritto nella fase 2.2.1.).
    NOTA: Tutti i dati ottenuti dalle cellule in questo studio provengono da lisati unicellulari o pool di 20 cellule (le dimensioni del campione sono stabilite nelle legende delle figure). La formazione efficiente di un'emulsione olio/goccioline durante la fase di generazione delle goccioline del protocollo PCR di generazione di goccioline può essere significativamente influenzata dalla presenza di detergenti nel campione; Pertanto, si raccomanda di convalidare la compatibilità di tutti i tamponi di lisi cellulare con la generazione di goccioline alla concentrazione di ingresso prevista prima di procedere con campioni sperimentali e utilizzando il più piccolo volume pratico di tampone di lisi. Il seguente protocollo di lisi comporta un impatto minimo sull'efficienza di generazione delle goccioline.
    1. Preparare il tampone di lisi contenente 50 mM di Tris-HCl pH 8,3, 1% TWEEN-20 e 200 μg/mL di proteinasi K.
    2. Aggiungere 2,5 μL di tampone di lisi a ciascun campione, sigillare la piastra con un sigillo adesivo e quindi centrifugare i campioni a 1.000 x g per 1 minuto a 4 °C.
    3. Incubare i campioni a 37 °C per 30 minuti sul termociclatore con il coperchio riscaldato impostato a 105 °C per evitare la condensa del liquido sul coperchio della piastra.
    4. Aggiungere 7,5 μL di acqua priva di nucleasi a ciascun campione per ottenere un volume finale del campione di 10 μL, sigillare nuovamente la piastra e quindi centrifugare i campioni a 1.000 x g per 1 minuto a 4 °C.
    5. Incubare sul termociclatore a 80 °C per 15 minuti (coperchio riscaldato impostato a 105 °C) per inattivare la proteinasi K.
    6. Centrifugare i campioni a 1.000 x g per 1 minuto a 4 °C e poi conservare in ghiaccio.
  3. Procedere al passaggio 3 riportato di seguito.
    NOTA: I lisati cellulari possono essere conservati a -20 °C prima di continuare con il punto 3; tuttavia, utilizzare DNA appena eluito, ove possibile, per eliminare il rischio di cicli di congelamento-scongelamento con conseguente degradazione del DNA.

3. Preparazione dei campioni

NOTA: assicurarsi che le repliche tecniche dei campioni e dei controlli non modello (NTC) siano incluse su ciascuna piastra di analisi per garantire l'accuratezza dei risultati. La gamma dinamica del test PCR di generazione di goccioline è fino a 120.000 copie dell'amplicone target per reazione. Per i lisati di campioni a singola cellula o a piccole cellule sfuse, è improbabile che sia necessaria la diluizione e la miscela di lisato può essere immessa direttamente nella reazione per la misurazione del numero di copie del mtDNA (ad esempio, un campione di lisato di 10 μL può essere diviso ed eseguito in triplice copia con 3 μL di input direttamente in ciascun test). Tuttavia, l'uso di lisato non diluito da cellule con numeri di mtDNA molto elevati (ad esempio, ovociti) o contenenti un numero maggiore di cellule (ad esempio, 50-100) può superare questo intervallo dinamico. In tali casi, è necessaria una diluizione seriale iniziale per identificare un fattore di diluizione appropriato che eviti la saturazione del test per quel tipo specifico di cellula/numero di cellule (vedere Risultati rappresentativi per ulteriori dettagli).

  1. Scongelare tutti i reagenti su ghiaccio, vortice e centrifugarli brevemente prima dell'uso.
  2. Preparare la miscela madre (meno il DNA campione) su ghiaccio come descritto in (Tabella 2).
    NOTA: Se viene misurato un solo amplicone target, aggiungere altri 2,55 μL di acqua priva di nucleasi per campione per ottenere il volume finale di 22 μL. Preparare una miscela master sufficiente per il numero di campioni e NTC da analizzare, oltre a una quantità sufficiente per tenere conto di eventuali pozzetti "vuoti" richiesti sulla piastra PCR per la generazione di goccioline (vedere il passaggio successivo).
  3. Vortice la miscela master preparata brevemente per miscelare e aliquotare il volume richiesto (22 μL meno il volume di DNA di ingresso) in ciascun pozzetto di una piastra di generazione di goccioline PCR a 96 pozzetti. Disporre i campioni in colonne complete sulla piastra a 96 pozzetti; riempire eventuali pozzetti vuoti in colonne incomplete con master mix e usarli come NTC.
  4. Aggiungere il DNA in ingresso a ciascun pozzetto campione e tampone acqua/eluizione privo di nucleasi ai pozzetti NTC per portare il volume totale di ciascuno fino a 22 μL.
  5. Sigillare la piastra con un sigillo adesivo e posizionare su uno shaker a 2.000 giri/min per 1 minuto, quindi centrifugare a 1.000 x g per un minuto a 4 °C.
  6. Posizionare il piatto sul ghiaccio e procedere al passaggio 4.
    NOTA: Le piastre preparate possono essere conservate su ghiaccio e protette dalla luce per brevi periodi di tempo (ad esempio, 1-2 ore) prima di procedere con la generazione di goccioline.

4. Generazione di goccioline

NOTA: fare riferimento alla Figura 1A per lo schema del ponte strumenti del generatore di gocce a cui si fa riferimento in questa sezione.

  1. Accendere il generatore di gocce.
  2. Controllare che una bottiglia di olio generatore di goccioline sia caricata nella posizione E del piano strumenti. Se richiesto, seguire le istruzioni visualizzate per sostituire il flacone.
  3. Fare clic su Configura piastra campione sul touchscreen. Selezionare tutte le colonne sulla piastra campione che contengono campioni/spazi vuoti.
    NOTA: l'immissione del nome della targa e dei dettagli dell'esperimento in questo passaggio è facoltativa e non è necessaria per continuare la configurazione dell'esperimento.
  4. Fare clic su OK per confermare la configurazione della piastra; Le luci arancioni si illumineranno sul ponte strumenti per indicare le posizioni in cui è necessario caricare i materiali di consumo.
  5. Caricare le cartucce del generatore di gocce nella posizione B sul piano strumenti in modo che tutte le luci diventino verdi.
  6. Posizionare un trogolo di scarico della punta vuota nella posizione C sul piano strumenti.
  7. Rimuovere i coperchi dalle scatole dei puntafiltri e caricare nella posizione D sul palco dello strumento in modo che tutte le luci diventino verdi.
  8. Rimuovere il sigillo della piastra adesiva dalla piastra campione e caricare nella posizione F del ponte strumenti in modo che la luce diventi verde.
  9. Posizionare una piastra vuota da 96 pozzetti di raccolta delle gocce in un blocco freddo (pre-raffreddato a -20 °C) e caricare nella posizione G del piano strumenti in modo che la luce diventi verde.
  10. Fare clic su Avvia generazione goccioline sul touch screen dello strumento.
  11. Fare clic su Avvia corsa sul touch screen dello strumento. Il coperchio dello strumento si chiuderà automaticamente. Dopo l'inizializzazione, il tempo rimanente fino al completamento della generazione delle gocce verrà visualizzato sul touch screen dello strumento.
  12. Una volta completata la generazione delle gocce, controllare visivamente la piastra di raccolta del campione per confermare che uno strato di emulsione di gocce sia presente sopra la fase oleosa in ciascun pozzetto (Figura 1B).
    NOTA: se uno strato di emulsione di gocce non è visibile, non procedere ulteriormente con l'esperimento e verificare eventuali errori che potrebbero essersi verificati durante i passaggi precedenti del protocollo.
  13. Eliminare i materiali di consumo usati dal piano strumenti e svuotare la mangiatoia di scarico della punta.
  14. Accendere la sigillatrice a piastre, impostare la temperatura a 180 °C e il tempo di tenuta a 5 s e consentire alla macchina di raggiungere la temperatura di esercizio.
  15. Inserire la piastra di raccolta del campione nel portapiastre sigillante e posizionare un sigillo di alluminio fresco sulla parte superiore della piastra con la linea rossa rivolta verso l'alto. Fare attenzione a non toccare la parte inferiore del sigillo di alluminio.
    NOTA: Il portapiastre deve essere conservato a temperatura ambiente (RT) e collocato nel cassetto della sigillatrice delle piastre solo quando viene applicato un sigillo di alluminio per impedire il trasferimento di calore alla piastra di raccolta del campione.
  16. Quando la sigillatrice di piastre ha raggiunto la temperatura di esercizio, premere Eject sul touchscreen dello strumento; Il cassetto si aprirà automaticamente.
  17. Posizionare il portapiastre nel cassetto della sigillatrice e premere Sigilla. Il cassetto si chiuderà automaticamente e poi si riaprirà una volta completata la sigillatura.
  18. Riposizionare la piastra sigillata sul blocco freddo, spegnere la sigillatrice e procedere immediatamente al passaggio 5.
    NOTA: In questa fase, le goccioline sono instabili, quindi assicurarsi che la fase PCR sia iniziata entro 1 ora dalla fine della generazione delle goccioline.

5. PCR

  1. Posizionare la piastra di raccolta delle gocce sigillata su un ciclatore PCR dotato di un blocco di pozzetti profondi 96 ed eseguire il protocollo di ciclo termico descritto nella Tabella 3.
    NOTA: Impostare la temperatura del coperchio riscaldato a 105 °C e il volume del campione a 40 μL. Le fasi di denaturazione e ricottura/estensione devono includere una velocità di rampa di temperatura di 2 °C/s per garantire che l'olio abbia il tempo di equilibrarsi alla temperatura corretta.
  2. Procedere al passaggio 6.
    NOTA: Una volta completato il protocollo di ciclo termico, le goccioline sono più stabili e la piastra può essere conservata fino a 4 giorni a 4 °C prima di procedere con la fase successiva.

6. Lettura delle goccioline

  1. Accendere il lettore di gocce e il computer collegato.
  2. Controllare i livelli dei liquidi nell'olio del lettore di gocce e nelle bottiglie di scarto del lettore di gocce e riempirli / svuotarli, rispettivamente, se necessario.
  3. Caricare la piastra contenente i campioni post-PCR nel supporto della piastra del lettore di gocce, posizionare il coperchio sopra il supporto e fissarlo in posizione con le clip di bloccaggio nere. Non rimuovere il coperchio di alluminio dalla piastra del campione.
  4. Premere il pulsante Apri/Chiudi sul coperchio del lettore di gocce per aprirlo.
  5. Caricare il supporto della piastra del lettore di gocce contenente la piastra campione nella camera del lettore e posizionarlo saldamente sulla base magnetica.
  6. Premere il pulsante Apri/Chiudi sul coperchio del lettore di gocce per chiuderlo.
  7. Aprire l'interfaccia del software di analisi, selezionare la scheda Aggiungi piastra e preparare una nuova piastra campione come segue:
    1. Fare clic su Aggiungi piastra (Add Plate ), quindi su Configura piastra.
    2. Nella scheda Informazioni piastra immettere un Nome targa, selezionare Supermix for Probes (no dUTP) dal menu a discesa Supermix e immettere un nome file in Salva file di dati con nome.
    3. Nella scheda Selezione pozzi evidenziare i pozzi da analizzare e fare clic su Includi pozzi selezionati.
      NOTA: i passaggi da 6.7.4 a 6.7.7 sono facoltativi.
    4. Nella scheda Informazioni pozzo , selezionare i pozzi da annotare.
      NOTA: fare riferimento alla Figura 1D per un esempio dell'interfaccia della scheda Informazioni pozzo .
    5. Selezionare Quantificazione diretta (DQ) dal menu a discesa Tipo esperimento , popolare le caselle Descrizione campione, Tipo campione e Nome destinazione e aggiungere Note pozzo e/o Note piastra in base alle esigenze.
    6. Fare clic su Applica. Le informazioni nei campi saranno applicate ai pozzi selezionati.
    7. Ripetere i passaggi 6.7.4–6.7.6 fino a quando tutti i pozzetti campione sono stati annotati.
  8. Una volta completata la configurazione della piastra, fare clic su Avvia corsa.
  9. Al termine della corsa, scartare la piastra di campionamento vuota e svuotare la bottiglia di scarto del lettore di gocce, se necessario.
  10. Procedere al passaggio 7.

7. Analisi dei risultati

NOTA: Il lettore di gocce misura l'intensità della fluorescenza nel canale FAM e HEX per ogni goccia in un campione. In un test di successo, le goccioline rientrano in una delle due categorie per ogni sonda: Negativo (nel senso che il bersaglio non era presente nella goccia) o Positivo (nel senso che il bersaglio era presente nella goccia). Prima di analizzare i campioni, assicurarsi che ogni pozzetto contenga >10.000 goccioline e abbia due popolazioni chiaramente separate di goccioline a bassa fluorescenza (negativa) e alta fluorescenza (positive) in ciascun canale (Figura 2A).

  1. Selezionare la scheda Analisi dati e aprire il file da analizzare dal menu I miei file di dati .
  2. Fare clic sulla scheda Ampiezza 1D per gli esperimenti a un colore o sulla scheda Ampiezza 2D per gli esperimenti a due colori.
  3. Applicare una soglia di fluorescenza a ciascun canale per differenziare le goccioline positive e negative. Il software di analisi tenterà di applicare una soglia automatica campione per campione e canale per canale, ma se questo sembra non essere riuscito o sembra impreciso, applicare manualmente la soglia come segue:
    1. Selezionare i pozzi che richiedono la soglia.
    2. Applicate manualmente la soglia nello spazio libero tra la popolazione positiva e quella negativa sul grafico di ampiezza utilizzando lo strumento Modalità linea soglia . Quando si impostano le soglie manuali nella vista 2D, assicurarsi che il mirino sia posizionato in modo che le quattro popolazioni di goccioline (doppio negativo, singolo positivo FAM, singolo positivo HEX e doppio positivo) siano chiaramente separate.
      NOTA: la soglia può essere eseguita bene per bene o applicata a più pozzi contemporaneamente.
  4. Una volta applicata una soglia a tutti i campioni, esportare i risultati come file .csv per ulteriori analisi facendo clic sulla scheda Tabella dati, facendo clic su Importa/ Esporta e selezionando Esporta dati visibili in CSV. Immettere un nome file adatto e fare clic su Salva.
  5. Calcolare il numero di copie del mtDNA nel campione iniziale come segue:
    Numero di copie = concentrazione target di mtDNA × 22 × 1/frazione dell'input totale di lisato
    NOTA: Se vengono utilizzate due sonde mitocondriali, la concentrazione dei due bersagli viene mediata prima di effettuare il calcolo. Per i campioni contenenti più di una cella, il numero di copie per cella viene calcolato dividendo per il numero di celle nel campione. È importante utilizzare il valore di "Concentrazione" (cioè il numero di copie per microlitro) moltiplicato per il volume iniziale del campione di 22 μL, piuttosto che il valore "Copie per 20 μL" calcolato nel file .csv, poiché le copie del mtDNA lasciate nell'eccedenza di 2 μL richiesta dal generatore di goccioline devono essere prese in considerazione nel calcolo del numero assoluto di copie del campione iniziale.
  6. Per le cellule portatrici di delezioni eteroplasmatiche del mtDNA, calcolare il numero di copie utilizzando i risultati del bersaglio del mtDNA al di fuori della regione eliminata (cioè, il bersaglio presente in entrambe le molecole di mtDNA cancellate e WT). L'eteroplasmia da delezione viene calcolata utilizzando le concentrazioni del bersaglio all'interno della regione eliminata e del bersaglio al di fuori della regione eliminata come segue:
    figure-protocol-1

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Risultati

Dopo la generazione di goccioline, è visibile uno strato trasparente di goccioline opache che galleggiano sopra la fase oleosa in ciascun pozzetto (Figura 1B). La formazione di goccioline può essere influenzata negativamente dalla presenza di detergenti nel lisato di input quando si eseguono esperimenti su singole cellule. Utilizzando il protocollo di lisi descritto al punto 2.1.2., si ottengono regolarmente rese di goccioline superiori al livello raccomandato di 10.000, nonostante la presen...

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Discussione

Il protocollo qui descritto è applicabile a un'ampia gamma di tipi e specie cellulari oltre a quelli discussi sopra, sebbene un'attenta ottimizzazione dei nuovi progetti di analisi sarà fondamentale per garantire che l'accuratezza e la ripetibilità del metodo siano mantenute quando ci si allontana dalle combinazioni primer/sonda precedentemente convalidate. Quando si lavora con singole cellule è fondamentale garantire che la raccolta dei campioni venga eseguita nel modo più accurato possibile (ad esempio, utilizzando rig...

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Dichiarazioni

Nessun conflitto di interessi da divulgare.

Ringraziamenti

Grazie al Dr. L Bozhilova per i consigli sull'analisi statistica dei dati PCR di generazione di goccioline. Grazie al Dr. H Zhang per aver fornito gli ovociti utilizzati per generare i dati nella Figura 3C e nella Figura 4B. Questo lavoro è stato svolto da SPB presso la Medical Research Council Mitochondrial Biology Unit (MC_UU_00015/9), Università di Cambridge, e finanziato da una Wellcome Trust Principal Research Fellowship detenuta da PFC (212219/Z/18/Z).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Soluzione Tween-20 al 50%Novex3005
Olio automatizzato per la generazione di goccioline Bio Rad1864110Formulazione di olio commerciale utilizzata per generare l'emulsione olio/goccioline (utilizzata nella fase 4.1 del protocollo)
Macchina per PCR C1000 con blocco a pozzetti profondiBio Rad1851197termociclatore per PCR dotato di un blocco riscaldante a pozzetti profondi, utilizzato per la lisi cellulare (fase del protocollo 2.1.2.) e il ciclo PCR (fase 5 del protocollo)
Blocco di raffreddamento della piastra di raccoltaBio Rad12002819Blocco di raffreddamento che mantiene i campioni refrigerati durante la generazione di goccioline (utilizzato nella fase 4.3 del protocollo)
piastre ddPCR a 96 pozzetti Puntali perpipette a 96 pozzetti Bio Rad 12001925 progettati per l'uso nel generatore di gocce QX200 AutoDG, utilizzati per la preparazione del campione (fase del protocollo 3.4) e la raccolta delle goccioline (fase del protocollo 4.3)
olio per lettore di gocce ddPCR Bio Rad1863004Formulazione commerciale dell'olio utilizzata dal lettore di gocce (utilizzata nella fase del protocollo 6.1)
ddPCR Supermix per sonde (senza dUTP)Bio Rad1863023Supermiscela commerciale per l'uso in esperimenti ddPCR che utilizzano sonde (utilizzate nella fase del protocollo 3.3)
Cartucce per generatori di gocce automatizzati DG32 Bio Rad1864108Cartucce microfluidiche utilizzate nel generatore di gocce QX200 AutoDG per generare l'emulsione olio/goccioline (utilizzato nel passaggio del protocollo 4.3)
Siero fetale bovinoGibco10270-106Siero fetale bovino qualificato
Copri piastre in lamina Bio Rad1814040Coperchi per piastre in lamina utilizzati per sigillare le piastre di raccolta delle goccioline dopo la generazione di goccioline (utilizzati nella fase 4.6 del protocollo)
Cellule HEK 293TTakara632180Subclone commerciale della linea cellulare di rene embrionale umano trasformato, HEK 293, che esprime le cellule HeLa dell'antigene SV40 Large-T
ECACC93021013Cellule di carcinoma epiteloide della cervice umana
DMEM Gibco ad alto glucosio133453644,5 g/L di D-glucosio, con L-glutammina e piruvato di sodio
Cibridi umaniUniversità di Miami
Fibroblasti embrionali di topo.Università di NewcastleImmortalato da topi C57Bl/6
Contenitore di raccolta monouso utilizzato per raccogliere i puntali scartati nel generatore di gocce QX200 AutoDG (utilizzato nel passaggio 4.3 del protocollo)
Puntali per pipette per sistema AutoDG Bio Rad1864120Puntali per pipette filtrati progettati per l'uso nel generatore di gocce QX200 AutoDG (utilizzato nella fase 4.3 del protocollo)
Cellule primarie di fibroblasti dermici umaniNewcastle Biobank
Primer/SondeIDTN/ALe sequenze esatte di primer/sonda dipenderanno dal saggio. I primer e le sonde utilizzati in questo studio sono riportati nella Tabella 1
Soluzione di proteinasi K 20 mg/mLAmbionAM2546
PX1 Sigillante per piastre PCRBio Rad1814000Applica i sigilli in alluminio alle piastre dei campioni ddPCR dopo la generazione di goccioline (utilizzato nel passaggio del protocollo 4.6)
Software QX Managerdel lettore di gocce Bio Rad12012172utilizzato nei passaggi 6 e 7 del protocollo)
Generatore di gocce QX200 AutoDGBio Rad1864101Generatore di gocce microfluidiche automatizzato (utilizzato nel passaggio del protocollo 4)
Lettore di gocce QX200Bio Rad1864003Lettore di gocce (utilizzato nel passaggio 6 del protocollo)
Cristalli preimpostati Trizma pH 8,3SigmaT8943-100G
Acqua priva di nucleasi Ambion AM9937 Guarnizioni per piastre PCR Pierce SP-0027 Guarnizioni per piastre adesive trasparenti, utilizzate solo per la generazione di pre-goccioline (la guarnizione in alluminio deve essere utilizzata nel passaggio 4.6)Contenitori per rifiuti con punta in pipetta Bio Rad 1864125 Software di configurazione e analisi (

Riferimenti

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