Qui presentiamo un protocollo per misurare il numero assoluto di copie del DNA mitocondriale (mt) e i livelli di eteroplasmia di delezione del mtDNA in singole cellule.
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Articolo metodologico
Misurazione del numero di copie del DNA mitocondriale a singola cellula e dell'eteroplasmia utilizzando la reazione a catena della polimerasi digitale a goccia
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il DNA mitocondriale (mt) dei mammiferi è una piccola molecola di DNA mitocondriale circolare, a doppio filamento, che codifica per 13 subunità della catena di trasporto degli elettroni. A differenza del genoma nucleare diploide, la maggior parte delle cellule contiene molte più copie del mtDNA, che vanno da meno di 100 a oltre 200.000 copie a seconda del tipo di cellula. Il numero di copie del mtDNA è sempre più utilizzato come biomarcatore per una serie di condizioni degenerative e malattie legate all'età e, quindi, la misurazione accurata del numero di copie del mtDNA sta diventando uno strumento chiave sia nella ricerca che nelle impostazioni diagnostiche. Le mutazioni nel mtDNA, che spesso si verificano come polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) o delezioni, possono esistere in tutte le copie del mtDNA all'interno della cellula (chiamate omoplasmia) o come una miscela di copie del mtDNA mutato e WT (definita eteroplasmia). Le mutazioni eteroplasmatiche del mtDNA sono una delle principali cause di patologia mitocondriale clinica, sia nelle malattie rare che in un numero crescente di malattie comuni ad esordio tardivo come il morbo di Parkinson. Determinare il livello di eteroplasmia presente nelle cellule è un passo fondamentale nella diagnosi delle malattie mitocondriali rare e nella ricerca volta a comprendere i disturbi comuni ad esordio tardivo in cui i mitocondri possono svolgere un ruolo. Il numero di copie del mtDNA e l'eteroplasmia sono stati tradizionalmente misurati mediante saggi quantitativi basati sulla (q) PCR o sequenziamento profondo. Tuttavia, la recente introduzione della tecnologia ddPCR ha fornito un metodo alternativo per misurare entrambi i parametri. Offre diversi vantaggi rispetto ai metodi esistenti, tra cui la capacità di misurare il numero assoluto di copie del mtDNA e una sensibilità sufficiente per effettuare misurazioni accurate da singole cellule anche a basso numero di copie. Presentato qui è un protocollo dettagliato che descrive la misurazione del numero di copie del mtDNA in singole cellule usando ddPCR, indicato come droplet generation PCR d'ora in poi, con l'opzione per la misurazione simultanea dell'eteroplasmia in cellule con delezioni del mtDNA. Viene anche discussa la possibilità di espandere questo metodo per misurare l'eteroplasmia in cellule con SNP del mtDNA.
Introduzione
Il DNA mitocondriale (mt) dei mammiferi è un piccolo (circa 16,5 Kb) genoma circolare del DNA residente nella matrice mitocondriale che codifica per 37 geni, comprendenti due rRNA, 22 tRNA e 13 geni codificanti proteine1. A differenza del genoma nucleare, che contiene una (aploide) o due copie (diploidi) di ciascun gene per cellula, il mtDNA è presente in più copie nei mitocondri di ogni cellula, che vanno da decine di copie (ad esempio, spermatociti maturi) a centinaia di migliaia di copie (ad esempio, ovociti)2,3. Una conseguenza di questa natura multi-copia è che le mutazioni nel gen....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti hanno seguito le linee guida ARRIVE e sono stati approvati dall'Animal Welfare Ethical Review Body (AWERB) dell'Università di Cambridge.
NOTA: Tutte le fasi di preparazione del campione prima della generazione di goccioline devono essere eseguite in un'area di lavoro pulita pre-PCR, idealmente in un armadio sterilizzato UV, ove possibile. Il protocollo qui descritto utilizza specifiche apparecchiature PCR per la generazione di goccioline (vedi Tabella dei materiali) e, sebbene il metodo generale dovrebbe essere applicabile ad altri sistemi, si raccomanda di consultare le linee guida del produttore rela....
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Risultati
Dopo la generazione di goccioline, è visibile uno strato trasparente di goccioline opache che galleggiano sopra la fase oleosa in ciascun pozzetto (Figura 1B). La formazione di goccioline può essere influenzata negativamente dalla presenza di detergenti nel lisato di input quando si eseguono esperimenti su singole cellule. Utilizzando il protocollo di lisi descritto al punto 2.1.2., si ottengono regolarmente rese di goccioline superiori al livello raccomandato di 10.000, nonostante la presen.......
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Discussione
Il protocollo qui descritto è applicabile a un'ampia gamma di tipi e specie cellulari oltre a quelli discussi sopra, sebbene un'attenta ottimizzazione dei nuovi progetti di analisi sarà fondamentale per garantire che l'accuratezza e la ripetibilità del metodo siano mantenute quando ci si allontana dalle combinazioni primer/sonda precedentemente convalidate. Quando si lavora con singole cellule è fondamentale garantire che la raccolta dei campioni venga eseguita nel modo più accurato possibile (ad esempio, utilizzando rig.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi da divulgare.
Ringraziamenti
Grazie al Dr. L Bozhilova per i consigli sull'analisi statistica dei dati PCR di generazione di goccioline. Grazie al Dr. H Zhang per aver fornito gli ovociti utilizzati per generare i dati nella Figura 3C e nella Figura 4B. Questo lavoro è stato svolto da SPB presso la Medical Research Council Mitochondrial Biology Unit (MC_UU_00015/9), Università di Cambridge, e finanziato da una Wellcome Trust Principal Research Fellowship detenuta da PFC (212219/Z/18/Z).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione Tween-20 al 50% | Novex | 3005 | |
| Olio automatizzato per la generazione di goccioline | Bio Rad | 1864110 | Formulazione di olio commerciale utilizzata per generare l'emulsione olio/goccioline (utilizzata nella fase 4.1 del protocollo) |
| Macchina per PCR C1000 con blocco a pozzetti profondi | Bio Rad | 1851197 | termociclatore per PCR dotato di un blocco riscaldante a pozzetti profondi, utilizzato per la lisi cellulare (fase del protocollo 2.1.2.) e il ciclo PCR (fase 5 del protocollo) |
| Blocco di raffreddamento della piastra di raccolta | Bio Rad | 12002819 | Blocco di raffreddamento che mantiene i campioni refrigerati durante la generazione di goccioline (utilizzato nella fase 4.3 del protocollo) |
| piastre ddPCR a 96 pozzetti | Puntali per | pipette a 96 pozzetti Bio Rad 12001925 progettati per l'uso nel generatore di gocce QX200 AutoDG, utilizzati per la preparazione del campione (fase del protocollo 3.4) e la raccolta delle goccioline (fase del protocollo 4.3) | |
| olio per lettore di gocce ddPCR | Bio Rad | 1863004 | Formulazione commerciale dell'olio utilizzata dal lettore di gocce (utilizzata nella fase del protocollo 6.1) |
| ddPCR Supermix per sonde (senza dUTP) | Bio Rad | 1863023 | Supermiscela commerciale per l'uso in esperimenti ddPCR che utilizzano sonde (utilizzate nella fase del protocollo 3.3) |
| Cartucce per generatori di gocce automatizzati DG32 | Bio Rad | 1864108 | Cartucce microfluidiche utilizzate nel generatore di gocce QX200 AutoDG per generare l'emulsione olio/goccioline (utilizzato nel passaggio del protocollo 4.3) |
| Siero fetale bovino | Gibco | 10270-106 | Siero fetale bovino qualificato |
| Copri piastre in lamina | Bio Rad | 1814040 | Coperchi per piastre in lamina utilizzati per sigillare le piastre di raccolta delle goccioline dopo la generazione di goccioline (utilizzati nella fase 4.6 del protocollo) |
| Cellule HEK 293T | Takara | 632180 | Subclone commerciale della linea cellulare di rene embrionale umano trasformato, HEK 293, che esprime le cellule HeLa dell'antigene SV40 Large-T |
| ECACC | 93021013 | Cellule di carcinoma epiteloide della cervice umana | |
| DMEM Gibco ad alto glucosio | 13345364 | 4,5 g/L di D-glucosio, con L-glutammina e piruvato di sodio | |
| Cibridi umani | Università di Miami | ||
| Fibroblasti embrionali di topo. | Università di Newcastle | Immortalato da topi C57Bl/6 | |
| Contenitore di raccolta monouso utilizzato per raccogliere i puntali scartati nel generatore di gocce QX200 AutoDG (utilizzato nel passaggio 4.3 del protocollo) | |||
| Puntali per pipette per sistema AutoDG | Bio Rad | 1864120 | Puntali per pipette filtrati progettati per l'uso nel generatore di gocce QX200 AutoDG (utilizzato nella fase 4.3 del protocollo) |
| Cellule primarie di fibroblasti dermici umani | Newcastle Biobank | ||
| Primer/Sonde | IDT | N/A | Le sequenze esatte di primer/sonda dipenderanno dal saggio. I primer e le sonde utilizzati in questo studio sono riportati nella Tabella 1 |
| Soluzione di proteinasi K 20 mg/mL | Ambion | AM2546 | |
| PX1 Sigillante per piastre PCR | Bio Rad | 1814000 | Applica i sigilli in alluminio alle piastre dei campioni ddPCR dopo la generazione di goccioline (utilizzato nel passaggio del protocollo 4.6) |
| Software QX Manager | del lettore di gocce Bio Rad | 12012172 | utilizzato nei passaggi 6 e 7 del protocollo) |
| Generatore di gocce QX200 AutoDG | Bio Rad | 1864101 | Generatore di gocce microfluidiche automatizzato (utilizzato nel passaggio del protocollo 4) |
| Lettore di gocce QX200 | Bio Rad | 1864003 | Lettore di gocce (utilizzato nel passaggio 6 del protocollo) |
| Cristalli preimpostati Trizma pH 8,3 | Sigma | T8943-100G |
Riferimenti
- Taanman, J. W. The mitochondrial genome: structure, transcription, translation and replication. Biochimica Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).
- Wai, T., et al. The role of mitochondrial DNA copy number in mammalian fertility.
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Ristampe e permessi
