Le settine sono proteine citoscheletriche. Interagiscono con le membrane lipidiche e possono percepire ma anche generare curvatura della membrana su scala micron. Descriviamo in questo protocollo metodologie bottom-up in vitro per l'analisi delle deformazioni della membrana, del legame della settina sensibile alla curvatura e dell'ultrastruttura del filamento di settino.
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Articolo metodologico
Metodi in vitro bottom-up per saggiare l'organizzazione ultrastrutturale, il rimodellamento della membrana e il comportamento di sensibilità alla curvatura delle settine
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il rimodellamento della membrana avviene costantemente a livello della membrana plasmatica e all'interno degli organelli cellulari. Per analizzare completamente il ruolo dell'ambiente (condizioni ioniche, composizioni proteiche e lipidiche, curvatura della membrana) e dei diversi partner associati a specifici processi di rimodellamento della membrana, intraprendiamo approcci bottom-up in vitro . Negli ultimi anni, c'è stato un vivo interesse nel rivelare il ruolo delle proteine della settina associate alle principali malattie. Le settine sono proteine citoscheletriche essenziali e ubiquitarie che interagiscono con la membrana plasmatica. Sono implicati nella divisione cellulare, nella motilità cellulare, nella neuro-morfogenesi e nella spermiogenesi, tra le altre funzioni. È quindi importante capire come le settine interagiscono e si organizzano a livello delle membrane per indurre successivamente deformazioni di membrana e come possono essere sensibili a specifiche curvature di membrana. Questo articolo mira a decifrare l'interazione tra l'ultra-struttura delle settine a livello molecolare e il rimodellamento della membrana che avviene su scala micron. A tal fine, il lievito in erba e i complessi di septina dei mammiferi sono stati espressi e purificati in modo ricombinante. Una combinazione di saggi in vitro è stata quindi utilizzata per analizzare l'autoassemblaggio delle settine sulla membrana. Sono stati utilizzati doppi strati lipidici supportati (SLB), vescicole unilamellari giganti (GUV), grandi vescicole unilamellari (LUV) e substrati ondulati per studiare l'interazione tra auto-assemblaggio della settina, rimodellamento della membrana e curvatura della membrana.
Introduzione
Le settine sono proteine che formano filamenti citoscheletrici che interagiscono con le membrane lipidiche. Le settine sono onnipresenti negli eucarioti ed essenziali per numerose funzioni cellulari. Sono stati identificati come i principali regolatori della divisione cellulare nei lieviti in erba e nei mammiferi 1,2. Sono coinvolti negli eventi di rimodellamento della membrana, nella ciliogenesi3 e nella spermiogenesi4. All'interno delle cellule di mammifero, le settine possono anche interagire con actina e microtubuli 5....
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Protocollo
1. Determinazione del rimodellamento della membrana mediante vescicole unilamellari giganti (GUV)
NOTA: In questa sezione, i GUV sono generati per imitare le deformazioni della membrana eventualmente indotte dalle settine in un contesto cellulare. Infatti, nelle cellule, le settine si trovano frequentemente in siti con curvature micrometriche. I GUV hanno dimensioni che vanno da pochi a decine di micrometri e possono essere deformati. Sono quindi appropriati per dosare qualsiasi deformazione indotta dalla settina su scala micrometrica. I lipidi fluorescenti, così come le settine marcate con fluorescenza (utilizzando la protei....
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Risultati
Deformazioni dei GUV
Le tipiche immagini di fluorescenza confocale dei GUV rimodellati dopo essere stati incubati con settine sono visualizzate nella Figura 3, in condizioni in cui le settine polimerizzano. I GUV nudi (Figura 3A) erano perfettamente sferici. Dopo l'incubazione con più di 50 filamenti di settina di lievito in erba nM, le vescicole apparivano deformate. Fino a una concentrazione di ottameri settini di lievito in erba 100 nM, le.......
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Discussione
Come detto sopra, è stata utilizzata una miscela lipidica che migliora l'incorporazione di PI(4,5)P2 all'interno del doppio strato lipidico e quindi facilita le interazioni settina-membrana. In effetti, abbiamo dimostrato altrove25 che le settine di lievito in erba interagiscono con le vescicole in modo PI(4,5)P2-specifico. Questa composizione lipidica è stata regolata empiricamente dallo screening di composizioni multiple ed è ora ampiamente utilizzata dagli autori. I lipidi.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Ringraziamo Patricia Bassereau e Daniel Lévy per i loro utili consigli e discussioni. Questo lavoro ha beneficiato del sostegno dell'ANR (Agence Nationale de la Recherche) per il finanziamento del progetto "SEPTIME", ANR-13-JSV8-0002-01, ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014, e del progetto "SEPTSCORT", ANR-20-CE11-0014-01. B. Chauvin è finanziato dall'Ecole Doctorale "ED564: Physique en Ile de France" e dalla Fondation pour lea Recherche Médicale. K. Nakazawa è stato sostenuto dalla Sorbonne Université (AAP Emergence). G.H. Koenderink è stato sostenuto dalla Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO/OCW) attraverso il "BaSyC-Building a Synthetic Cell". So....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids 840035 | ||
| Bagno, Sonicatore | Elma | Elmasonic S10H | |
| Bodipy-TR-Ceramide | Thermo Fischer scientific | 11504726 | |
| Sostanze chimiche: NaCl, Tris-HCl, saccarosio, KCl, MgCl2, B-caseina, cloroformio, cacodilato di sodio, acido tannico, etanolo | Sigma Aldrich | ||
| Microscopio confocale | nikon | disco rotante o confocale | |
| Essiccatore a punti critici | Leica microsystems | CPD300 | |
| Generatore di acqua deionizzata | MilliQ | F1CA38083B | MilliQ integrale 3 |
| Uovo L-&alfa;- fosfatidilcolina | Avanti Polar Lipids | 840051 | |
| Field Emission Gun SEM (FESEM) | Carl Zeiss | Gemini SEM500 | |
| Glutaraldeide 25 %, soluzione acquosa | Thermo Fischer scientific | 50-262-19 | |
| Grasso per alto vuoto, software Dow corning | VWR | ||
| IMOD | https://bio3d.colorado.edu/imod/ | suite software per l'allineamento di immagini in serie inclinate e la ricostruzione 3D | |
| Griglie per microscopia elettronica Lacey Formvar/carbonio | Eloise | 01883-F | |
| Lipidi | Avanti Polar Lipids | ||
| L-&alfa;-fosfatidilinositolo-4,5-bisfosfato | Avanti Polar Lipids | 840046 | |
| Evaporatore metallico | Leica microsystems | EM ACE600 | |
| NOA (Adesivi ottici Norland), NOA 71 e NOA 81 | Prodotti Norland | NOA71, NOA81 | |
| Microscopia tetraossido di osmio 4% | delta | 19170 | |
| Osmometro | Lö ser | 15 M | |
| Pulitore al plasma | Alcatel | pascal 2005 SD | |
| Generatore di plasma | Microscopia elettronica Scienza | ||
| Apparecchiature per il congelamento a tuffo | Leica Microsystems | EMGP | |
| Microscopio elettronico a trasmissione | Thermofischer | Tecnai G2 200 kV, LaB6 | |
| Acetato di uranile | Microscopia elettronica Scienza | 22451 | questo prodotto non è più disponibile per l'acquisto Piastre |
| cera, Vitrex | VWR |
Riferimenti
- Finger, F. P. Reining in cytokinesis with a septin corral. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 27 (1), 5-8 (2005).
- Barral, Y., Kinoshita, M. Structural insights shed light onto se....
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Ristampe e permessi
