Articolo metodologico

Metodi in vitro bottom-up per saggiare l'organizzazione ultrastrutturale, il rimodellamento della membrana e il comportamento di sensibilità alla curvatura delle settine

DOI:

10.3791/63889

⸱

17 agosto 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratoire Physico Chimie Curie, Institut Curie, PSL Research University, Sorbonne Université, 2Institut Fresnel, CNRS UMR7249, Aix Marseille Univ, Centrale Marseille, 3Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience Delft, Delft University of Technology, 4Department of Chemical Engineering, Imperial College London, 5Sorbonne Université, CNRS, Institut de Biologie Paris-Seine (IBPS), Service de microscopie électronique (IBPS-SME), 6Laboratoire Matière et Systèmes Complexes (MSC), Université Paris Cité, 7Institute of Biotechnology, Czech Academy of Sciences, BIOCEV

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le settine sono proteine citoscheletriche. Interagiscono con le membrane lipidiche e possono percepire ma anche generare curvatura della membrana su scala micron. Descriviamo in questo protocollo metodologie bottom-up in vitro per l'analisi delle deformazioni della membrana, del legame della settina sensibile alla curvatura e dell'ultrastruttura del filamento di settino.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il rimodellamento della membrana avviene costantemente a livello della membrana plasmatica e all'interno degli organelli cellulari. Per analizzare completamente il ruolo dell'ambiente (condizioni ioniche, composizioni proteiche e lipidiche, curvatura della membrana) e dei diversi partner associati a specifici processi di rimodellamento della membrana, intraprendiamo approcci bottom-up in vitro . Negli ultimi anni, c'è stato un vivo interesse nel rivelare il ruolo delle proteine della settina associate alle principali malattie. Le settine sono proteine citoscheletriche essenziali e ubiquitarie che interagiscono con la membrana plasmatica. Sono implicati nella divisione cellulare, nella motilità cellulare, nella neuro-morfogenesi e nella spermiogenesi, tra le altre funzioni. È quindi importante capire come le settine interagiscono e si organizzano a livello delle membrane per indurre successivamente deformazioni di membrana e come possono essere sensibili a specifiche curvature di membrana. Questo articolo mira a decifrare l'interazione tra l'ultra-struttura delle settine a livello molecolare e il rimodellamento della membrana che avviene su scala micron. A tal fine, il lievito in erba e i complessi di septina dei mammiferi sono stati espressi e purificati in modo ricombinante. Una combinazione di saggi in vitro è stata quindi utilizzata per analizzare l'autoassemblaggio delle settine sulla membrana. Sono stati utilizzati doppi strati lipidici supportati (SLB), vescicole unilamellari giganti (GUV), grandi vescicole unilamellari (LUV) e substrati ondulati per studiare l'interazione tra auto-assemblaggio della settina, rimodellamento della membrana e curvatura della membrana.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le settine sono proteine che formano filamenti citoscheletrici che interagiscono con le membrane lipidiche. Le settine sono onnipresenti negli eucarioti ed essenziali per numerose funzioni cellulari. Sono stati identificati come i principali regolatori della divisione cellulare nei lieviti in erba e nei mammiferi 1,2. Sono coinvolti negli eventi di rimodellamento della membrana, nella ciliogenesi3 e nella spermiogenesi4. All'interno delle cellule di mammifero, le settine possono anche interagire con actina e microtubuli 5....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Determinazione del rimodellamento della membrana mediante vescicole unilamellari giganti (GUV)

NOTA: In questa sezione, i GUV sono generati per imitare le deformazioni della membrana eventualmente indotte dalle settine in un contesto cellulare. Infatti, nelle cellule, le settine si trovano frequentemente in siti con curvature micrometriche. I GUV hanno dimensioni che vanno da pochi a decine di micrometri e possono essere deformati. Sono quindi appropriati per dosare qualsiasi deformazione indotta dalla settina su scala micrometrica. I lipidi fluorescenti, così come le settine marcate con fluorescenza (utilizzando la protei....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deformazioni dei GUV
Le tipiche immagini di fluorescenza confocale dei GUV rimodellati dopo essere stati incubati con settine sono visualizzate nella Figura 3, in condizioni in cui le settine polimerizzano. I GUV nudi (Figura 3A) erano perfettamente sferici. Dopo l'incubazione con più di 50 filamenti di settina di lievito in erba nM, le vescicole apparivano deformate. Fino a una concentrazione di ottameri settini di lievito in erba 100 nM, le.......

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Come detto sopra, è stata utilizzata una miscela lipidica che migliora l'incorporazione di PI(4,5)P2 all'interno del doppio strato lipidico e quindi facilita le interazioni settina-membrana. In effetti, abbiamo dimostrato altrove25 che le settine di lievito in erba interagiscono con le vescicole in modo PI(4,5)P2-specifico. Questa composizione lipidica è stata regolata empiricamente dallo screening di composizioni multiple ed è ora ampiamente utilizzata dagli autori. I lipidi.......

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo Patricia Bassereau e Daniel Lévy per i loro utili consigli e discussioni. Questo lavoro ha beneficiato del sostegno dell'ANR (Agence Nationale de la Recherche) per il finanziamento del progetto "SEPTIME", ANR-13-JSV8-0002-01, ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014, e del progetto "SEPTSCORT", ANR-20-CE11-0014-01. B. Chauvin è finanziato dall'Ecole Doctorale "ED564: Physique en Ile de France" e dalla Fondation pour lea Recherche Médicale. K. Nakazawa è stato sostenuto dalla Sorbonne Université (AAP Emergence). G.H. Koenderink è stato sostenuto dalla Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO/OCW) attraverso il "BaSyC-Building a Synthetic Cell". So....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamminaAvanti Polar Lipids850725
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serineAvanti Polar Lipids 840035
Bagno, SonicatoreElmaElmasonic S10H
Bodipy-TR-CeramideThermo Fischer scientific11504726
Sostanze chimiche: NaCl, Tris-HCl, saccarosio, KCl, MgCl2, B-caseina, cloroformio, cacodilato di sodio, acido tannico, etanoloSigma Aldrich
Microscopio confocalenikondisco rotante o confocale
Essiccatore a punti criticiLeica microsystemsCPD300
Generatore di acqua deionizzataMilliQF1CA38083BMilliQ integrale 3
Uovo L-&alfa;- fosfatidilcolinaAvanti Polar Lipids840051
Field Emission Gun SEM (FESEM)Carl ZeissGemini SEM500
Glutaraldeide 25 %, soluzione acquosaThermo Fischer scientific50-262-19
Grasso per alto vuoto, software Dow corningVWR
IMODhttps://bio3d.colorado.edu/imod/suite software per l'allineamento di immagini in serie inclinate e la ricostruzione 3D
Griglie per microscopia elettronica Lacey Formvar/carbonioEloise01883-F
LipidiAvanti Polar Lipids
L-&alfa;-fosfatidilinositolo-4,5-bisfosfatoAvanti Polar Lipids840046
Evaporatore metallicoLeica microsystemsEM ACE600
NOA (Adesivi ottici Norland), NOA 71 e NOA 81Prodotti NorlandNOA71, NOA81
Microscopia tetraossido di osmio 4%delta19170
OsmometroLö ser15 M
Pulitore al plasmaAlcatelpascal 2005 SD
Generatore di plasmaMicroscopia elettronica Scienza
Apparecchiature per il congelamento a tuffoLeica MicrosystemsEMGP
Microscopio elettronico a trasmissioneThermofischerTecnai G2 200 kV, LaB6
Acetato di uranileMicroscopia elettronica Scienza22451questo prodotto non è più disponibile per l'acquisto Piastre
cera, VitrexVWR
, di

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Finger, F. P. Reining in cytokinesis with a septin corral. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 27 (1), 5-8 (2005).
  2. Barral, Y., Kinoshita, M. Structural insights shed light onto se....

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Filamenti di settinasaggio in vitrobilayer lipidici supportativescicole unilamellari gigantimicroscopia elettronica a scansionecriomicroscopia elettronicaproteine citoscheletricheauto assemblaggio

Articoli correlati