Utilizzo della microscopia a microfluidica e fluorescenza per studiare la dinamica di assemblaggio di singoli filamenti e fasci di actina

Summary

Presentiamo protocolli per semplici saggi microfluidici di filamenti di actina, in combinazione con la microscopia a fluorescenza, che consentono di monitorare con precisione i singoli filamenti di actina in tempo reale esponendoli sequenzialmente a diverse soluzioni proteiche.

Abstract

Al fine di decifrare i complessi meccanismi molecolari che regolano l'assemblaggio e lo smontaggio dei filamenti di actina, è una grande risorsa monitorare le singole reazioni dal vivo in condizioni ben controllate. Per fare ciò, negli ultimi 20 anni sono emersi esperimenti dal vivo a singolo filamento, per lo più utilizzando la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) e hanno fornito una miniera di risultati chiave. Nel 2011, al fine di espandere ulteriormente le possibilità di questi esperimenti ed evitare artefatti problematici ricorrenti, abbiamo introdotto semplici microfluidiche in questi test. Questo studio descrive in dettaglio il nostro protocollo di base, in cui i singoli filamenti di actina sono ancorati da un'estremità alla superficie passivata del coverslip, si allineano con il flusso e possono essere successivamente esposti a diverse soluzioni proteiche. Presentiamo anche i protocolli per applicazioni specifiche e spieghiamo come possono essere applicate forze meccaniche controllate, grazie alla resistenza viscosa della soluzione scorrevole. Evidenziamo gli avvertimenti tecnici di questi esperimenti e presentiamo brevemente i possibili sviluppi basati su questa tecnica. Questi protocolli e spiegazioni, insieme alla disponibilità odierna di apparecchiature di microfluidica facili da usare, dovrebbero consentire ai non specialisti di implementare questo test nei loro laboratori.

Introduction

L'assemblaggio e lo smontaggio di filamenti di actina e reti di filamenti di actina sono controllati da diverse reazioni biochimiche e dipendono dal contesto meccanico. Al fine di ottenere informazioni su questi complessi meccanismi, è inestimabile essere in grado di osservare le singole reazioni sui singoli filamenti (in numero sufficientemente grande). Negli ultimi decenni, l'osservazione di filamenti dinamici di actina in tempo reale, per lo più utilizzando la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF), è emersa come una tecnica chiave e ha fornito un elenco impressionante di risultati che non avrebbero potuto essere ottenuti con i saggi biochim....

Protocol

1. Preparazione della camera microfluidica

1. Selezionate uno stampo master SU-8 con diversi modelli di camera. Le camere tipiche sono a forma di croce con tre ingressi e un'uscita, 20 μm di altezza e 800 μm di larghezza (Figura 1). Tali stampi master possono essere acquistati da aziende esterne o realizzati in laboratori accademici (ad esempio, Gicquel, Y. et ^al.5).
2. Posizionare il nastro attorno al bordo dello stampo.
   1. Metti ~ 50 cm di lunghezza, 19 mm di larghezza, nastro da ufficio trasparente standard (vedi Tabella dei materiali) su una panca, lato appic....

Results

Per tutti gli esperimenti sopra descritti, i filamenti di actina marcati fluorescentemente dovrebbero essere chiaramente visibili, con un buon contrasto, indicativo di una bassa fluorescenza di fondo dalla superficie (Figura 4, vedere il file supplementare 1 per la risoluzione dei problemi comuni). Anche i filamenti di actina non dovrebbero attaccarsi alla superficie: quando la portata dominante è bassa, le fluttuazioni laterali dei filamenti di actina dovrebbero essere perc.......

Discussion

Rispetto ai metodi standard a filamento singolo in cui i filamenti di actina sono ancorati alla superficie da più punti lungo la loro lunghezza o mantenuti vicino ad essa da un agente di affollamento come la metilcellulosa, la microfluidica offre una serie di vantaggi. Poiché le interazioni con la superficie sono minime, vengono evitate le pause artificiali che queste interazioni possono indurre sia durante l'allungamento che durante la depolimerizzazione. I filamenti sono allineati dal flusso, paralleli tra loro, facili.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
β-Caseina	Merck	C6905	Utilizzato a 8 mg/mL
Punzone per biopsia (con stantuffo)	Ted Pella	15115-2	ID 0,75 mm, OD 1,07 mm
Biotina-BSA	Merck	A8549	Utilizzato a 1 mg/mL
BSA	Merck	A8022	Utilizzato a 50 mg/mL
Vetrino coprioggetti Mini-Rack Supporto in teflon	Invitrogen	C14784	per 8 vetrini
coprioggetti Vetrini coprioggetti 22x40mm Spessore #1.5	Menzel Glä ser	631-1370
DABCO	Merck	D27802	componente in f-buffer
DTT	Euromedex	EU0006-D	componente in f-buffer
Ester NHS Alexa Fluor 488	Invitrogen	A20000	Fluorophore per la marcatura dell'actina su Lys328.
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin	Thermo Scientific	21338	Per biotinilare l'actina su Lys328
Hellmanex III	Hellma	9-307-011-4-507	Detergente per la pulizia del vetro
ImageJ	NIH	N/A	software open source
Laboport	KNF	811kn.18	pompa per vuoto (vuoto finale: 240 mbar)
Magic nastro invisibile	Scotch	7100024666	nastro da ufficio trasparente standard
Micrewtube	Simport	T341-6T	2 mL provette per serbatoi microfluidici
Dispositivo microfluidico Parte 1: Unità di flusso S	Fluigent	FLU-S-D-PCKB	Misuratore di portata
Dispositivo microfluidico Parte 2: Fluiwell-4C-2 mL	Fluigent	14002001PCK	Supporto per serbatoio
Dispositivo microfluidico Parte 3: MFCS-EZ	Fluigent	EZ-11000001 EZ-00345001	Regolatore
di pressione Modello 42 - UVO-Cleaner	Jelight Inc.	42-220	Detergente ultravioletto
N6-(6-Amminoesil)-ATP-ATTO-488	Jena Bioscience	NU-805-488	ATP-ATTO utilizzato per marcare l'actina
neutravidina	Thermo Scientific	31000
PLL-PEG	SuSoS	PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)	Utilizzare a 1 mg/mL in PBS.
Polidimetilsilossano (PDMS) Sylgard 184 Elastomero siliconico	Dow Corning	1673921	Contiene base PDMS e agente indurente
Polietereterchetone (PEEK) Tubi	Merck	Z226661	" Blu" : I.D. = 0,25 mm
Pistola di soffiaggio di sicurezza	Tubo flessibile a spirale Pneumatica Aria	filtrata	700-S
Tubo in silicone	VWR	228-0701P	collegare il PEEK all'accoppiatore
Accoppiatore per catetere in acciaio inossidabile	Prime Bioscience	SC22/15	Inserito negli ingressi e nelle uscite del PDMS per il collegamento al tubo in PEEK
Film termoplastico	Sigma Aldrich	PM996	Standard "parafilm"
Etanolo ultrapuro	VWR	64-17-5
Bagno di pulizia ad ultrasuoni	VWR	USC200TH	Per ospitare becher da 1 L
Essiccatore sottovuoto	SP Bel-Art	F42022-0000	per degassare il PDMS o le soluzioni