Microfresatura a controllo numerico computerizzato di un dispositivo acrilico microfluidico con restrizione sfalsata per saggi immunologici magnetici basati su nanoparticelle

Summary

La microfluidica è un potente strumento per lo sviluppo di test diagnostici. Tuttavia, sono spesso necessarie attrezzature e materiali costosi, nonché laboriose tecniche di fabbricazione e manipolazione. Qui, descriviamo in dettaglio il protocollo di fabbricazione di un dispositivo microfluidico acrilico per saggi immunologici magnetici basati su micro e nanoparticelle in un ambiente a basso costo e semplice da usare.

Abstract

I sistemi microfluidici hanno notevolmente migliorato le tecniche di dosaggio immunologico. Tuttavia, molte tecniche di microfabbricazione richiedono attrezzature specializzate, costose o complicate, rendendo la fabbricazione costosa e incompatibile con la produzione di massa, che è una delle precondizioni più importanti per l'adozione di test point-of-care (POCT) in ambienti con risorse limitate. Questo lavoro descrive il processo di fabbricazione di un dispositivo acrilico (polimetilmetacrilato, PMMA) per test immunologici enzimatici coniugati con nanoparticelle utilizzando la tecnica di microfresatura a controllo numerico computerizzato (CNC). Il funzionamento del dispositivo microfluidico è dimostrato eseguendo un saggio immunologico per rilevare un anticorpo commerciale utilizzando il lisozima come antigene modello coniugato a nanoparticelle magnetiche a 100 nm. Questo dispositivo integra una restrizione fisica sfalsata di soli 5 μm di altezza, utilizzata per catturare le microparticelle magnetiche che compongono una trappola magnetica posizionando un magnete esterno. In questo modo, la forza magnetica sul supporto immunologico delle nanoparticelle coniugate è sufficiente per catturarle e resistere alla resistenza del flusso. Questo dispositivo microfluidico è particolarmente adatto per la produzione di massa a basso costo senza perdita di precisione per le prestazioni del dosaggio immunologico.

Introduction

Negli ultimi anni, la microfluidica ha svolto un ruolo importante nelle tecniche di dosaggio immunologico¹. La tecnologia di miniaturizzazione presenta molti vantaggi eccezionali rispetto ai test immunologici tradizionali, come il ridotto consumo di campioni e reagenti, tempi di incubazione più brevi, uno scambio efficiente di soluzioni e una maggiore integrazione e automazione².

Inoltre, i sistemi microfluidici nei saggi immunologici, in associazione con nanoparticelle magnetiche come immunosupporto, riducono considerevolmente i tempi di incubazione, raggiungendo un'elevata sensibilità di rivelazione grazie all'aumento del rapporto superficie-volume³. Il movimento browniano delle particelle migliora la cinetica di reazione durante la formazione del complesso antigene-anticorpo ^4,5. Inoltre, le proprietà magnetiche delle nanoparticelle forniscono la versatilità per essere integrate in diverse configurazioni di dispositivi microfluidici, rendendole un candidato ideale per la segnalazione e la cattura di molecole in sistemi di biorilevamento miniaturizzati su chip⁵. Tuttavia, le forze magnetiche sono significativamente più deboli delle forze di trascinamento su scala nanometrica a causa dell'elevato rapporto superficie-volume⁶. Pertanto, la cattura di nanoparticelle per fasi cruciali del dosaggio immunologico come il lavaggio e il rilevamento può essere difficile e un magnete convenzionale è insufficiente⁴.

Un modo efficace per manipolare le nanoparticelle è l'uso di una trappola magnetica microfluidica formata da microparticelle di ferro, che sono impacchettate in una struttura microfluidica³. Pertanto, quando un magnete esterno si avvicina, viene creata un'interazione complessa all'interno del mezzo poroso magnetizzato tra le forze magnetiche e di flusso. La forza magnetica che agisce sulle nanoparticelle è abbastanza forte da catturarle e resistere alla resistenza del flusso ^3,4,7. Questo approccio richiede tecniche di microfabbricazione che raggiungano risoluzioni dell'ordine di pochi micrometri per generare strutture micrometriche che trattengano le microparticelle.

Le attuali tecniche di microfabbricazione consentono la fabbricazione ad alta risoluzione di strutture da pochi micron a centinaia di nanometri⁸. Tuttavia, molte di queste tecniche richiedono attrezzature specializzate, costose o complicate. Una delle principali difficoltà è la necessità di una camera bianca per la fabbricazione di stampi, che rimane costosa e dispendiosa in termini di tempo ^8,9. Recentemente, gli ingegneri microfluidici hanno superato questo inconveniente sviluppando una varietà di metodi di fabbricazione alternativi, con vari vantaggi come costi ridotti, tempi di consegna più rapidi, materiali e strumenti più economici e maggiore funzionalità⁸. In questo modo, lo sviluppo di nuove tecniche di microfabbricazione ha portato metodi a basso costo, non per camere bianche, che raggiungono risoluzioni fino a 10 μm⁸. La modellazione può essere utilizzata direttamente su un substrato senza generare un costoso modello di stampaggio, evitando così un processo dispendioso in termini di tempo. I metodi di fabbricazione diretta includono la fresatura CNC, l'ablazione laser e la litografia diretta⁸. Tutti questi metodi sono adatti per produrre canali ad alto rapporto di aspetto in una vasta gamma di materiali, indipendentemente dalla loro durezza⁹, consentendo nuove e vantaggiose geometrie, comportamenti fisici e qualità nei dispositivi microfluidici⁸.

La microfresatura CNC crea strutture su microscala utilizzando utensili da taglio che rimuovono materiale sfuso da un substrato ed è un metodo di fabbricazione efficace per dispositivi microfluidici^10,11. La tecnica di microfresatura può essere utile nelle applicazioni microfluidiche per creare microcanali e caratteristiche direttamente sul piano di lavoro, offrendo un vantaggio chiave: un pezzo può essere fabbricato in breve tempo (meno di 30 minuti), riducendo significativamente i tempi di consegna dalla progettazione al prototipo¹². Inoltre, l'ampia disponibilità di accessori da taglio di diversi materiali, dimensioni e forme rende le fresatrici CNC uno strumento adatto che ha permesso la fabbricazione di diverse caratteristiche in molti tipi di materiali usa e getta a basso costo¹³.

Tra tutti i materiali comunemente utilizzati nella microfresatura, i termoplastici rimangono una scelta leader grazie alle loro numerose proprietà favorevoli e alla compatibilità con le applicazioni biologiche^10,14. I materiali termoplastici sono un substrato interessante per i sistemi microfluidici grazie ai loro significativi vantaggi per lo sviluppo di sistemi analitici monouso a basso costo⁹. Inoltre, questi materiali sono altamente suscettibili ai processi di produzione ad alto volume, rendendoli adatti alla commercializzazione e alla produzione di massa. Per questi motivi, i materiali termoplastici come il PMMA sono stati considerati materiali affidabili e robusti fin dai primi anni della microfluidica¹⁰. Sono stati descritti diversi protocolli per fabbricare canali chiusi in materiali termoplastici, come il legame solvente¹⁵, il legame termico¹⁶ e l'incollaggio con trattamento superficiale ultravioletto (UV) / ozono¹⁷.

In molti casi, la risoluzione di posizionamento ottenuta con le microfresatrici convenzionali non è sufficiente per alcune applicazioni microfluidiche che richiedono strutture inferiori a 10 μm. La microfresatura di fascia alta ha una risoluzione sufficiente. Sfortunatamente, a causa dei prezzi elevati, il suo utilizzo è limitato a una manciata di utenti¹². In precedenza, il nostro gruppo di ricerca ha riportato la fabbricazione e la manipolazione di uno strumento a basso costo che consente di lavorare strutture inferiori a 10 μm, superando la risoluzione delle fresatrici convenzionali¹². L'apparecchio è una piattaforma prodotta dalla stampa 3D con elettronica semplice, contenente tre attuatori piezoelettrici. La superficie contiene giunti a cerniera che consentono di sollevarla quando gli elementi piezoelettrici agiscono simultaneamente. Lo spostamento dell'asse Z può essere controllato con una risoluzione di 500 nm e una precisione di ±1,5 μm¹².

Questo documento presenta le fasi del processo di produzione di un dispositivo acrilico (PMMA) attraverso una tecnica di microfresatura. Il design del chip è costituito da un canale principale largo 200 μm e alto 200 μm e da un canale laterale con le stesse dimensioni per spurgare il flusso dei reagenti. Nella regione centrale, il canale è interrotto da una restrizione fisica di soli 5 μm di altezza, fabbricata con la piattaforma piezoelettrica stampata in 3D realizzata da questo gruppo¹², per catturare le microparticelle magnetiche che costituiscono una trappola magnetica per le nanoparticelle posizionando un magnete esterno. Mostriamo il funzionamento del dispositivo microfluidico eseguendo un saggio immunologico per rilevare un anticorpo commerciale utilizzando il lisozima come antigene modello coniugato a nanoparticelle magnetiche a 100 nm. Questo dispositivo combina diverse caratteristiche che lo rendono unico⁴: l'uso di nanoparticelle magnetiche come supporto immunitario riduce il tempo totale di test da ore a minuti; l'utilizzo di un enzima fluorogenico per la rilevazione consente limiti di rilevazione paragonabili a quelli dei saggi standard di immunoassorbimento enzimatico (ELISA); e l'uso di un termoplastico come materiale di fabbricazione lo rende compatibile con la produzione di massa, cosa che non era il caso delle precedenti trappole magnetiche di nanoparticelle microfluidiche³, e lo rende un ottimo candidato per sviluppare POCT.

Protocol

1. Microfresatura

1. Rettifica superficiale
   1. Accendere la microfresatrice e il controller piezoelettrico. Avviare i rispettivi software di controllo¹².
   2. Selezionare le punte di fresa richieste (diametri 200 μm e 800 μm). Posizionarli nell'apposito vano della fresatrice (Figura 1).
   3. Tagliare rettangoli di 9 mm x 25 mm di PMMA di spessore 1,3 mm con la punta da 800 μm. Attaccare con cura uno di questi rettangoli con nastro biadesivo alla piattaforma piezoelettrica (Figura 2).
      NOTA: Assicuratevi di posizionare sempre il rettangolo acrilico nella stessa posizione in modo che uno degli angoli coincida con le coordinate di origine sugli assi x e y per la lavorazione.
   4. Collegare e posizionare il sensore z sulla superficie del rettangolo PMMA. Selezionare il perno di rilevamento e spostarlo sulla superficie del sensore. Abbassare manualmente il perno senza contattare il sensore. Attivare la modalità di rilevamento Z0 (Figura 3).
   5. Selezionate la punta da 200 μm e spostatela nell'origine x, y. Rimuovere il sensore z. Abbassare la punta con attenzione senza contattare la superficie acrilica.
   6. Ruotare la punta da 200 μm a 14.500 giri/min. Abbassatelo lentamente fino alla coordinata di origine sull'asse z (z = 0). Reimpostate l'asse z 30 μm sotto l'origine. Impostate questa coordinata come nuova origine z.
      NOTA: non abbassare mai la punta se non è in rotazione. Altrimenti, rischia di rompersi.
   7. Fare clic sul pulsante Taglia nel software della microfresatrice per attivare il pannello Taglio . Fare clic sul pulsante Aggiungi e selezionare il file .txt (Supplemental Coding File 1) con un codice creato in precedenza per la levigatura della superficie acrilica. Fare clic sul pulsante Output per avviare il processo.
   8. Portate la punta della fresa finale alla coordinata in cui verrà lavorata la restrizione. Impedite che la punta della fresa si sollevi dalla superficie di terra una volta raggiunta questa coordinata facendo clic sul pulsante Pausa . In caso contrario, riposizionate manualmente la punta della fresa finale su questa coordinata (Figura 4A).
2. Fresatura della restrizione di 5 μm
   1. Impostare la velocità di rotazione della punta della fresa su 11.000 giri/min. Sollevare la piattaforma di 6,5 μm con l'interfaccia della piattaforma piezoelettrica (Figura supplementare S1). Spostare la punta della fresa lungo l'asse y di 500 μm. Riportare la piattaforma piezoelettrica al suo valore iniziale sull'asse z con l'interfaccia di controllo.
3. Fresatura di microcanali
   1. Aprire il file di progettazione creato in precedenza dal software di progettazione (file di progettazione supplementare 1). Fare clic sul pulsante Stampa . Accedere al menu Proprietà e fare clic sulla finestra colore corrispondente al livello contenente il disegno da lavorare. Impostate i parametri di fabbricazione nel pannello Strumenti come specificato nella Figura supplementare S2.
   2. Disattivate i livelli indesiderati selezionando l'opzione Nessuno (None ) nel menu a discesa Strumenti .
4. Fresatura di fori
   1. Passare alla punta da 800 μm. Attivate il livello di progettazione dei fori di diametro 1,2 mm facendo clic sulla finestra di colore corrispondente.
   2. Ripetete il punto 1.3.2., ma in questo caso impostate i parametri di fabbricazione corrispondenti come descritto nella figura supplementare S3A per i fori.
      NOTA: La profondità dei fori lavorati è la metà dello spessore acrilico.
   3. Lavorare due fori aggiuntivi sugli angoli controlaterali del rettangolo per l'allineamento dell'acrilico in modo invertito su una nuova piattaforma (Figura 4B). Staccare il rettangolo acrilico dalla piattaforma piezoelettrica. Capovolgere l'acrilico e fissarlo con nastro biadesivo sopra l'adattatore con i pilastri lavorati (Figura 4C,D).
   4. Aprire il file con il disegno dei fori per la faccia opposta rispetto al software di progettazione (file di progettazione supplementare 2). Impostare i parametri di fabbricazione corrispondenti come descritto nella figura supplementare S3B. Fresare la metà rimanente dei fori di ingresso e uscita del reagente con un diametro di 1,5 mm e una profondità di 0,7 mm (figura supplementare S3C).

Figura 1: Posizionamento della fresa a punta . (A) Le punte da 200 μm e 800 μm sono posizionate e fissate tramite una vite al supporto in acciaio. (B) Ogni punta di fresatura è collocata nell'apposito vano della microfresatrice per la selezione automatica. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Piattaforma piezoelettrica. La piattaforma è fabbricata mediante stampa 3D ed è costituita da due basi esagonali unite da cerniere che consentono uno spostamento fine nell'asse z controllato da tre attuatori piezoelettrici. Si osserva anche un adattatore acrilico, sul quale è fissato il rettangolo in PMMA e che consente di impostare l'angolo di allineamento delle coordinate. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: calibrazione dell'asse Z. Le fasi della calibrazione dell'asse z sono dettagliate. (A) Il sensore z include un cavo che si collega alla microfresatrice. (B) Il sensore viene posizionato direttamente sulla superficie da lavorare. (C) Il perno di rilevamento è costituito da una barra metallica posta in un compartimento speciale accanto alle punte del mulino. (D) Quando entrambi gli accessori entrano in contatto, la microfresatrice calcola automaticamente la coordinata di origine sull'asse z. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Superficie acrilica rettificata . (A) La punta a punta da 200 μm di diametro spazza l'intera superficie del rettangolo acrilico, rimuovendo uno strato alto circa 30 μm. (B) L'immagine mostra le diverse strutture fresate sulla faccia dell'acrilico precedentemente rettificato. Si osservano canali e fori per l'ingresso e l'uscita del reagente. La restrizione di 5 μm non può essere vista ad occhio nudo. (C) Superficie microfresata con fori di allineamento e adattatore con pilastri di allineamento agli angoli opposti. (D) L'acrilico è allineato capovolto sull'adattatore con pilastri, in cui si inseriscono i fori di allineamento. Barra di scala = 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

2. Sigillatura del canale

1. Pulizia in acrilico
   1. Rimuovere il rettangolo acrilico dalla piattaforma adattatore del pilastro. Prendi un altro rettangolo acrilico non lavorato. Lavare entrambi i fogli acrilici con alcool isopropilico (IPA) e risciacquare con acqua distillata. Indossare guanti ed evitare il contatto con l'alcool isopropilico.
   2. Immergere l'acrilico in un bagno ad ultrasuoni per 10 minuti (Figura 5A,B).
2. Esposizione gassosa al cloroformio
   1. Asciugare perfettamente entrambi i fogli acrilici. Fissarli all'interno di un coperchio di una piastra di Petri di vetro con nastro biadesivo. Assicuratevi di posizionare il lato del canale lavorato esposto (Figura 5C). Indossare guanti ed evitare di toccare direttamente la superficie acrilica.
   2. Posizionare la base della capsula di Petri in vetro all'interno di una capsula di Petri di vetro più grande (Figura 5D). Versare 1 mL di cloroformio nella base della capsula di Petri. Posizionare rapidamente il coperchio con i fogli acrilici attaccati al lato interno.
   3. Aggiungere immediatamente acqua distillata alla base della capsula di Petri più grande fino al livello del coperchio della capsula di Petri. Consentire l'esposizione dell'acrilico al cloroformio gassoso per 1 minuto (Figura 5E).
      NOTA: Considerare che un tempo di esposizione più lungo al cloroformio attaccherà la superficie acrilica e la restrizione di 5 μm si scioglierà, modificando la sua altezza o scomparirà completamente.
   4. Inclinare la capsula di Petri per rompere il sigillo d'acqua creato. Rimuovere immediatamente l'acrilico dal cloroformio scoprendo la capsula di Petri. Fare attenzione a non versare l'acqua.
      ATTENZIONE: Eseguire questo processo nella cappa aspirante e utilizzare guanti poiché il cloroformio è altamente tossico.
3. Incollaggio mediante pressatura e riscaldamento
   1. Sbucciare entrambe le lastre acriliche dal nastro biadesivo.
   2. Allineare entrambi gli acrilici con i lati che sono stati esposti al cloroformio gassoso faccia a faccia, formando un sandwich. Posizionare gli acrilici nella pressa a 18 kgf/cm² e ad una temperatura di 90 °C (Figura 5F,G).
      NOTA: Si consiglia di posizionare l'acrilico allineato longitudinalmente e cambiare il suo allineamento dopo 2 minuti per una migliore tenuta. Se, dopo questo tempo, il sigillo è insufficiente, rimetterlo nella pressa per intervalli non superiori a 1 minuto. Utilizzando lo stereoscopio, controllare lo stato dei canali e la restrizione. Si consideri che, in caso di superamento del tempo di pressatura, c'è il rischio di eliminare la restrizione.
4. Attacco del tubo flessibile
   1. Tagliare 2-3 cm di lunghezza del tubo. Fai un taglio completamente dritto. Fissare ciascun tubo flessibile ai fori del dispositivo con adesivo liquido ad asciugatura istantanea (Figura 6A). Evitare che l'adesivo penetri all'interno del chip.

Figura 5: Processo di sigillatura del dispositivo. (A) Ciascuno dei fogli acrilici viene posto in un sacchetto richiudibile con acqua distillata e immerso nel bagno ad ultrasuoni. (B) L'immagine a sinistra mostra i canali subito dopo la fabbricazione e l'immagine a destra mostra lo stesso dispositivo dopo il lavaggio con IPA e il bagno ad ultrasuoni, che rimuove tutte le impurità e i residui acrilici dal microcanale. Si osservano i bordi della restrizione che interrompe il canale centrale di 200 μm, il che conferma il successo del processo di fresatura. Barre della scala = 500 μm. (C) Entrambi gli acrilici vengono essiccati e fatti aderire alla piattaforma di vetro sul coperchio. (D) La base della capsula di Petri è posta all'interno di un'altra capsula di diametro maggiore. (E) Quando si chiude la capsula di Petri, la guarnizione ad acqua impedisce la fuoriuscita di cloroformio gassoso. (F) Descrizione degli elementi della leva con un peso di 5 kg. (G) Immagine della leva aperta, che mostra in rosso la zona in cui è collocato l'acrilico. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

3. Preparazione del dispositivo

1. Riempire i canali con acqua distillata usando una siringa. Assicurarsi che non ci siano perdite o resistenza al flusso. Immergere il dispositivo in un bagno ad ultrasuoni per 10 minuti per rimuovere eventuali residui di materiale acrilico, adesivo o indesiderato all'interno dei canali.
2. Svuotare l'acqua all'interno dei canali del dispositivo. Utilizzare una siringa per introdurre una soluzione bloccante preparata con albumina sierica bovina (BSA) al 5% (p/v) diluita in 1x soluzione salina tamponata con Tris (TBS) e precedentemente filtrata attraverso un filtro a siringa in polietersulfone (PES) da 0,2 μm.
3. Preparare una sospensione di microparticelle di ferro di 7,5 μm di diametro in BSA al 5%.
   NOTA: Le microparticelle sono precedentemente funzionalizzate con uno strato di silice-polietilenglicole (PEG) che conferisce resistenza all'assorbimento proteico⁴.
4. Incubare il chip e la sospensione di microparticelle con la soluzione bloccante per almeno 1 ora a temperatura ambiente. Se possibile, consentire il blocco notturno a 4 °C.

4. Formazione di trappole di microparticelle

1. Inserire le microparticelle nel chip con un ago della siringa attraverso il tubo di uscita del canale laterale. Posizionare il chip verticalmente e consentire alle microparticelle di fluire sotto l'effetto della gravità attraverso il canale laterale. Ruotare il chip di 180° in due fasi di 90° e consentire alle microparticelle di mirare e compattarsi alla restrizione di 5 μm.
2. Rimuovere le microparticelle in eccesso ruotando per gravità di 45° verso il canale laterale.
3. Tenere il dispositivo in posizione verticale per evitare di annullare la trappola delle microparticelle. Vedere la Figura 6B per un riepilogo del processo di formazione della trappola di microparticelle.

5. Dosaggio immunologico

1. Preparazione delle nanoparticelle
   1. Prendere 2 μL della sospensione di nanoparticelle da 100 nm precedentemente coniugate con lisozima (modello di antigene). Aggiungerlo a una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml con 100 μL di soluzione bloccante. Incubare per una notte a 4 °C.
   2. Aggiungere 150 μL di tampone di lavaggio (1x TBS, 0,05% Tween 20).
   3. Collocare la provetta da microcentrifuga da 1,5 mL in un separatore magnetico. Conservare per 15 minuti per consentire la separazione delle nanoparticelle (Figura supplementare S4).
      NOTA: il volume minimo per il separatore magnetico è di 200 μL. Evitare di utilizzare un volume inferiore.
   4. Rimuovere il liquido dal tubo con una micropipetta. Evitare il contatto con la parete del tubo in cui si è formato il pellet di nanoparticelle.
   5. Aggiungere 250 μL di tampone di lavaggio fresco. Tenere il tubo sotto agitazione per 15 minuti.
   6. Ripetere i passaggi 5.1.3.-5.1.5. 2x di più, agitando solo per 5 min.
   7. Aggiungere la concentrazione desiderata di anticorpi anti-lisozima primario (vedere la Tabella dei materiali). Regolare a un volume finale di 100 μL nel diluente anticorpale (1x TBS, 1% BSA, 0,05% Tween 20).
   8. Incubare per 15 min a 37 °C. Continuare a agitare per altri 15 minuti a temperatura ambiente.
   9. Ripetere le fasi di lavaggio 5.1.2.-5.1.6.
   10. Aggiungere 100 μL di diluente anticorpale. Aggiungere l'anticorpo secondario accoppiato con perossidasi di rafano (HRP-AbII) (vedere la Tabella dei materiali) ad una diluizione di 1:500.
   11. Ripetere le fasi di lavaggio 5.1.2.-5.1.6.
   12. Mantenere le nanoparticelle in un volume finale di 50 μL di diluente anticorpale.

6. Montaggio sperimentale

1. Riempire le due siringhe di vetro da 100 μL con acqua, collegare un tubo lungo 6,5 cm a ciascuna siringa, inserire un perno metallico all'estremità del tubo e posizionare entrambe le siringhe sulla pompa a siringa controllata da computer.
2. Sigillare tutti i tubi del dispositivo acrilico con calore.
3. Tagliare il tubo di ingresso e mantenere solo pochi millimetri. Riempire l'ago di erogazione con tampone di lavaggio e inserirlo nel tubo tagliato. Lasciare gocciolare la soluzione prima di collegare l'ago al dispositivo per impedire l'accesso dell'aria al dispositivo.
4. Tagliare il tubo di uscita dal canale laterale. Collegare alla pompa della siringa. Quindi, eseguire la stessa procedura per il tubo di uscita del canale principale.
   NOTA: è fondamentale eseguire i passaggi da 6.3.-6.4. in questo ordine per evitare di disimballare la trappola delle microparticelle. Se possibile, verificare lo stato della trappola durante questi passaggi con l'aiuto di una lente d'ingrandimento.
5. Posizionare un vetrino sul palco del microscopio. Attaccare il magnete alla diapositiva con nastro biadesivo e posizionare un piccolo pezzo di nastro adesivo su ciascun lato per fissare i bordi del chip al vetro.
6. Impostare una portata di 50 μL/h attraverso le schede Portata e Unità nel controller della pompa a siringa. Selezionare la modalità di prelievo e fare clic sul pulsante Start per attivare il flusso del tampone di lavaggio.
7. Con attenzione, avvicinare il dispositivo verso la slitta con il magnete in modo orizzontale in modo che l'area del chip contenente la trappola entri in contatto con il magnete.
8. Attaccare i bordi del dispositivo al vetro con nastro biadesivo per impedire il movimento. Evitare di ostruire il percorso ottico per la microscopia (Figura 6C).

Figura 6: Configurazione finale del dispositivo . (A) Dispositivo acrilico con i tubi flessibili collegati agli ingressi e alle uscite corrispondenti. La scala mostra le dimensioni del dispositivo in centimetri. (B) Protocollo per la formazione della trappola per microparticelle. Le microparticelle fluiscono attraverso il canale per gravità quando il dispositivo è posto in posizione verticale. Le microparticelle sono concentrate alla restrizione di 5 μm. Le microparticelle in eccesso vengono facilmente rimosse ruotando il chip attraverso il canale laterale. Il chip viene mantenuto verticale per preservare la trappola prima del test immunologico. (C) Dispositivo microfluidico montato su un vetrino contenente il magnete, sul palco del microscopio a fluorescenza invertita. Si osserva l'ago di erogazione attraverso il quale vengono aggiunti i reagenti, così come i tubi di uscita che si collegano a una pompa a siringa. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

7. Immunorilevamento

1. Mantenere il tampone di lavaggio in funzione per 10 minuti a 50 μL/h per rimuovere l'eccesso di BSA.
2. Rimuovere il tampone di lavaggio rimanente dall'ago erogatore con una micropipetta. Aggiungere 50 μL della sospensione di nanoparticelle.
3. Far scorrere la sospensione di nanoparticelle per 7 minuti ad una portata di 100 μL/h. Successivamente, modificare la portata a 50 μL/h e portare per altri 15 minuti.
4. Cambiare l'ago di erogazione. Far scorrere il tampone di lavaggio per 10 minuti a 50 μL/h. Preparare il substrato fluorogenico secondo le specifiche del produttore durante la fase di lavaggio.
5. Rimuovere il tampone di lavaggio rimanente dall'ago erogatore con una micropipetta. Aggiungere 100 μL del substrato fluorogenico (vedere la tabella dei materiali). Far fluire il substrato fluorogenico per 6 minuti a 50 μL/h.
6. Impostare i parametri di misurazione della portata (1 μL/h, 3 μL/h, 5 μL/h e 10 μL/h ) e del tempo (6 min) nelle corrispondenti schede Portata e Imposta timer dell'interfaccia che controllano la pompa a siringa. Assicurarsi di selezionare Modalità di prelievo per ciascuna delle misurazioni da eseguire.
7. Impostare una linguetta Portata aggiuntiva a 50 μL/h e impostare Timer su 3 minuti per la fase di lavaggio.
8. Accendere la fluorescenza del microscopio 15 s prima che il substrato a 50 μL/h si fermi. Avviare l'acquisizione dell'immagine con il software della fotocamera del microscopio 10 s prima che il substrato si fermi con un tempo di esposizione di 1.000 millisecondi. Eseguire l'imaging per 6 minuti a 1 fotogramma/s (FPS).
9. Fare clic sul pulsante Start del parametro della portata desiderata immediatamente dopo l'arresto della portata di lavaggio del substrato a 50 μL/h. Fare clic sul pulsante Start del flusso di lavaggio (50 μL/h) immediatamente dopo l'arresto del flusso di misura selezionato.
10. Interrompere l'acquisizione dell'immagine e spegnere la fluorescenza del microscopio per evitare il fotosbiancamento del substrato.
11. Ripetere i passaggi 7.8.-7.10. per ogni portata di misura utilizzata.

Results

È stato possibile stabilire un protocollo di fabbricazione altamente riproducibile che migliora la risoluzione della tecnica di microfresatura convenzionale. Utilizzando questo protocollo, si ottiene la fabbricazione di un canale di soli 5 μm di altezza che funziona come una restrizione sfalsata in un canale alto 200 μm. Il design semplice della restrizione sfalsata cattura microparticelle di ferro di 7,5 μm di diametro che, una volta compattate nel microcanale, consentono la creazione di una trappola magnetica quando un...

Discussion

Un dispositivo microfluidico acrilico per saggi immunologici utilizzando nanoparticelle come supporto immunologico è stato fabbricato utilizzando una tecnica di microfresatura. Il metodo di produzione diretta sul substrato ha il vantaggio di evitare l'utilizzo di uno stampo master e i tempi e i costi che questo comporta. Tuttavia, è limitato alla prototipazione rapida e alla produzione di dispositivi ad alto volume.

Qui, abbiamo utilizzato una piattaforma piezoelettrica accessoria precedenteme...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.008 Fresa	KYOCERA SGS	2204	2FL 0.008x1/8x0.12x1-1/12
0.032 Fresa	KYOCERA SGS	2228	2FL 0.032x1/8x0.48x1-1/12
Microparticelle di carbonil-ferro	Sigma-Aldrich	44890	7 μ m
Cloroformio	Fermont	6201	Pericolo per la salute: Moderato Infiammabilità: Nessuno Reattività: Nessuna Pericolo di contatto: Moderato
Fotocamera CMOS Moment	Teledyne Tecnologia del sensore fotometrico		: CMOS Efficienza quantistica: 73% Dimensione dei pixel: 4,5 e micro; m x 4,5 µ m Interfacce supportate: USB 3.2 Gen 2
Dr Engrave Software	Roland DGA Corporation		Software di incisione per progettare e creare il percorso di incisione sulla superficie
Cappa di aspirazione	Sconosciuto	Sconosciuto Tubo
flessibile in plastica	Tygon	AAD04103	ID = 0,020, OD = 0,060
Microsope a fluorescenza	ZEISS	Axio Vert.A1
Ago di erogazione ad alta precisione	Loctite	98612
Applicazione del controller piezoelettrico fatto in casa	LabView		Per ulteriori dettagli, vedere il riferimento 12.
Loctite 495 adesivo istantaneo	Henkel	49503	Applicare con punta per micropipetta o ago di erogazione.
MagJET Rack di separazione	termoscientifico		12 x 1,5 mL
Pressa meccanica	fatta in casa
	Roland	MDX-50
Piattaforma piezoelettrica...	Fatto in		Vedi riferimento 12
Polimetilmetacrilato - Lastra - PMMA, Acrilico	Goodfellow	ME303018/1	Spessore: 1,3 mm, Trasparenza: Trasparente/Trasparente
PVCamTest Software	Teledyne Photometrics	Versione 3.10.107	Software di acquisizione immagini
Stereomicroscopio	Nikon	SMZ 7457
SuperMag Carbossyl Beads	Ocean NanoTech	KSC0100	100 nm
Pompa a siringa	kd Scientific	KDS200	Può contenere fino a due siringhe
Bagno Utrasonico	Branson	2800
VPanel software	Sistema operativo Windows	versione 1.0.3.0	Software per il controllo della microfresatrice