A causa dell'opacità del suolo, le interazioni tra i suoi microbi costituenti non possono essere facilmente visualizzate con risoluzione cellulare. Qui vengono presentati due strumenti microfluidici, che offrono nuove opportunità per studiare le interazioni fungo-microbiche. I dispositivi sono versatili e semplici da usare, consentendo un elevato controllo spaziotemporale e immagini ad alta risoluzione a livello cellulare.
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Articolo metodologico
Strumenti microfluidici per sondare le interazioni fungine-microbiche a livello cellulare
In questo articolo
Sommario
Abstract
I funghi filamentosi sono abitanti di successo del suolo e svolgono un ruolo importante negli ecosistemi del suolo, come nella decomposizione della materia organica e inorganica, nonché nella regolazione dei livelli di nutrienti. Lì trovano anche numerose opportunità di interagire con una varietà di altri microbi come batteri o altri funghi. Studiare le interazioni fungine a livello cellulare, tuttavia, può essere difficile a causa della natura del suolo simile a una scatola nera. Sono in fase di sviluppo nuovi strumenti microfluidici per lo studio delle interazioni fungine; sono evidenziate due piattaforme progettate per studiare le interazioni batterico-fungine e fungino-fungine. All'interno di questi microcanali, le interazioni fungo-microbiche possono essere monitorate in ambienti fisico-chimici controllati a una risoluzione temporale e spaziale più elevata di quanto fosse possibile in precedenza. L'applicazione di questi strumenti ha prodotto numerose nuove intuizioni biologiche, come l'osservazione dell'attaccamento polare batterico alle ife o la rivelazione di antagonismi fungino-fungini non caratterizzati. Una caratteristica fondamentale di queste metodologie riguarda la facilità d'uso di questo strumento da parte di non esperti, producendo tecnologie altamente traducibili per l'uso nei laboratori di microbiologia.
Introduzione
Il suolo è un ambiente eccezionalmente diversificato contenente un'abbondanza di microrganismi che sono strumentali ai cicli del carbonio e del fosforo 1,2. I funghi filamentosi sono una componente importante di numerosi ecosistemi come decompositori di materia organica e inorganica e possono migliorare la nutrizione delle piante attraverso la formazione di relazioni simbiotiche 3,4. All'interno del suolo, i funghi interagiscono dinamicamente con una moltitudine di microbi come altri funghi5, batteri6, vi....
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Protocollo
Nota : un riepilogo delle procedure descritte in questo protocollo sono rappresentate visivamente nella Figura 2.
Figura 2: Rappresentazione schematica della metodologia presentata composta da cinque sezioni principali dettagliate in questo protocollo. I progetti dei dispositivi vengono creati utilizzando un software CAD (Computer Aided Design) e uno stampo master prodotto con fotolitografia (1). Questo v....
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Risultati
I risultati rappresentativi sono presentati dai dispositivi esemplari BFI40 e FFI41. Le misurazioni del tasso di crescita ifale possono essere facilmente ottenute utilizzando questi dispositivi in combinazione con tecniche di microscopia di base. La Figura 3A-B illustra le interazioni batterico-fungine tra C. cinerea hyphae e B. subtilis NCIB 3610. La presenza di B. subtilis arresta l.......
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Discussione
Questo articolo presenta un protocollo per lo studio delle interazioni fungo-microbiche utilizzando la microfluidica del canale. Gli autori mirano a dimostrare la versatilità di questi dispositivi e incoraggiare l'adattamento per soddisfare gli interessi del ricercatore. Utilizzando i dispositivi esemplari BFI e FFI, le interazioni fungine-microbiche possono essere studiate in modo più dettagliato di quanto precedentemente accessibile. Rimuovendo la complessità di fondo e l'eterogeneità del suolo, moderando la crescita d.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Riconosciamo il sostegno finanziario del Dipartimento di Bioingegneria dell'Imperial College di Londra e del Leverhulme Trust (Research Grant Reference: RPG-2020-352).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Agar | Difco Laboratories | 214010 | Utilizzato per solidificare il terreno di coltura per la coltivazione batterica e fungina all'interno di piastre di |
| Petri Foglio di alluminio | Fisher Scientific Ltd | 11759408 | |
| AutoCAD 2021 | Autodesk, USA | ||
| Autoclave (VX-75) | Centrifuga Systec | ||
| (5810R) | Eppendorf | ||
| Clorotrimetisilano | Merck Life Sciences | 386529 | ATTENZIONE: Il clorotrimetilsilano è una sostanza pericolosa. Indossare DPI adeguati e maneggiare con cura. Evitare il contatto con la pelle e gli occhi e prevenire l'inalazione. Tenere lontano da fonti di accensione e utilizzare in un'area ben ventilata. |
| Piralide per sughero | SLS | COR1000 | |
| Soluzione di sviluppo (mr-Dev 600) | Microresist Technologies | ATTENZIONE: la soluzione di sviluppo mr-Dev 600 è infiammabile | |
| Staffe di Erlenmeyer | VWR | 214-1108 | ad es. 200 mL; scegliere la dimensione in base alle proprie esigenze |
| Etanolo (70% v/v) | Fisher Scientific Ltd | E/0650DF/15 | Diluito dal 99,8% (grado di reagente analitico) |
| Fiji | ImageJ | Pacchetto software esemplare per l'elaborazione delle immagini | |
| Aria | Disponibile come standard nella maggior parte dei laboratori. In alternativa, è possibile utilizzare un compressore oil-free con regolatore dell'aria. | ||
| Pinzette per wafer a testa piatta | SLS | INS5026 | |
| Pinze | Fisher Scientific Ltd | 10008051 | |
| Petri con fondo in vetro | World Precision Instruments | FD35-100 | |
| Petri con fondo in vetro | World Precision Instruments | FD5040-100 | |
| Piastre di cristallizzazione in vetro | VWR | 216-1865 | Usato per il lavaggio di lastre PDMS Piastre di |
| cristallizzazione in vetro | VWR | 216-1866 | Utilizzato nello sviluppo di stampi master Flaconi |
| terreni in vetro | Fisher Scientific Ltd | 15456113 | ad es. 250 mL; scegliere la dimensione in base alle proprie esigenze |
| Siringa in vetro (Hamilton) | Fisher Scientific Ltd | 10625251 | Utilizzato per l'erogazione di clorotrimetilsilano |
| Piastra riscaldante (HP 160 III BM) | SAWATEC | ||
| Anello di inoculazione | VWR | COPA175CS01 | |
| Alcool isopropilico | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| Cappa a flusso laminare | Air Science (PCR) | Cappa a flusso laminare esemplare utilizzata per la fabbricazione di dispositivi | |
| LB medium | Fisher Scientific Ltd | BP9723-500 | Brodo nutriente esemplare per coltura |
| batterica notturnaMotore di luce a diodi emettitori di luce (LedHUB) | Omicron-Laserage Laserprodukte GmbH | Sorgente luminosa esemplare che può essere utilizzata per l'imaging delle interazioni fungine-microbiche (fluorescenza) | |
| MA6 Allineatore di maschere ultraviolette | Suss Microtec | ||
| Estratto di malto | VWR | 84618 | Utilizzato per realizzare un terreno di coltura fungina esemplare (estratto di malto agar) |
| Mask Writer | Materiali applicati | 4700DP | Esempio di un writer di maschere che può essere utilizzato per stampare foto-maschera per fotolitografia |
| Stampo master supporto | stampato in 3D su misura prodotto internamente | ||
| Armadio di sicurezza microbiologico. (BioMat2) | ad aria contenuta | Esemplare MSC utilizzato per la coltura microbica e l'inoculazione del dispositivo | |
| Acqua | Disponibile di serie nei laboratori di biologia. | ||
| NaOH | Fisher Scientific Ltd | BP359-500 | |
| NIS-Elements Software di imaging per la ricerca avanzata | Pacchetto software Nikon | Exemplar per l'acquisizione di immagini | |
| NIS-Elements Free Viewer Pacchetto | Nikon | Exemplar per la visualizzazione delle immagini acquisite | |
| Forno (Binder BD115) | Fisher Scientific Ltd | 15602126 | Utilizzato per la polimerizzazione del poli(dimetilsilossano) (PDMS) |
| Forno (CLO-2AH-S) | KOYO | Utilizzato per la preparazione di wafer di silicone | |
| Parafilm | Bemis | HS234526B | piastre |
| di Petri a film trasparente, piastre di Petri sterili quadrate | Fisher Scientific Ltd | 11708573 | 120,5 mm |
| , sterili | Fisher Scientific Ltd | 15370366 | 90 mm |
| Maschera per fotolitografia | Micro Lithography Services Ltd. UK | ||
| Pulitore al plasma (Zepto) | Diener Electronic | 100012601 | |
| Bicchiere di plastica | Semadeni | 8323 | |
| Spatola di plastica | Semadeni | 3340 | |
| Bilancia di precisione portatile (OHAUS Scout) | Fisher Scientific Ltd | 15519631 | Utilizzato per pesare PDMS, media componenti ecc. |
| Fresa di precisione | Syneo | HS1251135P1183 | Diametro del tagliente: 3,18 mm |
| Fresa di precisione | Syneo | HS1871730P1183S | Diametro del tagliente: 4,75 mm |
| Profilometro | Bruker | Dektak XT-stylus | |
| Lamette da barba | Hä berle Labortechnik | 9156110 | |
| Refridgerator | Haden | 4-6 ° C | |
| Retiga R1 CCD camera | Qimaging | Fotocamera esemplare che può essere utilizzata per l'imaging di interazioni fungine-microbiche | |
| Nastro magico scotch | Office Depot | 3969954 | nastro invisibile da 19 mm; nastro trasparente |
| Incubatore a scuotimento (Cole-Parmer SI500) | Fisher Scientific Ltd | 10257954 | |
| Wafer di silicio | Inseto | 100 mm | |
| Vetro soda-calcico piastra | Inseto | 125 mm x 125 mm x 2 mm. Utilizzato per contenere la maschera per fotolitografia nell'allineatore della maschera | |
| Cloruro di sodio | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Spincoater | SAWATEC | SM-180-BM | |
| SU-8 2010 fotoresist | MicroChem | ATTENZIONE: il fotoresist SU-8 è pericoloso, prestare attenzione durante la manipolazione e prevenire l'inalazione e il contatto con la pelle. Infiammabile, potenzialmente cancerogeno e tossico per l'ambiente. | |
| Kit di elastomeri Sylgard 184 | VWR | 634165S | Utilizzato per la preparazione di dispositivi in poli(dimetilsilossano) (PDMS) |
| Incubatore a temperatura controllata | Incubatore Okolab | Exemplar che può essere utilizzato per l'imaging di interazioni fungine-microbiche | |
| Microscopio a epifluorescenza invertita Ti2-E | Nikon | MEA54000 | Microscopio esemplare che può essere utilizzato per l'imaging di interazioni fungine-microbiche |
| Pulitore ad ultrasuoni S-Line | Fisher Scientific Ltd | FB15050 | |
| Essiccatore sottovuoto | Fisher Scientific Ltd | 10528861 | La silianizzazione e il degasaggio PDMS devono essere condotti in essiccatori separati |
| x10/0,3 NA CFI Plan Fluor DL Obiettivo | Nikon | MRH20105 | Obiettivo esemplare che può essere utilizzato per l'imaging delle interazioni fungine-microbiche |
| x20/0,45 NA CFI Plan Fluor DL obiettivo | Nikon | MRH48230 | Obiettivo esemplare che può essere utilizzato per l'imaging di interazioni fungine-microbiche |
Riferimenti
- Zhu, Y. -G., Miller, R. M. Carbon cycling by arbuscular mycorrhizal fungi in soil-plant systems. Trends in Plant Science. 8 (9), 407-409 (2003).
- Dai, Z., et al. Long-term nutrient inputs shift soil microbial fun....
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Ristampe e permessi
