Presentiamo un protocollo per la coltivazione ex vivo del tessuto miocardico ventricolare umano. Consente un'analisi dettagliata della forza di contrazione e della cinetica, nonché l'applicazione di pre- e postcarico per imitare più da vicino l'ambiente fisiologico in vivo .
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Articolo metodologico
Preparazione del tessuto miocardico umano per la coltivazione a lungo termine
In questo articolo
Sommario
Abstract
La coltivazione di cardiomiociti ha visto un vasto numero di sviluppi, che vanno dalla coltivazione cellulare bidimensionale (2D) agli organoidi derivati da iPSC. Nel 2019 è stato dimostrato un modo ex vivo per coltivare fette di miocardio ottenute da campioni di cuore umano, mentre si avvicinava alla condizione in vivo di contrazione miocardica. Questi campioni provengono principalmente da trapianti di cuore o posizionamenti di dispositivi di assistenza ventricolare sinistra. Utilizzando un vibratoma e un sistema di coltivazione appositamente sviluppato, fette spesse 300 μm vengono posizionate tra un filo fisso e uno a molla, consentendo una coltivazione stabile e riproducibile per diverse settimane. Durante la coltivazione, le fette vengono continuamente stimolate in base alle singole impostazioni. Le contrazioni possono essere visualizzate e registrate in tempo reale e gli agenti farmacologici possono essere prontamente applicati. I protocolli di stimolazione definiti dall'utente possono essere programmati ed eseguiti per valutare i parametri di contrazione vitali come il potenziamento post-pausa, la soglia di stimolazione, la relazione forza-frequenza e il periodo refrattario. Inoltre, il sistema consente un'impostazione variabile pre e postcarico per una coltivazione più fisiologica.
Qui, presentiamo una guida passo-passo su come generare una coltivazione a lungo termine di successo di fette miocardiche ventricolari sinistre umane, utilizzando una soluzione di coltivazione biomimetica commerciale.
Introduzione
Nell'ultimo decennio, la coltivazione in vitro di cellule miocardiche ha fatto grandi progressi, che vanno dalle tecniche 2D e tridimensionali (3D) all'uso di organoidi e cellule staminali pluripotenti indotte differenziate in miociti cardiaci 1,2,3. Le coltivazioni ex vivo e primarie di cellule hanno dimostrato di essere di grande valore, soprattutto per gli studi genetici e lo sviluppo di farmaci 4,5,6. L'uso di tessuti umani migliora il valore traslazionale dei r....
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Protocollo
La raccolta di tessuti per gli esperimenti qui descritti è stata approvata dai comitati di revisione istituzionale dell'Università di Monaco e dell'Università della Ruhr di Bochum. Gli studi sono stati condotti secondo le linee guida della Dichiarazione di Helsinki. I pazienti hanno dato il loro consenso informato scritto prima della raccolta dei tessuti.
1. Acquisizione tissutale
- Ottenere tessuto umano da pazienti sottoposti a trapianto di cuore o cardiochirurgia.
- Prima di procurare il tessuto, preparare 2 L di soluzione cardioplegica (ulteriormente indicato come tampone di affettamento (Tabella....
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Risultati
La contrazione delle fette miocardiche è stata visualizzata sullo schermo del computer dopo l'inserimento della camera di coltivazione nel connettore corrispondente (Figura 3). La contrazione delle fette miocardiche umane è iniziata immediatamente dopo la stimolazione. Le fette ipercontrastratte per 5-10 min. Ciò era visibile come un aumento delle forze diastoliche, causato da una contrattura tonica delle frazioni tissutali danneggiate. Questo processo è stato ripristinato a vari livelli ent.......
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Discussione
In passato, la ricerca cardiovascolare ha fatto grandi progressi nella coltivazione dei cardiomiociti. Tuttavia, la coltivazione 3D di cardiomiociti con geometria intatta non è ancora ben consolidata. Rispetto ai precedenti protocolli applicati per la coltivazione ex vivo del tessuto miocardico, il protocollo che abbiamo descritto qui assomiglia più da vicino all'ambiente in vivo del tessuto. Inoltre, l'applicazione di pre e postcarico consente un ambiente più biomimetico. Siamo in grado di analizzare e.......
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Dichiarazioni
JH, PS, DM e KL non hanno nulla da rivelare. AD e TS sono azionisti di InVitroSys GmbH, che fornisce il sistema di coltivazione Myodish.
Ringraziamenti
La ricerca è stata finanziata dalle sovvenzioni DZHK 81Z0600207 (JH, PS e DM) e 81X2600253 (AD e TS).
Gli autori desiderano ringraziare Claudia Fahney, Mei-Ping Wu e Matthias Semisch per il loro supporto nella preparazione degli allestimenti, nonché per il regolare mantenimento della coltivazione dei tessuti.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Sostanze chimiche | |||
| Agarosio Basso punto di fusione | Roth | 6351.2 | |
| Bay-K8644 | Cayman Chemical | 19988 | |
| BDM (2,3-Butandione monoxime) | Sigma | B0753-1kg | |
| CaCl2*H2O | Merck | 2382.1 | |
| Calciseptine | Alomone Labs | SPC-500 | |
| Glucosio*H2O | AppliChem | A3730.0500 | |
| H2O | BBraun | 3703452 | |
| HEPES | AppliChem | A1069.0500 | |
| Histoacryl | BBraun | 1050052 | |
| Isopropanolo 100% | SAV LP GmbH | UN1219 | |
| ITS-X-supplement | Gibco | 5150056 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | |
| Medio 199 | Gibco | 31150-022 | |
| MgCl2*6H2O | AppliChem | A1036.0500 | |
| NaCl | Sigma | S5886-1KG | |
| NaH2PO4*H2O | Merck | 1.06346.0500 | |
| Nifedipina | Sigma | N7634-1G | |
| Penicillina / streptomicina x100 | Sigma | P0781-100ML | |
| β-Mercaptoetanolo | AppliChem | A1108.0100 | |
| Attrezzatura da laboratorio | |||
| Flow cabinet | Thermo Scientific | KS15 | |
| Pompa dell'acqua Frigomix e raffreddamento + BBraun Bimmy BM | BBraun | Combinazione di soluzione di raffreddamento e riscaldamento realizzata internamente. | |
| Legante per incubatrice | CB240 | ||
| Sistema di coltura MyoDish | InVitroSys GmbH | MyoDish 1 | Sistema di coltura Myodish |
| Vibratome | Leica | VT1200s | |
| Bagnomaria 37 gradi | Haake | SWB25 | |
| Bagnomaria 80 gradi | Daglef Patz KG | 7070 | |
| Materiali | |||
| Bicchiere monouso in plastica da 100 mL | Sarstedt | 75.562.105 | |
| Unità di filtrazione, Steritop | Quick Release Millipore | S2GPT05RE | |
| aghi 0,9 x 70 mm 20G | BBraun | 4665791 | |
| Triangoli in plastica Rasoio | |||
| Derby premium Derby | Tokai | B072HJCFK6 | |
| Rasoio Gillette Blu argento | Gillette | 7393560010170 | |
| Bisturi monouso | Piuma | 02.001.30.020 | |
| Siringa 10 mL Punta Luer BD Discardit | BBraun | 309110 | |
| Piatto per coltura tissutale Falcon 10 cm | Falcon | 353003 | |
| Piatto per coltura tissutale 3,5 cm | Falcon | 353001 | |
| Provette 50 mL | Falcon | Codice 352070 |
Riferimenti
- George, S. A., Brennan, J. A., Efimov, I. R. Preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices. Journal of Visualized Expereiments: JoVE. (160), e60781(2020).
- Lu, K., et al.
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Ristampe e permessi
