Articolo metodologico

Screening genetico per l'identificazione di soppressori multicopia in Schizosaccharomyces pombe

DOI:

10.3791/63967

⸱

13 settembre 2022

 ,  ,  , 
1University School of Biotechnology, G.G.S. Indraprastha University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Questo lavoro descrive un protocollo per uno screening genetico multicopia soppressore in Schizosaccharomyces pombe. Questa schermata utilizza una libreria plasmidica dell'intero genoma per identificare cloni soppressori di un fenotipo con perdita di funzione associato a un ceppo mutante di query. Nuovi soppressori genetici del mutante nullo ell1 sono stati identificati utilizzando questa schermata.

Abstract

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L'identificazione delle interazioni genetiche è un potente strumento per decifrare le funzioni dei geni fornendo approfondimenti sulle loro relazioni funzionali con altri geni e sull'organizzazione in percorsi e processi biologici. Sebbene la maggior parte degli screening genetici siano stati inizialmente sviluppati in Saccharomyces cerevisiae, una piattaforma complementare per l'esecuzione di questi screening genetici è stata fornita da Schizosaccharomyces pombe. Uno degli approcci comuni utilizzati per identificare le interazioni genetiche è la sovraespressione di cloni da una libreria di plasmidi ad alto numero di copie del genoma in un mutante con perdita di funzione, seguita dalla selezione di cloni che sopprimono il fenotipo mutante.

Questo articolo descrive un protocollo per eseguire questo screening genetico basato sulla "soppressione multicopia" in S. pombe. Questo screening ha contribuito a identificare i soppressori multicopia del fenotipo genotossico sensibile allo stress associato all'assenza del fattore di allungamento della trascrizione Ell1 in S. pombe. Lo screening è stato avviato dalla trasformazione del ceppo mutante nullo ell1 con una libreria di plasmidi di cDNA S. pombe ad alto numero di copie e selezionando i soppressori su piastre EMM2 contenenti 4-nitrochinolina 1-ossido (4-NQO), un composto genotossico che induce stress. Successivamente, il plasmide è stato isolato da due colonie soppressori selezionate e digerito da enzimi di restrizione per rilasciare il DNA inserito. I plasmidi che rilasciano un frammento di DNA inserto sono stati ritrasformati nel ceppo di delezione ell1 per confermare la capacità di questi cloni plasmidi soppressori di ripristinare la crescita del mutante di delezione ell1 in presenza di 4-NQO e altri composti genotossici. I plasmidi che mostrano un salvataggio del fenotipo di delezione sono stati sequenziati per identificare i geni responsabili della soppressione del fenotipo genotossico sensibile allo stress associato alla delezione ell1.

Introduzione

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Le reti di interazioni genetiche forniscono informazioni funzionali sui geni e delineano percorsi e processi biologici in cui questi geni possono essere coinvolti in vivo. Inoltre, possono anche fornire informazioni su come diversi geni interagiscono tra loro, risultando in uno specifico fenotipo 1,2,3. Nel corso degli anni, una varietà di schermi genetici sono stati progettati dai ricercatori per rispondere a domande biologiche fondamentali e studiare le malattie umane. Gli screening per l'identificazione delle interazioni genetiche possono essere eseguiti in diversi modi. Le interazioni genetiche identificate in diversi schermi genetici possono rappresentare relazioni meccanicistiche distinte tra geni. Inoltre, gli studi hanno rivelato che un insieme comune di interazioni genetiche sono condivise da geni che codificano proteine appartenenti allo stesso percorso o complesso 4,5. Pertanto, le reti di interazione genetica possono essere utilizzate per stabilire l'organizzazione funzionale in una cellula, in cui i geni che condividono i profili più simili appartengono allo stesso complesso o percorso, quei geni che condividono profili un po 'meno simili appartengono allo stesso processo biologico e quei geni che mostrano profili sovrapposti ma più diversi riflettono membri appartenenti allo stesso compartimento cellulare6.

Gli schermi di interazione genetica basati sulla soppressione del dosaggio ("soppressione ad alta copia o multicopia") sono uno degli approcci comunemente usati. Questi screening possono essere eseguiti trasformando un ceppo mutante interrogativo con una libreria genomica o di cDNA ad alto numero di copie, seguita da adeguate tecniche di analisi/selezione per identificare la soppressione o il miglioramento delle interazioni genetiche 7,8,9. Per garantire una copertura completa dell'intero genoma, questi screening sono stati effettuati anche sovraesprimendo un gene specifico di interesse in una raccolta di mutanti con perdita di funzione a livello di genoma o sovraesprimendo una libreria genomica o cDNA codificata da plasmidi ad alto numero di copie in una query con perdita di funzione mutante 9,10,11,12,13,14,15 . La strategia multicopia potrebbe anche funzionare utilizzando un approccio dominante/sovraespressione utilizzando un promotore regolabile.

I principali vantaggi dell'utilizzo di screening basati su soppressori sono che la soppressione di un fenotipo preesistente in un ceppo mutante da parte di un altro gene stabilisce una relazione genetica tra questi due prodotti genici che potrebbe non essere stata dimostrata utilizzando altri approcci. In secondo luogo, è stato osservato che la presenza di una mutazione preesistente sensibilizza una particolare via, consentendo di identificare ulteriori componenti di quella via mediante l'isolamento di soppressori, che potrebbero non essere stati identificati da selezioni genetiche più dirette. Inoltre, questa schermata può essere utilizzata per identificare i soppressori che hanno diversi meccanismi di soppressione16. Le interazioni soppressori di solito si verificano tra geni che sono funzionalmente correlati e possono essere utilizzati per chiarire le gerarchie nei percorsi. L'esatto meccanismo sottostante alla soppressione può differire in base a diversi fattori, tra cui il tipo di query mutante utilizzato nello schermo, le condizioni sperimentali e il livello di espressione genica. Uno dei comuni meccanismi di soppressione del dosaggio coinvolge geni che codificano prodotti che funzionano insieme nello stesso complesso o in parallelo nello stesso processo cellulare / biologico. I risultati di tali screening in organismi modello più semplici come il lievito possono essere estesi agli organismi eucarioti superiori poiché la maggior parte dei percorsi e dei processi biologici fondamentali sono conservati attraverso l'evoluzione.

Questi schermi genetici possono anche essere modificati in diversi modi per rispondere a diverse domande biologiche. Ad esempio, è possibile identificare geni ortologhi di diversi organismi che possono sopprimere il fenotipo del ceppo mutante di query. È stato anche usato per delineare potenziali meccanismi di resistenza e determinare bersagli proteici di nuovi composti antibatterici17,18, antifungini19,20, antiparassitari 21 e antitumorali 22. Questo schermo è stato sfruttato anche per identificare i soppressori dell'attività dei farmaci il cui meccanismo d'azione non è noto. Pertanto, in linea di principio, questi schermi soppressori multicopia possono essere ottimizzati e utilizzati in una varietà di applicazioni in diversi organismi. Sebbene la maggior parte degli screening genetici impiegati dai ricercatori sul lievito siano stati inizialmente sviluppati in S. cerevisiae, S. pombe è emerso come un sistema modello complementare per l'esecuzione di vari screening genetici e saggi23. Inoltre, l'organizzazione genomica e i processi biologici in S. pombe, come la presenza di introni in più geni, la complessità delle origini della replicazione del DNA, la struttura del centromero, l'organizzazione del ciclo cellulare e la presenza del macchinario RNAi, mostrano una maggiore somiglianza tra S. pombe e gli eucarioti superiori23,24, sottolineando l'importanza di progettare e utilizzare strumenti genetici in S. pombe.

Questo articolo descrive un protocollo per identificare gli interattori genetici basati sulla "soppressione del dosaggio" di un fenotipo mutante con perdita di funzione in S. pombe. La base di questo protocollo è che si tratta di un metodo rapido ed efficiente per lo screening di una libreria di cDNA che sovraesprime geni wild-type su un plasmide multicopia e/o da un forte promotore. Questo protocollo ha quattro fasi principali: trasformazione della libreria in un ceppo mutante di query, selezione di cloni plasmidi che sopprimono il fenotipo desiderato del ceppo mutante di query, recupero del plasmide da questi cloni soppressori e identificazione del gene responsabile della soppressione del fenotipo. Come è vero per qualsiasi metodo basato sulla selezione e l'identificazione di cDNA da una libreria, il successo dello schermo dipende dall'utilizzo di una libreria di alta qualità e alta complessità in quanto lo schermo può recuperare solo quei cloni di cDNA presenti nella libreria.

Utilizzando questo protocollo, abbiamo identificato con successo due nuovi soppressori del fenotipo genotossico sensibile allo stress del mutante nullo S. pombe ell1. La famiglia ELL (Eleven Nineteen Lysine Rich Leukemia) di fattori di allungamento della trascrizione sopprime la pausa transitoria della RNA polimerasi II su modelli di DNA in saggi biochimici in vitro e sono conservati in vari organismi, dal lievito di fissione all'uomo25. Lavori precedenti hanno fornito prove che un mutante nullo di S. pombe ell1 mostra sensibilità genotossica allo stress in presenza di 4-nitrochinolina 1-ossido (4-NQO) e metil metansolfonato (MMS)26. Pertanto, abbiamo trasformato una libreria di cDNA multicopia codificata da plasmide S. pombe nella query S. pombe ell1 null mutant e identificato due cloni putativi che mostravano la capacità di sopprimere la sensibilità genotossica allo stress del mutante nullo S. pombe ell1 in presenza di 4-NQO, un composto che induce lesioni del DNA. Il successivo sequenziamento dell'inserto presente nei cloni plasmidi ha identificato che i geni che codificano rax2+ e osh6+ erano responsabili della soppressione della sensibilità genotossica allo stress del mutante nullo ell1 quando sovraespresso nel mutante nullo ell1.

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Protocollo

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1. Trasformazione della libreria cDNA nella query S. pombe mutante ceppo per lo screening di soppressori multicopia

NOTA: Il metodo standard di litio-acetato27 è stato seguito per trasformare la libreria di cDNA di S. pombe nella query S. pombe ell1Δ ceppo con alcune modifiche:

  1. Coltivare il ceppo S. pombe ell1Δ a 32 °C su una piastra di mezzo YE (Tabella 1) integrata con 225 μg/ml ciascuno di adenina, leucina e uracile. Inoculare un ciclo pieno di inoculo di ceppo ell1Δ dalla piastra sopra in 15-20 mL di terreno YE integrato con 225 μg/ml ciascuno di adenina, leucina e uracile. Incubarlo per una notte a 32 °C agitando (200-250 giri/min).
  2. Il giorno successivo, diluire la coltura per una notte in 100 ml di terreno YE fresco con gli integratori desiderati a un OD 600 nm (densità ottica a 600 nm) di 0,3 e incubarlo a 32 °C agitando a 200-250 rpm fino a quando l'OD600 nm raggiunge la fase intermedia.
  3. Dividere la coltura da 100 mL in due provette da centrifuga da 50 ml, seguita da centrifugazione a temperatura ambiente per 10 minuti a 4.000 × g.
  4. Scartare il surnatante e lavare il pellet cellulare con 1 mL di acqua sterile, cioè risospendere le cellule in 1 mL di acqua sterile e centrifugare a 4.000 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
  5. Eliminare il surnatante e lavare ogni pellet cellulare con 1 mL di soluzione 1x LiAc-TE (100 mM di acetato di litio, 10 mM di Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) come descritto al punto 1.4.
  6. Rimuovere il surnatante e risospendere ogni pellet cellulare in 250 μL di 1x LiAc-TE. Utilizzare queste cellule competenti di S. pombe (500 μL) per la trasformazione con il DNA di interesse. Trasferire 125 μL delle cellule competenti in quattro diverse provette sterili per microcentrifuga per le successive fasi di trasformazione.
  7. Far bollire il DNA del vettore dai testicoli di salmone o dallo sperma di aringa per 1 minuto e immediatamente mettere sul ghiaccio. Per ogni trasformazione, aggiungere 10 μL di DNA vettore denaturato a singolo filamento da 10 mg/mL alla provetta della microcentrifuga contenente 125 μL delle cellule competenti, seguita da una delicata miscelazione utilizzando una punta di micropipetta. Successivamente, aggiungere 50 μg della libreria di cDNA di S. pombe alla provetta di microcentrifuga contenente miscela di DNA contenente cellule portatrici.
  8. Incubare le provette della microcentrifuga a temperatura ambiente per 10 minuti, quindi aggiungere 260 μL di soluzione di polietilenglicole-acetato di litio (40% [p/v] PEG 4.000, 100 mM di acetato di litio, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) ai tubi e mescolare delicatamente con l'aiuto di una punta di micropipetta.
  9. Incubare le provette di microcentrifuga contenenti la miscela di trasformazione a 32 °C per 2 ore senza agitare. Aggiungere 43 μL di dimetilsolfossido (DMSO) preriscaldato al tubo della microcentrifuga e mescolare delicatamente. Successivamente, esporre i tubi a shock termico a 42 °C per 5 min.
  10. Pellettare le celle a 4.000 × g per 5 minuti a temperatura ambiente. Eliminare il surnatante e rimuovere la soluzione residua di PEG-LiAc-TE con l'aiuto di una punta di micropipetta.
  11. Risospendere le cellule in 100 μL di acqua sterile e placcare su una piastra EMM2 (Tabella 1) (150 mm) con supplementi necessari e 0,2 μg/ml di 4-NQO.
  12. Incubare le piastre a 32 °C per 5-6 giorni per consentire la comparsa di colonie sulle piastre. Strisciare le colonie ottenute sulla stessa piastra di mezzo in presenza di 0,2 μg/mL di 4-NQO e utilizzarle per ulteriori screening.
  13. Per un esperimento di trasformazione in libreria, utilizzare 500 μL di cellule competenti (125 μL di cellule competenti x 4 provette di microcentrifuga) per la trasformazione come descritto nei passaggi da 1.8 a 1.14 sopra.
  14. Come controllo, piastra 1/10della miscela di trasformazione su una piastra EMM2 (150 mm) con supplementi necessari, ma priva di 4-NQO, per calcolare il numero totale di cloni della libreria ottenuti dopo la trasformazione della libreria e schermo per l'isolamento dei cloni soppressori.

2. Testare e validare il salvataggio/soppressione del fenotipo associato al ceppo mutante interrogato dal putativo suppressor

NOTA: Sono stati effettuati saggi a campione di stress come descritto di seguito per testare e convalidare il salvataggio/soppressione della sensibilità allo stress 4-NQO associata alla delezione ell1 da parte del presunto soppressore.

  1. Aggiungere 100-200 μL di acqua sterile in ciascuno dei diversi pozzetti di una piastra sterile da 96 pozzetti.
  2. Prelevare una piccola quantità di inoculo da ciascuna delle diverse colonie ottenute dopo la trasformazione della libreria di cDNA sulla piastra contenente 4-NQO utilizzando uno stuzzicadenti sterile o una punta di micropipetta da 20-200 μL. Aggiungere l'inoculo di ciascuna delle diverse colonie in pozzetti indipendenti separati della piastra di microtitolazione contenenti 100-200 μL di acqua sterile. Mescolare accuratamente.
  3. Spot 3 μL della sospensione cellulare da ciascun pozzetto su piastre di agar EMM2 contenenti adenina (225 μg/mL) e uracile (225 μg/mL) ma prive di leucina (il marcatore auxotrofico selezionabile presente sul vettore plasmidico utilizzato per la costruzione della libreria utilizzata in questo lavoro). Aggiungere le concentrazioni appropriate di 4-NQO alle piastre secondo necessità.
  4. Incubare le piastre a 32 °C per 3-4 giorni per consentire alle cellule di crescere. Identificare le colonie che mostrano crescita in presenza di diverse concentrazioni di 4-NQO come soppressori putativi.
  5. Per convalidare ulteriormente i soppressori, far crescere i soppressori selezionati insieme a ceppi di controllo appropriati durante la notte a 32 °C con agitazione (200-250 giri/min) in mezzo EMM2 contenente 225 μg/ml ciascuno di adenina e uracile ma privo di leucina.
  6. Il giorno successivo, diluire le cellule a un OD 600 nm di 0,3 in terreno EMM2 fresco e farle crescere a 32 °C agitando fino alla fase intermedia (circa OD600 nm di 0,6-0,8).
  7. Individuare le diluizioni seriali appropriate (1:10 o 1:5) delle colture su piastre EMM2 con supplementi necessari contenenti 0,4 μM 4-NQO o 0,01% MMS. Per il controllo, individuare i ceppi su una piastra EMM2 con integratori necessari ma privi di qualsiasi agente dannoso per il DNA.
  8. Incubare le piastre a 32 °C per 3-5 giorni per monitorare la crescita.
    NOTA: Saggi appropriati basati sul fenotipo associato al ceppo mutante interrogato devono essere utilizzati per testare il salvataggio o la soppressione del fenotipo. Ad esempio, se è necessario identificare i soppressori di un fenotipo sensibile al freddo di un ceppo mutante interrogante, il test per testare e convalidare i cloni soppressori comporterebbe la crescita di trasformanti a bassa temperatura.
  9. Individua i ceppi mutanti trasformati con il gene di interesse a lunghezza intera (Spell1 in questo caso) o il vettore vuoto come controlli positivi e negativi, rispettivamente, insieme ai trasformanti della libreria.

3. Isolamento del plasmide dai cloni soppressori di S. pombe

NOTA: L'isolamento plasmidico da S. pombe è stato effettuato seguendo il protocollo descritto in Lievito di fissione: un manuale di laboratorio28 con alcune modifiche.

  1. Inoculare una singola colonia di lievito in mezzo EMM2 contenente 225 μg/ml di adenina e uracile e far crescere le cellule durante la notte a 32 °C agitando a 200-250 giri/min. Il giorno successivo, raccogliere 5 cellule O.D. (cioè 10 mL di coltura di O.D. 0,5) centrifugando per 2 minuti a 4.000 × g a temperatura ambiente.
  2. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 0,2 mL di tampone di lisi (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris HCl (pH 8,0) e 1 mM Na2EDTA).
  3. Aggiungere 0,2 mL di fenolo:cloroformio:alcool isoamilico (25:24:1) e 0,3 g di perle di vetro lavate con acido alla provetta della microcentrifuga. Vortice la provetta della microcentrifuga per 2 min a 4 °C e incubare su ghiaccio per 1 min. Ripetere questo passaggio 6x.
  4. Centrifugare il tubo a 10.000 × g per 15 minuti a temperatura ambiente. Trasferire lo strato acquoso superiore in una provetta da microcentrifuga fresca e aggiungere 200 μL di fenolo:cloroformio:alcool isoamilico (25:24:1).
  5. Centrifugare il tubo a 10.000 × g per 10 minuti. Trasferire lo strato acquoso superiore in un tubo fresco e aggiungere due volumi di etanolo al 100% (~400 μL) e 1/10 di volume di acetato di sodio (3 M, pH 5,8) (~20 μL) al tubo. Incubare la provetta della microcentrifuga -70 °C per 1 ora.
  6. Precipitare il DNA mediante centrifugazione a 10.000 × g per 15 minuti a 4 °C e rimuovere il surnatante. Lavare il pellet di DNA con etanolo al 70% (~500 μL) e tenerlo a temperatura ambiente per asciugare all'aria.
  7. Risospendere il DNA in 20 μL di acqua sterile. Utilizzare 2-5 μL di DNA plasmidico per la trasformazione di cellule E. coli competenti.
    NOTA: Il plasmide può anche essere isolato dalle cellule di lievito utilizzando uno qualsiasi dei kit di isolamento del plasmide di lievito disponibili in commercio.

4. Identificazione del gene codificato dal clone soppressore

  1. Trasformare i plasmidi di lievito isolati in E. coli Top10 ceppo [F-mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80LacZM15 lacX74 recA1 ara139 (ara-leu)7697 galUgalKrpsL (StrR) endA1 nupG] utilizzando il protocollo standard29 e diffondere le cellule su piastre LB (Luria Broth) con gli antibiotici necessari.
  2. Isolare il/i plasmide dai trasformanti di E. coli utilizzando il protocollo standard di lisi alcalina29 e seguire le combinazioni appropriate di enzimi di restrizione per verificare il rilascio del frammento di DNA dell'inserto mediante digestione di restrizione.
    NOTA: Il plasmide soppressore 84 è stato digerito con l'enzima di restrizione Bam HI e il plasmide soppressore 104 è stato digerito con enzimi di restrizione PstI / BamHI.
  3. Ritrasformare i plasmidi che mostrano il rilascio dell'inserto dopo la digestione di restrizione nel ceppo ell1 Δ per verificare la loro capacità di salvare il fenotipo genotossico sensibile allo stress del ceppo ell1Δ.
  4. Selezionare i cloni plasmidi che mostrano la soppressione della sensibilità genotossica allo stress e sequenziare il frammento di DNA presente in questi cloni plasmidi utilizzando primer avanti e inverso vettoriali specifici.
    NOTA: In questo studio, è stato utilizzato il primer universale in avanti specifico del promotore adh1 (5'CATTGGTCTTCCGCTCCG 3')30.
  5. Per identificare il gene responsabile della soppressione, allineare la sequenza ottenuta utilizzando NCBI nucleotide blast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_SPEC=GeoBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch) o Pombase sequence alignment tool (https://fungi.ensembl.org/Schizosaccharomyces_pombe/Tools/Blast?db=core). Selezionare la sequenza che mostra il massimo allineamento e identificarla come il gene per il plasmide soppressore multicopia.

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Risultati

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Screening per soppressori multicopia della sensibilità genotossica associata alla delezione ell1 in S. pombe
Abbiamo eseguito lo screening genetico utilizzando il protocollo sopra descritto per identificare i soppressori multicopia del fenotipo con perdita di funzione del ceppo mutante di delezione ell1. La sensibilità correlata alla crescita del ceppo di delezione ell1 osservata in presenza dell'agente genotossico...

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Discussione

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I lieviti sono stati ampiamente utilizzati per studiare i processi biologici di base e i percorsi che sono evolutivamente conservati attraverso gli organismi eucarioti. La disponibilità di strumenti genetici e genomici insieme alla loro amenabilità a varie procedure biochimiche, genetiche e molecolari rendono i lieviti un eccellente organismo modello per la ricerca genetica34,35,36. Nel corso degli anni, vari screening genetici ...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato finanziato da una borsa di ricerca del Dipartimento di Biotecnologia, Governo dell'India (Grant No. BT/PR12568/BRB/10/1369/2015) a Nimisha Sharma. Gli autori ringraziano il Prof. Charles Hoffman (Boston College, USA) per il dono della libreria di cDNA di S. pombe e la Prof.ssa Susan Forsburg per i plasmidi di lievito.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
4-NQOSigmaN8141
Acido acetico, glacialeSigma1371301000
Adenina SolfatoHimediaGRM033
AgarHimediaGRM026
AgarosioLonza50004L
Cloruro di ammonioHimediaMB054
BamHIFermentasER0051
BiotinaHimediaRM095
Acido boricoHimediaMB007
Cloruro di calcio SigmaC4901
Cloroformio: Alcool isoamilico 24:1SigmaC0549
Acido citricoHimediaRM1023
Idrogeno fosfato disodico anidroHimediaGRM3960
DNA a singolo filamento da testicoli di salmoneSigmaD7656
EDTA disodicoSigma 324503
Cloruro ferrico esaidratoHimediaRM6353
GlucosioAmresco188
IonositoloHimediaGRM102
IsopropanoloQualigenQ26897
LeucinaHimediaGRM054
Litio AcetataeSigma517992
Cloruro di magnesio esaidratoHimediaMB040
Acido molibdicoHimediaRM690
Acido nicotinicoHimediaCMS177
PEG, MW 4000Sigma81240
Acido pentotinicoHimediaTC159
FenoloHimediaMB082
Kit di estrazione plasmidicoQiagen27104
Cloruro di potassioSigmaP9541
Idrogeno di potassio PthallateMercDDD7D670815
Ioduro di potassioHimediaRM1086
RNAsiFermentasEN0531
SDSHimediaGRM205
Idrossido di sodioHimediaGRM1183
Solfato di sodioHimediaRM1037
Tris free BaseHimediaMB209
UracilHimediaGRM264
Estratto di lievito in polvereHimediaRM668
Solfato di zinco eptaidratoMerc DJ9D692580

Riferimenti

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