Imaging simultaneo e rilevamento basato sulla citometria a flusso di marcatori di senescenza fluorescenti multipli in cellule tumorali senescenti indotte dalla terapia

Summary

Qui presentiamo un metodo basato sulla citometria a flusso per la visualizzazione e la quantificazione di più marcatori associati alla senescenza in singole cellule.

Abstract

I farmaci chemioterapici possono indurre danni irreparabili al DNA nelle cellule tumorali, portando ad apoptosi o senescenza prematura. A differenza della morte cellulare apoptotica, la senescenza è un meccanismo fondamentalmente diverso che limita la propagazione delle cellule tumorali. Decenni di studi scientifici hanno rivelato i complessi effetti patologici delle cellule tumorali senescenti nei tumori e nei microambienti che modulano le cellule tumorali e le cellule stromali. Nuove prove suggeriscono che la senescenza è un potente fattore prognostico durante il trattamento del cancro, e quindi è essenziale un rilevamento rapido e accurato delle cellule senescenti nei campioni di cancro. Questo documento presenta un metodo per visualizzare e rilevare la senescenza indotta dalla terapia (TIS) nelle cellule tumorali. Le linee cellulari diffuse di linfoma a grandi cellule B (DLBCL) sono state trattate con mafosfamide (MAF) o daunorubicina (DN) ed esaminate per il marcatore di senescenza, la β-galattosidasi associata alla senescenza (SA-β-gal), il marcatore di sintesi del DNA 5-etinil-2′-deossiuridina (EdU) e il marcatore di danno al DNA gamma-H2AX (γH2AX). L'imaging del citometro a flusso può aiutare a generare immagini a singola cellula ad alta risoluzione in un breve periodo di tempo per visualizzare e quantificare simultaneamente i tre marcatori nelle cellule tumorali.

Introduction

Una varietà di stimoli può innescare la senescenza cellulare, facendo sì che le cellule entrino in uno stato di arresto stabile del ciclo cellulare. Questi stimoli includono cambiamenti intrinseci di segnalazione o stress estrinseci. I segnali intrinseci includono l'accorciamento progressivo dei telomeri, i cambiamenti nella struttura dei telomeri, la modificazione epigenetica, i disturbi della proteostasi, la disfunzione mitocondriale e l'attivazione degli oncogeni. Gli stress estrinseci includono segnali infiammatori e / o di danno tissutale, radiazioni o trattamenti chimici e privazione nutrizionale 1,2,3,4.

Protocol

1. Linee cellulari DLBCL con trattamento con mafosfamide o daunorubicina per indurre la senescenza cellulare

NOTA: Il protocollo funziona anche per le cellule tumorali aderenti. A seconda delle dimensioni della cellula, il seme 1-2 × 10⁵ cellule in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e incubare la piastra in un incubatore al 5% di CO₂, 37 °C durante la notte prima del trattamento. I passaggi del protocollo sono gli stessi delle celle di sospensione, ma con due eccezioni. In primo luogo, le cellule devono essere tripsinate dalla piastra dopo il passaggio 3.4. In secondo luogo, le fasi di lavaggio veng....

Results

Una matrice di compensazione è stata generata utilizzando un software di analisi delle immagini caricando i dati registrati dei campioni di controllo a colore singolo. Come mostrato nella Figura supplementare S1, è stata rilevata una ricaduta della luce non trascurabile (valore del coefficiente ≥ 0,1) da EdU a C₁₂FDG con valore del coefficiente di diafonia 0,248, mentre la diafonia tra gli altri canali non era significativa. Quattro diverse linee cellulari DLBCL sono state trattate con 5 μg/mL.......

Discussion

Questo metodo ha esaminato la capacità di ingresso in senescenza di quattro diverse linee cellulari DLBCL durante il trattamento chemioterapico, con imaging a campo luminoso e quantificazione basata sulla citometria a flusso. A livello di singola cellula, abbiamo rilevato con successo le principali popolazioni senescenti C₁₂FDG ^{+ EdU-Ki67 +} nelle cellule TRATTATE KARPAS422 e WSU-DLCL2 e, in misura minore, nelle cellule OCI-LY1, mentre la linea cellulare SU-DHL6 era resistente a.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Anticorpo	Biolegend	613407
Anticorpo monoclonale di topo anti-Ki-67 (Alexa Fluor 647)	Biolegend	350509
C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside)	Fisher Scientific	11590276
Clorochina-difosfato	Sigma aldrich	C6628
Detergente (Coulter Clenz)	Beckman Coulter	8546929
Click-iT EdU Pacific Blue Kit di Citometria a Flusso	Thermo Scientific	C10418
Daunorubicina	Medchemexpress	HY-13062A
Debubbler (70% Isopropanolo)	Millipore	1.3704
Software di analisi delle immagini (Amnis  IDEE  6.3)	Strumento Luminex	CN-SW69-12
e software di imaging (Amnis  ImageStreamX  Sistema di citometro a flusso con imaging Mk II e software INSPIRE)	Luminex	100220
KARPAS	DSMZ	ACC 31
mafosfamide cicloesilammina	Niomech	D-17272
OCI-LY1	DSMZ	ACC 722
Paraformaldeide	Fisher Scientific	11473704
PETG (2-feniletil-β-D-tiogalattosid)	Sigma aldrich	P4902
saponina	Sigma aldrich	47036
guaina	Millipore	BSS-1006-B
Kit SpeedBead per sterilizzatore ImageStream	Luminex	400041
(0,4-0,7% ipoclorito)	VWR	JT9416-1
SU-DHL6	DSMZ	ACC 572
WSU-DLCL2	DSMZ	ACC 575