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Articolo metodologico

Allenamento di resistenza aggiustato in base al dosaggio nei topi con un rischio ridotto di danni muscolari

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DOI:

10.3791/64000

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31 agosto 2022

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1Physical Therapy Program, Department of Health Care Sciences, Eugene Applebaum College of Pharmacy and Health Sciences, Wayne State University, 2Department of Pharmacology, University of Nevada, Reno School of Medicine

In questo articolo

Sommario

Il presente protocollo descrive una tecnica unica chiamata allenamento di resistenza aggiustato dal dosaggio (DART), che può essere incorporata in studi di riabilitazione di precisione eseguiti su piccoli animali, come i topi.

Abstract

L'allenamento di resistenza progressiva (PRT), che comporta l'esecuzione di contrazioni muscolari contro carichi esterni progressivamente maggiori, può aumentare la massa muscolare e la forza in individui sani e in popolazioni di pazienti. Vi è la necessità di strumenti di riabilitazione di precisione per testare la sicurezza e l'efficacia del PRT per mantenere e / o ripristinare la massa muscolare e la forza negli studi preclinici su modelli animali di piccole e grandi dimensioni. La metodologia PRT e il dispositivo descritti in questo articolo possono essere utilizzati per eseguire l'allenamento di resistenza aggiustato per il dosaggio (DART). Il dispositivo DART può essere utilizzato come dinamometro autonomo per valutare oggettivamente la coppia contrattile concentrica generata dai dorsiflessori della caviglia nei topi o può essere aggiunto a un sistema di dinamometria isocinetica preesistente. Il dispositivo DART può essere fabbricato con una stampante 3D standard in base alle istruzioni e ai file di stampa 3D open source forniti in questo lavoro. L'articolo descrive anche il flusso di lavoro per uno studio per confrontare il danno muscolare indotto dalla contrazione causato da un singolo attacco di DART con il danno muscolare causato da un attacco comparabile di contrazioni isometriche (ISOM) in un modello murino di distrofia muscolare dei cingoli di tipo 2B / R2 (topi BLAJ). I dati di otto topi BLAJ (quattro animali per ogni condizione) suggeriscono che meno del 10% del muscolo tibiale anteriore (TA) è stato danneggiato da un singolo attacco di DART o ISOM, con DART che è meno dannoso di ISOM.

Introduzione

L'esercizio fisico conferisce numerosi benefici per la salute al muscolo scheletrico (recensito in Vina et al.1). In particolare, l'allenamento di resistenza progressiva (PRT), che comporta l'esecuzione di contrazioni muscolari contro carichi esterni progressivamente maggiori (ad esempio, bilancieri, manubri, circuiti a cavo-puleggia), è noto per aiutare ad aumentare la massa muscolare e la forza sia in individui sani che in popolazioni di pazienti (recensito in pubblicazioni precedenti 2,3 ). La PRT si basa sul principio di sovraccarico, che afferma che, quando il muscolo si contrae contro carichi esterni progressivamente maggiori, si adatta aumentando la sua area fisiologica della sezione trasversale e la capacità di produrre forza4. I modelli esistenti di PRT nei roditori includono l'arrampicata su scala con resistenza applicata alla coda, la co-contrazione dei muscoli agonisti contro la resistenza degli antagonisti, la corsa con un'imbracatura appesantita, un esercizio accovacciato suscitato da una scossa elettrica e la resistenza alla corsa delle ruote 5,6,7,8,9,10 (recensito in pubblicazioni precedenti 11,12 ). Tuttavia, attualmente non ci sono strumenti di ricerca per eseguire con precisione PRT mirata ai muscoli e aggiustata per il dosaggio nei topi che assomigliano molto ai metodi e ai dispositivi PRT utilizzati nella ricerca clinica umana e nella pratica12,13. Ciò limita la capacità dei ricercatori di studiare la sicurezza e l'efficacia del PRT dosato con precisione negli studi di base e preclinici nei topi.

Per superare questa barriera, in questo studio vengono sviluppati una metodologia e un dispositivo PRT basati sui progetti di circuiti a fune-puleggia impiegati nelle attrezzature per l'allenamento di resistenza nelle moderne palestre14,15,16. Questo metodo di PRT è indicato come allenamento di resistenza regolato dal dosaggio (DART) e il dispositivo è chiamato dispositivo DART. Oltre alla sua funzionalità come strumento di allenamento per la riabilitazione di precisione, il dispositivo DART può anche essere utilizzato come strumento autonomo per valutare oggettivamente la coppia contrattile concentrica massima che può essere generata dal muscolo tibiale anteriore (TA) in un topo, in modo simile a come viene valutato nell'uomo il massimo di una ripetizione (1RM, il carico massimo che può essere sollevato / spostato / premuto / accovacciato con successo solo una volta mantenendo una buona forma)17, 18. Il dispositivo DART può anche essere accoppiato con un dinamometro isocinetico personalizzato o commerciale per misurare la forza tetanica isometrica di picco prodotta dal muscolo TA in un topo (paragonabile alla massima contrazione volontaria [MVC] nell'uomo) e quindi eseguire PRT regolato dal dosaggio con una resistenza basata sulla forza tetanica di picco (ad esempio, 50% della forza di picco).

Questo articolo descrive la costruzione del dispositivo DART e spiega come può essere accoppiato con un dinamometro personalizzato, che è stato descritto nelle pubblicazioni precedenti 19,20,21,22, per valutare la coppia contrattile ed eseguire DART. Lo studio descrive anche come il dispositivo DART è stato utilizzato per confrontare il danno muscolare indotto dall'esercizio causato da un singolo attacco di DART (4 serie di 10 contrazioni concentricamente distorte con 50% 1RM) con danni causati da un attacco comparabile di contrazioni isometriche (4 serie di 10 contrazioni isometriche) in un modello murino di distrofia muscolare dei cingoli di tipo 2B (LGMD2B, o LGMDR2)23,24. Il modello murino studiato manca di una proteina chiamata disferlina, che svolge un ruolo importante nella protezione del muscolo scheletrico dal danno muscolare a insorgenza ritardata a seguito di contrazioni eccentriche dannose 22,25,26,27,28,29,30 . È stato anche dimostrato in topi maschi carenti di disferlina che l'esercizio forzato concentricamente distorto non è così dannoso come l'esercizio forzato eccentricamente distorto e che l'esposizione precedente all'allenamento concentricamente distorto offre protezione contro le lesioni da un successivo attacco di contrazioni eccentricamente distorte22. Poiché l'attuale studio è stato condotto per testare la fattibilità dell'attuale metodologia DART e del dispositivo nell'esecuzione di un allenamento di resistenza aggiustato in base al dosaggio e con distorsioni concentriche, sono stati scelti topi maschi carenti di disferlina per l'indagine per confrontare i nuovi dati del dispositivo DART con i dati precedenti. In studi futuri, topi BLAJ femmina saranno inclusi per studiare l'effetto del sesso come variabile biologica in relazione alla risposta alla DART. I topi che avevano ~ 1,5 anni sono stati studiati poiché hanno già cambiamenti distrofici in molti gruppi muscolari e, quindi, modellano lo stato fisiopatologico in cui i muscoli potrebbero essere in pazienti che hanno già debolezza muscolare e deperimento e stanno cercando cure riabilitative per mantenere la massa muscolare e la forza26.

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Protocollo

Gli esperimenti descritti in questo articolo sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso la Wayne State University, Detroit, Michigan, USA, in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (1996, pubblicato da National Academy Press, 2101 Constitution Ave. NW, Washington, DC 20055, USA). B6. Topi A-Dysfprmd / GeneJ (a.k.a. topi BLAJ, maschi, ~ 1,5 anni) che modello LGMD2B / R2 sono stati utilizzati per il presente studio. I topi sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali).

1. Disegno dello studio

  1. Scegliere ceppi di topo pertinenti alle domande di ricerca, ad esempio lo studio B6. Topi A-Dysfprmd / GeneJ (topi BLAJ) se si cerca di rispondere alla domanda se la DART concentricamente distorta induca o meno danni muscolari diffusi nei topi che modellano LGMD2B / R2.
  2. Assegnare i topi ai gruppi di studio in base al disegno dello studio, ad esempio, assegnare in modo casuale i topi a un gruppo di allenamento di resistenza aggiustato per il dosaggio (DART) o a un gruppo di allenamento isometrico (ISOM) e tentare di bilanciare i gruppi nel miglior modo possibile in base alla corrispondenza per cucciolata e / o età (ad esempio, Tabella 1).

2. Fabbricazione del dispositivo DART

  1. Progettare i componenti del dispositivo DART con un software CAD (computer-aided) adatto (Figura 1) seguendo i passaggi seguenti.
    1. Alloggiamento di progettazione per cuscinetti ruota a basso attrito (vedere la tabella dei materiali, basata sul design del cuscinetto del blocco cuscino) con un goniometro incorporato (da utilizzare come goniometro per misurare gli angoli dell'articolazione della caviglia).
    2. Progettare una torre per l'alloggiamento dei cuscinetti ruota e un goniometro.
    3. Progettare una pedana per posizionare il piede del mouse. Progettare un asse per collegare la pedana al cuscinetto della ruota.
  2. Fabbricare i componenti del dispositivo DART con una stampante 3D adatta (Figura 1).
    1. Salvare i disegni creati con software CAD come stereolitografia (. STL).
      NOTA: . I file STL (Supplementary Coding Files 1-4) possono essere utilizzati e modificati dando credito all'autore corrispondente di questo articolo e citando questo articolo.
    2. Aprire . STL con un software di slicing adatto (vedi Tabella dei materiali).
      NOTA: il software di slicing converte un modello 3D virtuale in una pila di sezioni, che possono essere stampate in sequenza da una stampante 3D per generare un oggetto 3D.
    3. Con il software di slicing, generare G-CODE computer-aided manufacturing (CAM, . GCODE), che sono specifici per la stampante 3D e il filamento che verrà utilizzato.
    4. Seguire il manuale della stampante 3D (vedere Tabella dei materiali) per stampare i componenti del dispositivo DART con . GCODE.
    5. Scegliere un filamento di stampante 3D appropriato, ad esempio acido polilattico (PLA) 1,75 mm 1 kg/bobina, grigio (vedere Tabella dei materiali).
  3. Assemblare il dispositivo DART seguendo i passaggi seguenti.
    1. Inserire un cuscinetto ruota 608 a basso attrito (diametro foro 8 mm, diametro esterno 22 mm, come uno con sfere ceramiche in nitruro di silicio alloggiate in acciaio inossidabile 420, vedere Tabella dei materiali) nell'alloggiamento del cuscinetto ruota (Figura 1).
    2. Inserire l'asse nel foro del cuscinetto della ruota (figura 1).
    3. Incollare la pedana sull'asse con colla (vedi Tabella dei materiali) adatta per incollare PLA (Figura 1).
    4. Posizionare l'alloggiamento del cuscinetto ruota sopra la torre di alloggiamento del cuscinetto ruota e fissare l'intero gruppo a una base acrilica con elementi di fissaggio a vite (Figura 1).
      NOTA: non ci sono requisiti di dimensioni specifici per la base acrilica: deve solo essere abbastanza grande da ospitare l'animale e il dispositivo DART e abbastanza piccola da adattarsi a una superficie di lavoro. La base acrilica utilizzata per il presente studio è larga circa 30 cm, lunga 45 cm e spessa 0,5 cm.

3. Preparazione di topi per DART o ISOM

  1. Porre ogni topo in anestesia generale con isoflurano inalato erogato attraverso un adeguato sistema di anestesia (vedi Tabella dei materiali, 2% -5% per l'induzione; 1% -4% per il mantenimento; per effetto) per ridurre lo stress e il dolore.
    1. Indurre l'anestesia nella camera di induzione del sistema di anestesia (isoflurano 2% -5%).
    2. Trasferire il topo su un cono nasale per mantenere l'anestesia durante l'esecuzione di procedure sull'animale (isoflurano 1% -4%). Confermare l'efficacia dell'anestesia in base alla mancanza di ritiro degli arti posteriori a un pizzico del piede da un paio di pinzette.
    3. Fornire supporto termico, ad esempio con una piastra riscaldante in gel isotermico e una lampada termica posizionata ~ 1 m sopra il mouse. Controllare con un termometro per assicurarsi che la temperatura sopra e intorno alla base acrilica sia mantenuta a ~ 38 ° C, in modo che il mouse non si surriscaldi.
  2. Preparare la pelle sopra il muscolo tibiale anteriore sinistro (TA) del topo e su tutti gli aspetti anteriori e laterali dell'arto posteriore sinistro per DART o ISOM.
    1. Rimuovere la pelliccia del topo con una crema depilatoria (crema depilatoria, vedere Tabella dei materiali). Applicare la crema depilatoria e lasciarla agire per ~ 2 min.
    2. Pulire la coscia con salviette imbevute di acqua distillata per rimuovere il pelo e tutta la crema residua dalla pelle. Le creme depilatorie possono irritare e/o danneggiare la pelle se lasciate sulla pelle del topo per lunghi periodi e, quindi, rimuovere completamente.
    3. Dopo la rimozione del pelo, disinfettare la pelle con un metodo di lavaggio approvato, ad esempio con una soluzione di lavaggio allo iodio povidone e etanolo al 70%.
  3. Applicare un protettivo (ad es. petrolato) sugli occhi e sulla pelle depilata con un batuffolo di cotone pulito per proteggere gli occhi e la pelle depilata dall'essiccazione.
  4. Posizionare un perno stabilizzatore attraverso la metafisi tibiale.
    1. Applicare la crema al 5% di lidocaina sulla tibia per intorpidire l'area.
    2. Passare un ago ipodermico sterile da 26 G, mezzo pollice, attraverso la parte più ampia della porzione prossimale dell'osso tibiale (cioè la metafisi tibiale, nota anche come testa tibiale). Una volta fissato il perno stabilizzatore, rimuovere la parte di plastica dell'ago ipodermico tenendo l'ago con un emostato sterile e piegando la parte di plastica fino a quando non si rompe.
  5. Posizionare il mouse per l'addestramento DART o ISOM.
    1. Appoggiare il mouse in posizione supina. Assicurarsi che il mouse sia ancora saldamente collegato al cono del naso per mantenere l'anestesia.
    2. Con un paio di pinzette con punta sterile, inserire il perno tibiale in una clip a coccodrillo metallico (vedi Tabella dei materiali), in modo che le estremità del perno tibiale siano trattenute dal morsetto a coccodrillo. Spostare il braccio regolabile del morsetto a coccodrillo per assicurarsi che il piede del mouse sia posizionato sulla pedana del dispositivo DART.
    3. Allacciare il piede del mouse alla pedana del dispositivo DART con nastro adesivo da laboratorio.
    4. Posizionare il piede del mouse con un angolo di 90° rispetto all'asse lungo dell'osso tibiale del topo. Se posizionato correttamente, la pedana sarà perpendicolare alla base acrilica (cioè il pavimento o quello che è considerato il piano orizzontale).
    5. Appoggiare la pedana sull'arresto della flessione plantarflesso creato posizionando un ago ipodermico lungo 18 G, 1,5 attraverso i fori preforati sul goniometro del dispositivo DART (Figura 1).

4. Formazione DART o ISOM

  1. Ottimizzare il posizionamento dell'elettrodo posizionando un elettrodo di stimolazione elettrica neuromuscolare bipolare, transcutanea (NMES, vedi Tabella dei materiali) sull'aspetto inferolaterale dell'articolazione del ginocchio del topo (Figura 1B).
    1. Con impulsi singoli (1 Hz) da uno stimolatore elettrico di laboratorio (vedi Tabella dei materiali), stimolare il ramo fibulare del nervo sciatico, che fornisce l'innervazione motoria ai muscoli dorsiflexori della caviglia (Figura 1B).
    2. Poiché il muscolo tibiale anteriore (TA) rappresenta oltre il 90% della forza contrattile totale prodotta dai muscoli dorsifltori della caviglia31, osservare la pancia e il tendine del muscolo TA per evidenziare contrazioni a contrazione elettricamente indotte.
      NOTA: Una leggera prominenza ossea che corrisponde all'osso del perone potrebbe aiutare con il posizionamento dell'elettrodo se il tester può sentirlo attraverso l'elettrodo. Ciò richiede un po 'di pratica e apprendimento da parte del tester per avere un'idea del posizionamento ottimale degli elettrodi.
    3. Spostare l'arresto della flessione plantarflesso sul foro sul goniometro che corrisponde a 20° di flessione plantarflessione dalla posizione in cui il piede è ortogonale (90°) alla tibia - questa è la posizione in cui la coppia contrattile massima dal muscolo TA è tipicamente osservata sulla base dei rapporti precedenti21. Questo potrebbe dover essere personalizzato dall'utente in base a fattori specifici per i topi che vengono studiati.
    4. Visualizza la coppia di contrazione con un dinamometro per mouse collegando la pedana del dispositivo DART alla pedana del dinamometro, ad esempio, collega la pedana del dispositivo DART a una pedana del banco dinamometrico robotico alla caviglia costruita su misura con una sutura di seta non elastica (simile alla Figura 1A) e allaccia la sutura alla pedana del dinamometro (vedi Tabella dei materiali).
      NOTA: la pedana ha fori integrati nel progetto di stampa 3D. Posizionando la sutura attraverso la coppia di fori che si trovano nella seconda fila dall'estremità della punta della pedana si ottiene la sutura a ~ 20 mm dall'asse di dorsiflessione / plantarflessione (Figura 1A, B). Il dinamometro è stato descritto nelle precedenti relazioni 19,20,21,22.
  2. Ottimizzare l'uscita di tensione dallo stimolatore NMES.
    1. Dopo aver ottimizzato il posizionamento dell'elettrodo, ottimizzare l'ampiezza della tensione in uscita dallo stimolatore elettrico: questo è necessario per limitare NMES al nervo fibulare comune e al muscolo TA e ridurre il rischio di provocare co-contrazioni nei flessori plantari.
      NOTA: Se le co-contrazioni sono suscitate, possono essere visualizzate attraverso l'uscita di coppia dal dinamometro e anche essere viste nella flessione plantare delle dita dei piedi.
  3. Impostare lo stimolatore NMES per l'allenamento DART o ISOM.
    NOTA: le seguenti impostazioni potrebbero dover essere personalizzate dall'utente in base a fattori specifici dei topi oggetto di studio e allo scopo degli studi.
    1. Impostare lo stimolatore per produrre treni di impulsi ripetuti che hanno una frequenza di 125 Hz - questa frequenza produce contrazioni tetaniche fuse massime senza overflow di NMES in altri gruppi muscolari nei topi BLAJ21. A tale scopo, regolare i quadranti per la frequenza degli impulsi (125 Hz), la durata del treno (500 ms) e i treni al secondo (1 treno/s) e accendere l'interruttore a levetta per i treni a impulsi ripetuti.
    2. Impostare lo stimolatore per produrre treni di impulsi di 500 ms di durata intervallati da 500 ms di riposo tra i treni di impulsi.
    3. Spostare l'arresto della plantarflessione sul foro sul goniometro che corrisponde a 160° all'asse lungo della tibia (70° di flessione plantare dal piede ortogonale alla tibia). Questa è la posizione in cui il piede del topo BLAJ può essere spostato passivamente senza resistenza dei tessuti molli21.
    4. Per DART, applicare una resistenza adeguata contro la quale il muscolo TA deve lavorare concentricamente, ad esempio 5 g come mostrato in Figura 1A, B; vedere la curva di calibrazione peso/coppia nel file supplementare 1.
    5. Applicare resistenza appendendo il peso con una sutura di seta non elastica legata alla pedana del dispositivo DART (Figura 1A, B).
    6. Regolare la resistenza - cioè, applicare ~ 50% del massimo di una ripetizione (1RM) (ad esempio, 5 g se il mouse può sollevare un peso massimo di 10 g con una singola contrazione), che tira il piede attraverso almeno la metà della gamma attiva disponibile di dorsiflessione.
    7. Eseguire un adeguato allenamento DART nei topi assegnati al gruppo DART - ad esempio, eseguire un singolo attacco di allenamento DART, che comporta quattro serie di 10 ripetizioni di contrazioni concentriche con 2 minuti di riposo tra le serie, simile ai programmi di allenamento di resistenza progressiva utilizzati negli esseri umani32 (vedi Video supplementare 1).
    8. Eseguire un adeguato addestramento ISOM nei topi assegnati al gruppo ISOM - ad esempio, eseguire un singolo attacco di allenamento ISOM, che comporta quattro serie di 10 ripetizioni di contrazioni isometriche con 2 minuti di riposo tra le serie, simile a DART (vedi Video supplementare 2).
    9. Per l'allenamento ISOM, posizionare il piede del mouse a 160° rispetto all'asse lungo della tibia (flessione plantare di 70° dal piede ortogonale alla tibia) e mantenere questa posizione statica fissando la sutura di seta alla pedana del dinamometro robotico.
      NOTA: Poiché la sutura non può scorrere, la pedana del dispositivo DART non può spostarsi in dorsiflessione, costringendo così i flessori dorsiflexor a contrarsi isometricamente.

5. Assistenza post-procedurale per i topi

  1. Prendere precauzioni per mantenere una corretta igiene dell'arto posteriore esercitato e ridurre il dolore al sito dell'ago.
    1. Dopo l'allenamento DART o ISOM, rivestire la porzione visibile del perno tibiale con un triplo unguento antibiotico (400 U / g di bacitracina, 3,5 mg / g di neomicina e 5000 U / g di polimixina-B, vedi Tabella dei materiali) e quindi ritirare con attenzione il perno dal lato mediale della tibia. Risciacquare la pelle sulla coscia laterale e sulla parte superiore della gamba con iodio povidone e acqua sterile. Applicare la crema al 5% di lidocaina sulla tibia per controllare il dolore del sito dell'ago.
  2. Consentire ai topi di riprendersi dall'anestesia.
    1. Rimuovere il mouse dal cono del naso e lasciarlo recuperare dall'anestesia in una gabbia di recupero priva di lettiera. Fornire supporto termico al topo mentre si riprende dall'anestesia, ad esempio con una piastra riscaldante isotermica in gel.
  3. Riportare il topo nella sua gabbia originale dopo che si è completamente ripreso dall'anestesia. Quindi, riportare la gabbia nella struttura per animali, dove sono alloggiati i topi di studio fino a quando non vengono eseguiti esperimenti di follow-up. Monitorare i topi ogni giorno.

6. Raccolta dei tessuti

  1. Raccogliere il muscolo TA del topo nella sua interezza e congelare a scatto per la crioconservazione seguendo i passaggi seguenti.
    1. Sulla base delle domande di ricerca, in un momento opportuno dopo l'addestramento (ad esempio, 3 giorni dopo DART o ISOM), eutanasia i topi secondo protocolli approvati.
      NOTA: Per il presente studio, i topi sono stati eutanizzati per dislocazione cervicale in anestesia generale (isoflurano inalatorio, 2% -5% ad effetto). La toracotomia bilaterale ha assicurato la morte.
    2. Sezionare gli arti posteriori del topo per rimuovere il muscolo TA esercitato (a sinistra) e il muscolo TA non esercitato (a destra). Pesare i muscoli raccolti. Quindi, immergere ogni muscolo in olio minerale per la crioprotezione e posizionare il muscolo su una salvietta di laboratorio pulita per asciugare l'olio in eccesso21.
  2. Posizionare il muscolo su un pezzo di foglio di alluminio. Tenere il bordo della pellicola con un emostatico lungo e immergere rapidamente la lamina e il muscolo in azoto liquido contenuto in un contenitore di plastica adatto per congelare il muscolo.
    1. Dopo circa 2 minuti di immersione in azoto liquido, trasferire il muscolo congelato in fiale criogeniche marcate. Conservare i flaconcini in un congelatore a -80 °C fino a quando necessario per ulteriori studi.

7. Studi istologici sul tessuto muscolare

  1. Preparare sezioni di criostato del muscolo TA che hanno uno spessore di 5 μm. Raccogliere sezioni di criostato su vetrini da microscopio carichi. Fissare le sezioni con acetone che viene mantenuto freddo a -30 ° C e lasciare asciugare le sezioni all'aria.
  2. Colorare le sezioni del tessuto muscolare con ematossilina seguita da eosina (colorazione H & E, vedi Tabella dei materiali).
    1. Immergere le sezioni per 5 minuti in ematossilina (colorazione nucleare blu scuro) in un barattolo di vetro colorante. Rimuovere l'ematossilina in eccesso risciacquando le sezioni con acqua di rubinetto fino a quando non si vede ulteriore bluificazione di acqua.
    2. Immergere le sezioni per 5 minuti nel reagente bluante in un barattolo di vetro. Aspirare il reagente bluante in eccesso dalle sezioni con una pipetta di aspirazione in vetro.
    3. Immergere le sezioni per 5 minuti in eosina (colorazione citoplasmatica rosa) in un barattolo di vetro colorante. Rimuovere l'eosina in eccesso immergendo le sezioni rapidamente e ripetutamente (~ 10 volte) in etanolo al 95% in un barattolo di vetro colorante.
    4. Lasciare asciugare le sezioni all'aria e procedere alla visualizzazione al microscopio ottico.
  3. Preparare immagini piastrellate ad alta risoluzione di intere sezioni trasversali muscolari TA attraverso l'imaging al microscopio.
    NOTA: l'utente potrebbe dover personalizzare le fasi di imaging e analisi delle immagini che seguono in base al microscopio e al software di acquisizione e analisi delle immagini.
    1. Cattura immagini digitali con l'obiettivo 10x di un microscopio ottico e una fotocamera digitale montata sul microscopio.
    2. Cattura circa 15-20 immagini, muovendoti lungo la sezione trasversale di ciascun muscolo in modo simile a una griglia, in modo tale che ogni nuova immagine si sovrapponga ~ 25% con l'immagine precedente.
      NOTA: questo processo consente di acquisire una serie di immagini che possono essere affiancate digitalmente (noto anche come cucitura di immagini) per creare un'immagine composita ad alta risoluzione dell'intera sezione trasversale muscolare TA (Figura 2).
    3. Salvare le immagini digitali in formato . Formato TIFF.
    4. Aprire le immagini digitali con un software di elaborazione e analisi delle immagini adatto (vedi Tabella dei materiali).
    5. Affiancare o cucire singole immagini in un'immagine composita dell'intero muscolo TA attraverso i seguenti passaggi: con tutte le singole immagini sovrapposte di ciascun muscolo TA aperte nel software, fare clic su File > selezionare Automatizza > selezionare Photomerge > selezionare collage > selezionare Aggiungi file aperti > fare clic su OK.
    6. Quando viene preparata e visualizzata una nuova immagine piastrellata/cucita del muscolo TA, salvare l'immagine in . TIFF per ulteriori analisi.
  4. Quantificare il danno muscolare mediante analisi visiva nelle immagini piastrellate dell'intero muscolo TA con un software di analisi delle immagini adatto.
    1. Nel software di analisi delle immagini, selezionare la funzione Misura nel menu Analizza per delineare e misurare l'area dell'intera sezione trasversale del muscolo TA (Figura 2).
    2. Nel software di analisi delle immagini, selezionare la funzione Misura nel menu Analizza per delineare e misurare le aree di ciascun muscolo TA che sono danneggiate, cioè aree che mostrano interruzione citoplasmatica delle fibre muscolari, fibre muscolari assenti e infiltrazione cellulare infiammatoria22 (Figura 2).
    3. Esprimere la somma dell'area totale del danno come percentuale dell'intera area della sezione trasversale del muscolo TA (Figura 2, Tabella 2).

8. Analisi statistiche

  1. Organizzare i dati come mostrato nelle Tabelle 1-3 ed eseguire test T non accoppiati (se vengono superati test di normalità e varianze omogenee)33 o test di Mann-Whitney Rank Sum (se i test di normalità e varianze omogenee non vengono superati)21 con software adatto (vedi Tabella dei materiali).

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Risultati

Sono stati studiati topi maschi BLAJ, che avevano ~ 1,5 anni di età. I topi BLAJ modellano la malattia muscolare umana, LGMD2B / R2. Questi topi sono particolarmente suscettibili al danno muscolare a insorgenza ritardata da un singolo attacco di contrazioni muscolari eccentriche22,29. I topi BLAJ sono stati, quindi, scelti per questi studi per imparare se la DART potesse essere eseguita in modo non dannoso regolando con precisione la resistenza contro cui il musc...

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Discussione

Questo articolo presenta istruzioni dettagliate su come costruire un dispositivo per eseguire un tipo di allenamento di riabilitazione di precisione chiamato allenamento di resistenza aggiustato dal dosaggio (DART). Il lavoro descrive anche l'applicazione del dispositivo DART e la metodologia in uno studio di allenamento per confrontare il danno muscolare 3 giorni dopo un singolo attacco di DART (gruppo DART) con il danno 3 giorni dopo un attacco comparabile di allenamento isometrico (gruppo ISOM).

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Questo studio è stato finanziato da sovvenzioni della Jain Foundation Inc., R03HD091648 da NICHD, una sovvenzione pilota da AR3T sotto NIH P2CHD086843, un premio FRAP da EACPHS presso la Wayne State University, un pacchetto di avvio della facoltà dalla Wayne State University e un subcontratto da 1R01AR079884-01 (Peter L. Jones PI) a JAR. Questo studio è stato anche finanziato da una borsa di ricerca dell'American Physical Therapy Association - Michigan (APTA-MI) a JMB, MEP e JAR. Gli autori riconoscono la dott.ssa Renuka Roche (professore associato, Eastern Michigan University, MI) per aver letto criticamente il manoscritto e fornito feedback. Gli autori riconoscono il signor Anselm D. Motha per i consigli sulla stampa 3D. Gli autori ringraziano i pazienti con disferlinopatie che hanno condiviso le loro storie sul sito web della Jain Foundation a https://www.jain-foundation.org/patient-physician-resources/patient-stories, in particolare le loro esperienze con l'esercizio fisico.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
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AnMiao Star 608 Cuscinetto a sfere in ceramicaAnmiao Star (N/A)AMS127Cuscinetto ruota ad alta precisione e basso attrito. Se la marca e il modello non sono disponibili in commercio, una versione alternativa di un cuscinetto ruota 608 a basso attrito, diametro foro 8 mm,  22 mm di diametro esterno, con sfere in ceramica di nitruro di silicio in alloggiamento in acciaio inossidabile 420 dovrebbero essere sufficienti. L'attrito eccessivo nel cuscinetto della ruota influirà negativamente sulle prestazioni del dispositivo DART e aumenterà la resistenza complessiva alle contrazioni muscolari.
Axio Scope.A1 microscopioCarl Zeiss (Peabody, MA)Prodotto #Axio Scope.A1Microscopio a luce e fluorescenza
B6. A-Dysfprmd/GeneJ (alias topi BLAJ)The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).  Colonia speciale gestita da The Jain Foundation Inc. per i collaboratori che studiano la disferlina.Stock #012767Topi carenti di disferlina che modellano la distrofia muscolare dei cingoli umani di tipo 2B/R2.
Elettrodo bipolare, transcutaneo, di stimolazione elettrica neuromuscolare (NMES)Harvard Apparatus, Holliston, MABS4 50– 6824Elettrodo per NMES. Se questo elettrodo non è disponibile in commercio, contattare l'autore corrispondente per trovare alternative.
Coplin Staining DishThermoFisher (Waltham, MA)Codice prodotto: S17495Piatto/barattolo di colorazione per ematossilina ed eosina (H& E) colorazione di sezioni
Cura 4.4.1. SoftwareUltimaker, Utrecht, Paesi BassiUltimaker Cura 4.4.1.Software di slicing per convertire i file stereolitografici in file G-CODE
Termoforo in gel isotermico DeltaphaseBraintree Scientific (Braintree, MA)Articolo #39DPTermoforo per fornire supporto termico agli animali durante l'anestesia
Eosin YMillipore Sigma (Burlington, MA)HT110132-1LColorazione citoplasmatica rosa
Gorilla Super GlueThe Gorilla Glue Company (Cincinnati, OH)Gorilla Super Glue Micro Adesivocianoacrilato preciso per incollare componenti in PLA
Soluzione di ematossilina, Gill No.3Millipore Sigma (Burlington, MA)GHS332-1LColorazione blu scuro per nuclei
HM525NX criostatoThermoFisher (Waltham, MA)Catalogo #HM525NXCriostato per realizzare sezioni congelate di salviette da
laboratorio muscolari. Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Tergicristalli per attività delicate, 1 stratoThermoFisher (Waltham, MA)Codice prodotto: 06-666.  Produttore #34120Salviette da laboratorio per tamponare l'olio minerale dal tessuto muscolare prima del congelamento rapido e per altri scopi.
Labview 2014National Instruments, Austin, Texas, USALabview 2014Software per programmi/routine personalizzati che azionano il dinamometro e attivano lo stimolatore NMES.
Fiasche Dewar in HDPE ad azoto liquidoThermoFisher (Waltham, MA)S34074B.  Thermo Scientific 41502000/EMDPallone per contenere azoto liquido per il congelamento a scatto del muscolo o di altri tessuti
Crema depilatoria magicaSoftsheen Carson (New York, NY)N/ACrema depilatoria senza rasoio
Clip a coccodrillo in metalloJINSHANGTOPK (attività basata sul web)24 pezzi Morsetti a molla con clip a coccodrillo in metallo da 51 mm Morsettoa molla per tenere il perno tibiale
Diapositive MicrscopeGlobe Scientific (Mahwah, NJ)1354W. Vetrini in vetro bianco diamantatoVetrini per microscopio caricati
Olio mineraleThermoFisher (Waltham, MA)BP26291Olio minerale per crioproteggere il tessuto muscolare prima del congelamento a scatto
Monoprice Premium Stampante 3D Filamento PLAMonoprice (Rancho Cucamonga, CA)#11778Filamento per stampante 3D premium PLA 1,75 mm 1 kg / bobina, grigio. Questo è il materiale utilizzato per stampare in 3D i componenti del dispositivo.
Monoprice Select Stampante 3D Mini V2Monoprice (Rancho Cucamonga, CA)Stampante 3D Mini V2 3Dper la fabbricazione assistita da computer di componenti di dispositivi.
Software di immagine NIHInstritues of Health (NIH, Bethesda, MD)Immagine NIH per WindowsSoftware di elaborazione e analisi delle immagini utilizzato per quantificare l'area del danno muscolare. NIH Image è anche conosciuta come Image J.
Photoshop CS4Adobe (San Jose, CA)Creative Suite (CS4). Versione a 64 bit per WindowsSoftware di elaborazione e analisi delle immagini utilizzato per generare immagini piastrellate/cucite dell'intera sezione trasversale muscolare da immagini di singoli campi sovrapposti
Unità di isolamento per stimolazione PSIU6Grass Instruments (West Warwick, RI)Unitàdi isolamento PSIU6Unità di isolamento per NMES. Gli stimolatori, come il modello 4100 di A-M, sono dotati di un'unità di isolamento di stimolazione incorporata
Roboz 4-0 materiale di sutura intrecciato nero di setaRoboz Surgical (Gaithersburg, MD)RobozSurgical SUT152Materiale di sutura per collegare la pedana del dispositivo DART alla pedana del dinamometro o alla resistenza per l'allenamento di resistenza
Stimolatore a impulsi quadrati S48Grass Instruments (West Warwick, RI)StimolatoreS48Stimolatore elettrico da laboratorio per NMES .  Se questo stimolatore non è disponibile in commercio, lo stimolatore ad alta potenza isolato modello 4100 di A-M systems potrebbe essere un'alternativa. Si prega di contattare il co-autore Jones per ulteriori informazioni.
Scott' s reagente bluingRicca Chemical Company (Arlington, TX)6697-32Soluzione bluing che intensifica la colorazione nucleare con ematossilina
SigmaStat versione 3.5Systat Software (San Jose, CA)SigmaStat versione 3.5Pacchetto software statistico per analisi statistiche
Vaporizzatore da tavolo per isofluranoVetEquip (Livermore, CA)Articolo #901801Sistema
di anestesia da tavolo per via inalatoriaUnguento di primo soccorso antibiotico triplo GlobalHealth Products (attività con sede a parti)Unguento di primo soccorso antibiotico triplo Globe, 1 oz (confezione da 2) Unguento antibiotico di primo soccorso Unguentoantibiotico applicato sul perno tibiale come parte dell'assistenza post-procedurale
National

Riferimenti

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