In vitro  Modello enteroide apical-out di enterocolite necrotizzante

Kathryn Burge; Adam Wilson; Hala Chaaban

doi:10.3791/64003

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Articolo metodologico

In vitro Modello enteroide apical-out di enterocolite necrotizzante

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DOI:

10.3791/64003

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8 giugno 2022

Kathryn Burge¹ , Adam Wilson¹ , Hala Chaaban¹

¹Department of Pediatrics, Division of Neonatal-Perinatal Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center and Center for Pregnancy and Newborn Health

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un modello di enterocolite necrotizzante apicale (NEC) in un piatto che utilizza enteroidi intestinali piccoli con polarità invertita, consentendo l'accesso alla superficie apicale. Forniamo un protocollo di colorazione immunofluorescente per rilevare l'interruzione epiteliale correlata al NEC e un metodo per determinare la vitalità degli enteroidi apicali-out sottoposti al protocollo NEC-in-a-dish.

Abstract

L'enterocolite necrotizzante (NEC) è una malattia devastante che colpisce i neonati pretermine, caratterizzata da infiammazione intestinale e necrosi. Gli enteroidi sono recentemente emersi come un sistema promettente per modellare le patologie gastrointestinali. Tuttavia, i metodi attualmente utilizzati per la manipolazione enteroide non hanno accesso alla superficie apicale dell'epitelio (tridimensionale [3D]) o richiedono molto tempo e risorse (monostrati bidimensionali [2D]). Questi metodi spesso richiedono passaggi aggiuntivi, come la microiniezione, affinché il modello diventi fisiologicamente traducibile. Qui, descriviamo un protocollo fisiologicamente rilevante e poco costoso per studiare NEC in vitro invertendo la polarità enteroide, con conseguente superficie apicale rivolta verso l'esterno (apical-out). Viene inoltre fornito un protocollo di colorazione immunofluorescente per esaminare l'integrità della barriera enteroide e l'espressione proteica giunzionale in seguito all'esposizione al fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α) o al lipopolisaccaride (LPS) in condizioni normossiche o ipossiche. Viene inoltre valutata la vitalità di enteroidi 3D apical-out esposti a LPS normossici o ipossici o TNF-α per 24 ore. Gli enteroidi esposti a LPS o TNF-α, in combinazione con ipossia, hanno mostrato un'interruzione dell'architettura epiteliale, una perdita di espressione della proteina di giunzione aderente e una riduzione della vitalità cellulare. Questo protocollo descrive un nuovo modello apical-out NEC-in-a-dish che presenta una piattaforma fisiologicamente rilevante ed economica per identificare potenziali bersagli epiteliali per le terapie NEC e studiare la risposta intestinale pretermine alle terapie.

Introduzione

L'enterocolite necrotizzante (NEC), una grave malattia infiammatoria dell'intestino tenue che si verifica fino al 10% dei neonati pretermine, è comunemente associata ad elevata morbilità e mortalità ^1,2. I tassi di mortalità che si avvicinano al 50% nei neonati con peso alla nascita molto basso (<1500 g), che richiedono un intervento chirurgico, non sono rari³. Mentre l'esatta eziologia di NEC non è attualmente compresa, si ritiene che i fattori di rischio, come l'alimentazione artificiale, si aggravino con anomalie fisiologiche, come la disbiosi, un epitelio intestinale immaturo e una ....