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Articolo metodologico

Applicazione coerente della spettroscopia Raman anti-Stokes (CARS) per l'imaging della mielinizzazione nelle fette di cervello

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DOI:

10.3791/64013

⸱

22 luglio 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Integrative Biology, Oklahoma State University, 2Department of Physiology and Biophysics, University of Colorado Anschutz, 3Advanced Light Microscopy Core, University of Colorado Anschutz

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Visualizzare la mielinizzazione è un obiettivo importante per molti ricercatori che studiano il sistema nervoso. CARS è una tecnica compatibile con l'immunofluorescenza in grado di visualizzare nativamente i lipidi all'interno di tessuti come il cervello illuminando strutture specializzate come la mielina.

Abstract

La spettroscopia coerente anti-Stokes Raman (CARS) è una tecnica classicamente impiegata da chimici e fisici per produrre un segnale coerente delle vibrazioni delle molecole. Tuttavia, queste firme vibrazionali sono anche caratteristiche delle molecole all'interno del tessuto anatomico come il cervello, rendendolo sempre più utile e applicabile per le applicazioni delle neuroscienze. Ad esempio, CARS può misurare i lipidi eccitando specificamente i legami chimici all'interno di queste molecole, consentendo la quantificazione di diversi aspetti del tessuto, come la mielina coinvolta nella neurotrasmissione. Inoltre, rispetto ad altre tecniche tipicamente utilizzate per quantificare la mielina, CARS può anche essere impostato per essere compatibile con le tecniche immunofluorescenti, consentendo la co-etichettatura con altri marcatori come i canali del sodio o altri componenti della trasmissione sinaptica. I cambiamenti della mielinizzazione sono un meccanismo intrinsecamente importante nelle malattie demielinizzanti come la sclerosi multipla o altre condizioni neurologiche come la sindrome dell'X fragile o i disturbi dello spettro autistico è un'area emergente di ricerca. In conclusione, CARS può essere utilizzato in modi innovativi per rispondere a domande urgenti nelle neuroscienze e fornire prove dei meccanismi sottostanti legati a molte diverse condizioni neurologiche.

Introduzione

I potenziali d'azione sono l'unità di base dell'informazione nel cervello e la propagazione del potenziale d'azione attraverso gli assoni costituisce un pilastro dell'elaborazione delle informazioni 1,2,3. I neuroni ricevono tipicamente input afferenti da più altri neuroni e integrano questi input all'interno di una data finestra temporale ristretta 4,5. Pertanto, i meccanismi di propagazione del potenziale d'azione negli assoni hanno ricevuto una notevole attenzione da parte degli investigatori.

Quando si propaga attraverso un assone, un potenziale d'azione viene rigenerato ripetutamente lungo l'assone per garantire una propagazione affidabile6. Nella maggior parte dei neuroni dei vertebrati mascellari (gnatostomi) gli assoni sono circondati da una guaina di mielina, che è una sostanza ricca di lipidi prodotta dagli oligodendrociti vicini o dalle cellule di Schwann, che sono tipi di cellule gliali (rivisto in 7,8). Questa guaina mielinica isola elettricamente l'assone, riducendone la capacità e consentendo la propagazione del potenziale d'azione in modo efficiente, rapido e con un minor consumo di energia. La mielina non copre l'assone in modo uniforme, ma riveste l'assone in segmenti che hanno brevi spazi tra di loro, chiamati nodi di Ranvier (recensito in 9,10). Sia lo spessore della mielinizzazione, che controlla il livello di isolamento elettrico di un assone, sia la spaziatura dei nodi di Ranvier, che controllano la frequenza con cui i potenziali d'azione vengono rigenerati lungo un assone, influenzano la velocità di propagazione del potenziale d'azione (rivisto in11).

C'è un ampio corpo di letteratura che suggerisce che lo spessore della mielinizzazione influenza la velocità di propagazione del potenziale d'azione negli assoni12,13,14. Inoltre, alterazioni nella mielinizzazione degli assoni possono provocare un numero di deficit del SNC 15,16,17,18,19,20,21. Non sorprende quindi che il focus di molti sforzi di ricerca riguardi la misurazione e la caratterizzazione della mielinizzazione assonica. Le misurazioni dello spessore della mielina sono state comunemente eseguite con la microscopia elettronica, una tecnica che richiede una quantità significativa di preparazione dei tessuti ed è difficile da usare in combinazione con l'immunoistochimica. Tuttavia, esiste anche una tecnica più rapida e semplice per misurare la mielinizzazione degli assoni basata sulla spettroscopia Raman coerente anti-Stokes (CARS). Un laser CARS può essere sintonizzato su varie frequenze e quando sintonizzato su frequenze adatte ad eccitare i lipidi, la mielina può essere ripresa senza la necessità di etichette aggiuntive22. L'imaging lipidico può essere combinato con l'immunoistochimica standard in modo tale che i lipidi possano essere visualizzati insieme a diversi canali fluorescenti23. La mielinizzazione per immagini con CARS è significativamente più veloce della microscopia elettronica e ha una risoluzione che, sebbene inferiore a EM, è sufficiente per rilevare anche piccole differenze nella mielinizzazione nello stesso tipo di assoni.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sono conformi a tutte le leggi applicabili, alle linee guida del National Institutes of Health e sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Colorado Anschutz.

1. Animali

  1. Utilizzare topi C57BL/6J (stock #000664) (Mus musculus ) ottenuti dal Jackson Laboratory o gerbilli mongoli (Meriones unguiculatus) originariamente ottenuti da Charles River.

2. Preparazione dei tessuti

  1. Per la perfusione transcardica, sovradosare le specie di roditori di interesse con pentobarbital (120 mg/kg di peso corporeo) e perfonderli transcardialmente con soluzione salina tamponata fosfato (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,76 mM KH 2 PO 4, 10 mM Na2HPO 4) seguitida paraformaldeide (PFA) al4% (PFA)24.
    1. In particolare, aprire l'addome e la gabbia toracica usando le forbici e tenere la gabbia toracica in posizione con una pinza emostatica Kelly per esporre il cuore.
    2. Inserire un ago da 23 GA collegato a una pompa di perfusione nel ventricolo sinistro e tagliare rapidamente l'atrio destro usando le forbici sottili.
    3. Somministrare PBS attraverso la pompa di perfusione e l'ago nel cuore per 10 minuti per liberare il cervello e il corpo dal sangue.
    4. Passare la pompa di perfusione al 4% di PFA per 10 minuti e verificare la rigidità degli arti e della coda per confermare la corretta perfusione.
  2. Dopo la perfusione, decapitare gli animali e rimuovere il loro cervello dal cranio. Mantenere il cervello durante la notte in 4% PFA prima di trasferire a PBS. Incorporare i tronchi cerebrali in agarosio al 4% (in PBS) e affettare coronalmente usando una vibratoma a 200 μm di spessore.

3. Colorazione

  1. Sezioni fluttuanti senza macchie per Nissl, per visualizzare corpi cellulari (1:100), in mezzi anticorpali (media AB: tampone fosfato 0,1 M (PB: 50 mM KH 2 PO 4,150 mM Na2HPO4), 150 mM NaCl, 3 mM Triton-X, 1% albumina sierica bovina (BSA)) per 30 minuti a temperatura ambiente su uno shaker standard da laboratorio25.
    1. Proteggere le sezioni dalla luce utilizzando un foglio di alluminio e/o una copertura. Le lunghezze d'onda di 550 nm o inferiori sono compatibili con l'imaging CARS (Figura 1).
      NOTA: Anche se non ci aspettiamo che Triton-X o altri reagenti abbiano un impatto sull'imaging dei lipidi CARS, possono essere giustificati controlli aggiuntivi con specifici mezzi anticorpali.
  2. PUNTO DI PAUSA: conservare le sezioni fluttuanti (protette dalla luce) in PBS fino all'imaging. Una volta sezionate, immagini sezioni cerebrali entro 2 settimane.

figure-protocol-1
Figura 1: L'imaging CARS può essere combinato con l'imaging immunofluorescente. I grafici mostrano che l'imaging di CARS avviene a 660/640 nm con lo spettro del segnale rosso26. Questa lunghezza d'onda è sufficientemente lontana dalla gamma verde, blu o UV, consentendo la combinazione del segnale CARS con l'immunofluorescenza in questi intervalli. In particolare, il grafico indica anche l'eccitazione e l'emissione di Nissl etichettato con fluoroforo blu, che è stato combinato con CARS durante la raccolta dei risultati rappresentativi per questa pubblicazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

4. Imaging

NOTA: Il set up laser CARS contiene un laser a fibra che fornisce l'orologio a 80 MHz e un laser OPO (Optical Parametric Oscillator) con una gamma sintonizzabile di 770-990 nm con il fascio Stokes fissato a 1031 nm, necessari per la raccolta del segnale CARS. C'è un'apertura per entrambi i raggi.

  1. Prima di portare i campioni al microscopio, accendere e riscaldare il laser CARS per almeno 1 ora, allineare il laser CARS e Koehler l'ottica del condensatore e il diaframma del microscopio per l'imaging CARS in avanti.
    NOTA: Questo passaggio è fondamentale per il corretto funzionamento della microscopia CARS.
    1. Per l'allineamento spaziale dei due raggi laser (pompa e stokes), accedere ai due PSD interni (rilevatori sensibili alla posizione) tramite la GUI laser CARS.
    2. Ottenere l'allineamento temporale utilizzando la funzione di ritardo nella GUI laser CARS, che può aiutare a sovrapporre gli impulsi dei due laser (pompa e stokes) che hanno dispersioni diverse a causa delle loro diverse lunghezze d'onda. Pertanto, sia la sovrapposizione temporale che spaziale dei fasci di pompa e stokes viene eseguita con l'input dell'utente tramite la GUI.
    3. Regolare il periscopio esterno (ultimi due specchi della configurazione) per centrare i due laser spazialmente sovrapposti sugli specchi della testa di scansione del microscopio.
    4. Per il miglior rilevamento CARS non descanizzato in avanti, assicurarsi che il condensatore sia Koehler-ed (il che significa che il condensatore è centrato e focalizzato sul diaframma per ottenere un'illuminazione uniforme)
  2. Per l'imaging confocale a immunofluorescenza e l'imaging CARS, montare il laser CARS, con rivelatori non desscansionati (NDD) sia in avanti che epi CARS, incorporando un microscopio confocale dotato di laser visibili per l'imaging a fluorescenza (Figura 2).
  3. Posizionare le sezioni in un piatto di coltura con coprislip (per microscopia invertita), PBS per evitare che il tessuto si secchi e un peso di vetro per mantenere il tessuto vicino al coprifoglio.
  4. Prendi z-stack o immagini singole con un obiettivo d'acqua corretto a infrarossi 60X, 1,2 NA, che serve per la raccolta del segnale CARS nella direzione epi e attraverso un condensatore da 0,55 NA nella direzione in avanti per l'imaging di aree cerebrali come il nucleo mediale del corpo trapezoidale (MNTB).
    1. Scatta le immagini CARS a circa 600 mW di pompa/sonda e 300 mW di Stokes, utilizzando la GUI laser CARS. Questi valori di potenza laser vengono misurati internamente dal sistema. Le potenze di entrambi i laser nella posizione del campione sono inferiori a 25 mW e sicure per il campione di tessuto.
    2. Sovrapponi la pompa e i raggi di Stokes spazialmente e temporalmente. Regolare l'OPO su 797,2 nm. Ciò produce una lunghezza d'onda CARS di 650 nm. A causa del livello di energia più elevato, il conseguente ritorno allo stato fondamentale è anti-Stokes (blu spostato) all'eccitazione.
    3. Catturare il segnale CARS in rivelatori epi o forward non descan utilizzando filtri passa-banda (640-680 nm) seguiti dal rilevamento sequenziale dell'etichetta di immunofluorescenza (in questo caso marcata fluorescentemente Nissl).
      NOTA: Il marcatore neuronale del soma Nissl non viene catturato nel filtro passa-banda CARS 640-680 nm, consentendo la combinazione di fluorescenza e imaging CARS nelle immagini presentate di seguito.
    4. Il CARS e la fluorescenza non condividono PMT. Utilizzare queste impostazioni per un segnale lipidico ottimale per visualizzare selettivamente la mielinizzazione nell'area del cervello.
      ATTENZIONE: Schermare l'utente dal raggio laser
  5. Salvare le immagini come file .oib, che possono essere importati in un programma di analisi delle immagini per ulteriori quantificazioni (Figura 3).

figure-protocol-2
Figura 2: Diagramma dello strumento CARS che mostra i laser CARS (frecce rosse) e il rilevamento epi e forward non descan (NDD) incorporati in una confocale a scansione laser. In NDD forward acquisiamo CARS per legami C-H (frecce rosso scuro) e SHG (seconda generatioina armonica) a 515 nm (freccia arancione). In epi NDD, acquisiamo CARS per legami C-H (frecce rosso scuro) e autofluorescenza 2PE (emissione di due fotoni) (freccia azzurra). Sequenzialmente, è possibile acquisire immagini confocali a fluorescenza (frecce verdi per laser visibile, frecce blu per il rilevamento confocale). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

figure-protocol-3
Figura 3: CARS può illuminare la mielina (magenta) nel tessuto cerebrale (tronco cerebrale) mentre anche l'imaging di Nissl (ciano) o marcatori fluorescenti. I due pannelli mostrano risultati rappresentativi di un gerbillo mongolo (immagine singola M. unguiculatus, Figura 3A,C,E) e di topo (proiezione massima z-stack M. musculus, Figura 2B,D,F), indicando che questa tecnica può essere utilizzata in tutte le specie. La Figura 3A,B mostra Nissl in ciano, C,D mostra il segnale CARS in magenta, E,F combina i segnali Nissl e CARS con ciascun pannello rispettivamente per gerbillo o mouse. Entrambe le serie di immagini mostrano una sezione del nucleo mediale del corpo trapezoidale (MNTB) nel tronco cerebrale. I neuroni nel MNTB ricevono input da assoni fortemente mielinici, che terminano nel calice di held, un tipo di sinapsi gigante27. La barra della scala è di 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Risultati

Uno dei maggiori vantaggi della microscopia CARS rispetto ad altre tecniche è la compatibilità con l'imaging fluorescente23. La Figura 1 mostra gli spettri CARS confrontati con Nissl marcati con marcatori immunofluorescenti che mostrano poca o nessuna sovrapposizione negli spettri. La figura 2 illustra la configurazione laser per CARS in combinazione con la microscopia confocale. La Figura 3 mostra due immagi...

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Discussione

Un crescente corpo di letteratura sottolinea il ruolo della mielina nella funzione cerebrale 13,16,21,28. Inoltre, sappiamo che lo spessore della mielinizzazione e il modello di mielinizzazione possono cambiare in diverse condizioni neurologiche come la sclerosi multipla (rivista in29), l'invecchiamento (rivisto in 30), l'autismo20,31 e molti altr...

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Dichiarazioni

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Supportato da NIH R01 DC 17924, R01 DC 18401 (Klug) e NIH 1R15HD105231-01, T32DC012280 e FRAXA (McCullagh). L'imaging CARS è stato eseguito nella parte Advanced Light Microscopy Core del NeuroTechnology Center presso l'Anschutz Medical Campus dell'Università del Colorado, supportata in parte da NIH P30 NS048154 e NIH P30 DK116073.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Anestetico:
1 mL siringa monouso con ago 27 GA x 0,5"Exel int260040
Fatal +Vortech
Chirurgia:
Spring Forbici - 8mm Cutting EdgeFine Science Tools15024-10
Pinzette standardStrumenti per le scienze fini11027-12
Perfusione:
4% ParaformaldeideFisher ChemicalSF994 (CS)
Forbici fini - AffilateStrumenti per le scienze fini14063-11
Emostatici Kelly Strumenti perle scienze fini13019-14
Millipore H2O
scivolamento di precisione23 GA x 1"305193
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS):
Cloruro di potassioSigmaP9333
Pompa monobaseSigmaP5655
con flusso variabile o equivalente
Cloruro di sodioFisher Chemicals271-1
Fosfato di sodio bibasicoSigmaS7907
Dissezione:
50 mL fiala con 4% di PFA
Bochem Chemical Spoon 180mmBochem230331000
Forbici fini - SharpFine Science Tools14063-11
Noyes Forbici a mollaStrumenti per la scienza15011-12
Coppia di pinzette fini (Graefe) Strumenti perla scienza fine11050-10
Vassoio in vetro o plastica poco profondo, circa 10 "x 10"
Pinzette standardStrumenti per la scienza fine 11027-12
Forbici chirurgiche - BluntFine Science Strumenti14000-20<
strong>Slicing:
Agar, piantaRPI9002-18-0
VibratomeLeicaVT1000s
pozzetto piastraAlkali Sci.TPN1048-NT
strong>Colorazione:
AB Terreno:1n 1.000 mL di Millipore H2O
Fosfato tamponato (PB):
Fosfato di potassio MonobaseSigmaP5655
Sodium Phosohate DibasicSigmaS7907
BSA (albumina sierica bovina)Sigma life scienceA2153-100g
Cloruro di sodioFisher Chemicals271-1
Triton X-100Sigma - Aldrichx100-500ml
Nissl 435/455InvitrogenN21479
CARS:
APE  laser picoemeraldAngewandte Physik & Elektronik  Filtro
(420-520 nm)Chroma TechnologyHQ470/100m-2P
(500-530 nm)Chroma TechnologyHQ515/30m-2P
(640-680 nm)Chroma TechnologyHQ660/40m-2P
Microscopio confocaleOlympusFV1000
Pipetta di trasferimento a taglioFisher13-711-7M
dicroico passa-lungo 565 nmTecnologia Chroma565dcxr
dicroico passa-lungo 585 nmTecnologia Chroma585dcxr
cortocircuito dicroico 750 nmTecnologia ChromaT750spxrxt
piatto di coltura con fondo in vetroMatTekP35G-0-10-C
peso del vetro (10 mm x 10 mm asta boro)Allen Scientific Filtro
680 nmChroma TechnologyET680sp-2p8
PBS
Punta dell'ago, BD < passa-banda GmbH Filtro passa-banda Filtri passa-banda di emissione passa-corto multifotone Glass Inc

Riferimenti

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