Applicazione coerente della spettroscopia Raman anti-Stokes (CARS) per l'imaging della mielinizzazione nelle fette di cervello

I potenziali d'azione sono l'unità di base dell'informazione nel cervello e la propagazione del potenziale d'azione attraverso gli assoni costituisce un pilastro dell'elaborazione delle informazioni ^1,2,3. I neuroni ricevono tipicamente input afferenti da più altri neuroni e integrano questi input all'interno di una data finestra temporale ristretta ^4,5. Pertanto, i meccanismi di propagazione del potenziale d'azione negli assoni hanno ricevuto una notevole attenzione da parte degli investigatori.

Quando si propaga attraverso un assone, un potenziale d'azione viene rigenerato ripetutamente lungo l'assone per garantire una propagazione affidabile⁶. Nella maggior parte dei neuroni dei vertebrati mascellari (gnatostomi) gli assoni sono circondati da una guaina di mielina, che è una sostanza ricca di lipidi prodotta dagli oligodendrociti vicini o dalle cellule di Schwann, che sono tipi di cellule gliali (rivisto in ^7,8). Questa guaina mielinica isola elettricamente l'assone, riducendone la capacità e consentendo la propagazione del potenziale d'azione in modo efficiente, rapido e con un minor consumo di energia. La mielina non copre l'assone in modo uniforme, ma riveste l'assone in segmenti che hanno brevi spazi tra di loro, chiamati nodi di Ranvier (recensito in ^9,10). Sia lo spessore della mielinizzazione, che controlla il livello di isolamento elettrico di un assone, sia la spaziatura dei nodi di Ranvier, che controllano la frequenza con cui i potenziali d'azione vengono rigenerati lungo un assone, influenzano la velocità di propagazione del potenziale d'azione (rivisto in¹¹).

C'è un ampio corpo di letteratura che suggerisce che lo spessore della mielinizzazione influenza la velocità di propagazione del potenziale d'azione negli assoni^12,13,14. Inoltre, alterazioni nella mielinizzazione degli assoni possono provocare un numero di deficit del SNC 15,16,17,18,19,20,21. Non sorprende quindi che il focus di molti sforzi di ricerca riguardi la misurazione e la caratterizzazione della mielinizzazione assonica. Le misurazioni dello spessore della mielina sono state comunemente eseguite con la microscopia elettronica, una tecnica che richiede una quantità significativa di preparazione dei tessuti ed è difficile da usare in combinazione con l'immunoistochimica. Tuttavia, esiste anche una tecnica più rapida e semplice per misurare la mielinizzazione degli assoni basata sulla spettroscopia Raman coerente anti-Stokes (CARS). Un laser CARS può essere sintonizzato su varie frequenze e quando sintonizzato su frequenze adatte ad eccitare i lipidi, la mielina può essere ripresa senza la necessità di etichette aggiuntive²². L'imaging lipidico può essere combinato con l'immunoistochimica standard in modo tale che i lipidi possano essere visualizzati insieme a diversi canali fluorescenti²³. La mielinizzazione per immagini con CARS è significativamente più veloce della microscopia elettronica e ha una risoluzione che, sebbene inferiore a EM, è sufficiente per rilevare anche piccole differenze nella mielinizzazione nello stesso tipo di assoni.

Tutti gli esperimenti sono conformi a tutte le leggi applicabili, alle linee guida del National Institutes of Health e sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Colorado Anschutz.

1. Animali

1. Utilizzare topi C57BL/6J (stock #000664) (Mus musculus ) ottenuti dal Jackson Laboratory o gerbilli mongoli (Meriones unguiculatus) originariamente ottenuti da Charles River.

2. Preparazione dei tessuti

1. Per la perfusione transcardica, sovradosare le specie di roditori di interesse con pentobarbital (120 mg/kg di peso corporeo) e perfonderli transcardialmente con soluzione salina tamponata fosfato (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,76 mM KH 2 PO 4, 10 mM Na₂HPO 4) seguitida paraformaldeide (PFA) al₄% (PFA)²⁴.
   1. In particolare, aprire l'addome e la gabbia toracica usando le forbici e tenere la gabbia toracica in posizione con una pinza emostatica Kelly per esporre il cuore.
   2. Inserire un ago da 23 GA collegato a una pompa di perfusione nel ventricolo sinistro e tagliare rapidamente l'atrio destro usando le forbici sottili.
   3. Somministrare PBS attraverso la pompa di perfusione e l'ago nel cuore per 10 minuti per liberare il cervello e il corpo dal sangue.
   4. Passare la pompa di perfusione al 4% di PFA per 10 minuti e verificare la rigidità degli arti e della coda per confermare la corretta perfusione.
2. Dopo la perfusione, decapitare gli animali e rimuovere il loro cervello dal cranio. Mantenere il cervello durante la notte in 4% PFA prima di trasferire a PBS. Incorporare i tronchi cerebrali in agarosio al 4% (in PBS) e affettare coronalmente usando una vibratoma a 200 μm di spessore.

3. Colorazione

1. Sezioni fluttuanti senza macchie per Nissl, per visualizzare corpi cellulari (1:100), in mezzi anticorpali (media AB: tampone fosfato 0,1 M (PB: 50 mM KH 2 PO 4,150 mM Na₂HPO₄), 150 mM NaCl, 3 mM Triton-X, 1% albumina sierica bovina (BSA)) per 30 minuti a temperatura ambiente su uno shaker standard da laboratorio²⁵.
   1. Proteggere le sezioni dalla luce utilizzando un foglio di alluminio e/o una copertura. Le lunghezze d'onda di 550 nm o inferiori sono compatibili con l'imaging CARS (Figura 1).
      NOTA: Anche se non ci aspettiamo che Triton-X o altri reagenti abbiano un impatto sull'imaging dei lipidi CARS, possono essere giustificati controlli aggiuntivi con specifici mezzi anticorpali.
2. PUNTO DI PAUSA: conservare le sezioni fluttuanti (protette dalla luce) in PBS fino all'imaging. Una volta sezionate, immagini sezioni cerebrali entro 2 settimane.

Figura 1: L'imaging CARS può essere combinato con l'imaging immunofluorescente. I grafici mostrano che l'imaging di CARS avviene a 660/640 nm con lo spettro del segnale rosso²⁶. Questa lunghezza d'onda è sufficientemente lontana dalla gamma verde, blu o UV, consentendo la combinazione del segnale CARS con l'immunofluorescenza in questi intervalli. In particolare, il grafico indica anche l'eccitazione e l'emissione di Nissl etichettato con fluoroforo blu, che è stato combinato con CARS durante la raccolta dei risultati rappresentativi per questa pubblicazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

4. Imaging

NOTA: Il set up laser CARS contiene un laser a fibra che fornisce l'orologio a 80 MHz e un laser OPO (Optical Parametric Oscillator) con una gamma sintonizzabile di 770-990 nm con il fascio Stokes fissato a 1031 nm, necessari per la raccolta del segnale CARS. C'è un'apertura per entrambi i raggi.

1. Prima di portare i campioni al microscopio, accendere e riscaldare il laser CARS per almeno 1 ora, allineare il laser CARS e Koehler l'ottica del condensatore e il diaframma del microscopio per l'imaging CARS in avanti.
   NOTA: Questo passaggio è fondamentale per il corretto funzionamento della microscopia CARS.
   1. Per l'allineamento spaziale dei due raggi laser (pompa e stokes), accedere ai due PSD interni (rilevatori sensibili alla posizione) tramite la GUI laser CARS.
   2. Ottenere l'allineamento temporale utilizzando la funzione di ritardo nella GUI laser CARS, che può aiutare a sovrapporre gli impulsi dei due laser (pompa e stokes) che hanno dispersioni diverse a causa delle loro diverse lunghezze d'onda. Pertanto, sia la sovrapposizione temporale che spaziale dei fasci di pompa e stokes viene eseguita con l'input dell'utente tramite la GUI.
   3. Regolare il periscopio esterno (ultimi due specchi della configurazione) per centrare i due laser spazialmente sovrapposti sugli specchi della testa di scansione del microscopio.
   4. Per il miglior rilevamento CARS non descanizzato in avanti, assicurarsi che il condensatore sia Koehler-ed (il che significa che il condensatore è centrato e focalizzato sul diaframma per ottenere un'illuminazione uniforme)
2. Per l'imaging confocale a immunofluorescenza e l'imaging CARS, montare il laser CARS, con rivelatori non desscansionati (NDD) sia in avanti che epi CARS, incorporando un microscopio confocale dotato di laser visibili per l'imaging a fluorescenza (Figura 2).
3. Posizionare le sezioni in un piatto di coltura con coprislip (per microscopia invertita), PBS per evitare che il tessuto si secchi e un peso di vetro per mantenere il tessuto vicino al coprifoglio.
4. Prendi z-stack o immagini singole con un obiettivo d'acqua corretto a infrarossi 60X, 1,2 NA, che serve per la raccolta del segnale CARS nella direzione epi e attraverso un condensatore da 0,55 NA nella direzione in avanti per l'imaging di aree cerebrali come il nucleo mediale del corpo trapezoidale (MNTB).
   1. Scatta le immagini CARS a circa 600 mW di pompa/sonda e 300 mW di Stokes, utilizzando la GUI laser CARS. Questi valori di potenza laser vengono misurati internamente dal sistema. Le potenze di entrambi i laser nella posizione del campione sono inferiori a 25 mW e sicure per il campione di tessuto.
   2. Sovrapponi la pompa e i raggi di Stokes spazialmente e temporalmente. Regolare l'OPO su 797,2 nm. Ciò produce una lunghezza d'onda CARS di 650 nm. A causa del livello di energia più elevato, il conseguente ritorno allo stato fondamentale è anti-Stokes (blu spostato) all'eccitazione.
   3. Catturare il segnale CARS in rivelatori epi o forward non descan utilizzando filtri passa-banda (640-680 nm) seguiti dal rilevamento sequenziale dell'etichetta di immunofluorescenza (in questo caso marcata fluorescentemente Nissl).
      NOTA: Il marcatore neuronale del soma Nissl non viene catturato nel filtro passa-banda CARS 640-680 nm, consentendo la combinazione di fluorescenza e imaging CARS nelle immagini presentate di seguito.
   4. Il CARS e la fluorescenza non condividono PMT. Utilizzare queste impostazioni per un segnale lipidico ottimale per visualizzare selettivamente la mielinizzazione nell'area del cervello.
      ATTENZIONE: Schermare l'utente dal raggio laser
5. Salvare le immagini come file .oib, che possono essere importati in un programma di analisi delle immagini per ulteriori quantificazioni (Figura 3).

Figura 2: Diagramma dello strumento CARS che mostra i laser CARS (frecce rosse) e il rilevamento epi e forward non descan (NDD) incorporati in una confocale a scansione laser. In NDD forward acquisiamo CARS per legami C-H (frecce rosso scuro) e SHG (seconda generatioina armonica) a 515 nm (freccia arancione). In epi NDD, acquisiamo CARS per legami C-H (frecce rosso scuro) e autofluorescenza 2PE (emissione di due fotoni) (freccia azzurra). Sequenzialmente, è possibile acquisire immagini confocali a fluorescenza (frecce verdi per laser visibile, frecce blu per il rilevamento confocale). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: CARS può illuminare la mielina (magenta) nel tessuto cerebrale (tronco cerebrale) mentre anche l'imaging di Nissl (ciano) o marcatori fluorescenti. I due pannelli mostrano risultati rappresentativi di un gerbillo mongolo (immagine singola M. unguiculatus, Figura 3A,C,E) e di topo (proiezione massima z-stack M. musculus, Figura 2B,D,F), indicando che questa tecnica può essere utilizzata in tutte le specie. La Figura 3A,B mostra Nissl in ciano, C,D mostra il segnale CARS in magenta, E,F combina i segnali Nissl e CARS con ciascun pannello rispettivamente per gerbillo o mouse. Entrambe le serie di immagini mostrano una sezione del nucleo mediale del corpo trapezoidale (MNTB) nel tronco cerebrale. I neuroni nel MNTB ricevono input da assoni fortemente mielinici, che terminano nel calice di held, un tipo di sinapsi gigante²⁷. La barra della scala è di 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Uno dei maggiori vantaggi della microscopia CARS rispetto ad altre tecniche è la compatibilità con l'imaging fluorescente23. La Figura 1 mostra gli spettri CARS confrontati con Nissl marcati con marcatori immunofluorescenti che mostrano poca o nessuna sovrapposizione negli spettri. La figura 2 illustra la configurazione laser per CARS in combinazione con la microscopia confocale. La Figura 3 mostra due immagini rappresentative, una come una singola pila e una proiezione z-stack max da gerbillo e topo che potrebbero essere ottenute utilizzando l'imaging CARS che mostra sia i corpi cellulari (ciano) che il segnale mielinico (magenta).

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.