Applicazione coerente della spettroscopia Raman anti-Stokes (CARS) per l'imaging della mielinizzazione nelle fette di cervello

Summary

Visualizzare la mielinizzazione è un obiettivo importante per molti ricercatori che studiano il sistema nervoso. CARS è una tecnica compatibile con l'immunofluorescenza in grado di visualizzare nativamente i lipidi all'interno di tessuti come il cervello illuminando strutture specializzate come la mielina.

Abstract

La spettroscopia coerente anti-Stokes Raman (CARS) è una tecnica classicamente impiegata da chimici e fisici per produrre un segnale coerente delle vibrazioni delle molecole. Tuttavia, queste firme vibrazionali sono anche caratteristiche delle molecole all'interno del tessuto anatomico come il cervello, rendendolo sempre più utile e applicabile per le applicazioni delle neuroscienze. Ad esempio, CARS può misurare i lipidi eccitando specificamente i legami chimici all'interno di queste molecole, consentendo la quantificazione di diversi aspetti del tessuto, come la mielina coinvolta nella neurotrasmissione. Inoltre, rispetto ad altre tecniche tipicamente utilizzate per quantificare la mielina, CARS può anche essere impostato per essere compatibile con le tecniche immunofluorescenti, consentendo la co-etichettatura con altri marcatori come i canali del sodio o altri componenti della trasmissione sinaptica. I cambiamenti della mielinizzazione sono un meccanismo intrinsecamente importante nelle malattie demielinizzanti come la sclerosi multipla o altre condizioni neurologiche come la sindrome dell'X fragile o i disturbi dello spettro autistico è un'area emergente di ricerca. In conclusione, CARS può essere utilizzato in modi innovativi per rispondere a domande urgenti nelle neuroscienze e fornire prove dei meccanismi sottostanti legati a molte diverse condizioni neurologiche.

Introduction

I potenziali d'azione sono l'unità di base dell'informazione nel cervello e la propagazione del potenziale d'azione attraverso gli assoni costituisce un pilastro dell'elaborazione delle informazioni ^1,2,3. I neuroni ricevono tipicamente input afferenti da più altri neuroni e integrano questi input all'interno di una data finestra temporale ristretta ^4,5. Pertanto, i meccanismi di propagazione del potenziale d'azione negli assoni hanno ricevuto una notevole attenzione da parte degli investigatori.

Protocol

Tutti gli esperimenti sono conformi a tutte le leggi applicabili, alle linee guida del National Institutes of Health e sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Colorado Anschutz.

1. Animali

1. Utilizzare topi C57BL/6J (stock #000664) (Mus musculus ) ottenuti dal Jackson Laboratory o gerbilli mongoli (Meriones unguiculatus) originariamente ottenuti da Charles River.

2. Preparazione dei tessuti

1. Per la perfusione transcardica, sovradosare le specie di roditori di interesse con pento....

Results

Uno dei maggiori vantaggi della microscopia CARS rispetto ad altre tecniche è la compatibilità con l'imaging fluorescente²³. La Figura 1 mostra gli spettri CARS confrontati con Nissl marcati con marcatori immunofluorescenti che mostrano poca o nessuna sovrapposizione negli spettri. La figura 2 illustra la configurazione laser per CARS in combinazione con la microscopia confocale. La Figura 3 mostra due immagi.......

Discussion

Un crescente corpo di letteratura sottolinea il ruolo della mielina nella funzione cerebrale 13,16,21,28. Inoltre, sappiamo che lo spessore della mielinizzazione e il modello di mielinizzazione possono cambiare in diverse condizioni neurologiche come la sclerosi multipla (rivista in²⁹), l'invecchiamento (rivisto in 30), l'autismo^20,31 e molti altr.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anestetico:
1 mL siringa monouso con ago 27 GA x 0,5"	Exel int	260040
Fatal +	Vortech
Chirurgia:
Spring Forbici - 8mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15024-10
Pinzette standard	Strumenti per le scienze fini	11027-12
Perfusione:
4% Paraformaldeide	Fisher Chemical	SF994 (CS)
Forbici fini - Affilate	Strumenti per le scienze fini	14063-11
Emostatici Kelly Strumenti per	le scienze fini	13019-14
Millipore H2O
scivolamento di precisione	23 GA x 1"	305193
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS):
Cloruro di potassio	Sigma	P9333
Pompa monobase	Sigma	P5655
con flusso variabile o equivalente
Cloruro di sodio	Fisher Chemical	s271-1
Fosfato di sodio bibasico	Sigma	S7907
Dissezione:
50 mL fiala con 4% di PFA
Bochem Chemical Spoon 180mm	Bochem	230331000
Forbici fini - Sharp	Fine Science Tools	14063-11
Noyes Forbici a molla	Strumenti per la scienza	15011-12
Coppia di pinzette fini (Graefe) Strumenti per	la scienza fine	11050-10
Vassoio in vetro o plastica poco profondo, circa 10 "x 10"
Pinzette standard	Strumenti per la scienza fine 11027-12
Forbici chirurgiche - Blunt	Fine Science Strumenti	14000-20<
strong>Slicing:
Agar, pianta	RPI	9002-18-0
Vibratome	Leica	VT1000s
pozzetto piastra	Alkali Sci.	TPN1048-NT
strong>Colorazione:
AB Terreno:			1n 1.000 mL di Millipore H2O
Fosfato tamponato (PB):
Fosfato di potassio Monobase	Sigma	P5655
Sodium Phosohate Dibasic	Sigma	S7907
BSA (albumina sierica bovina)	Sigma life science	A2153-100g
Cloruro di sodio	Fisher Chemical	s271-1
Triton X-100	Sigma - Aldrich	x100-500ml
Nissl 435/455	Invitrogen	N21479
CARS:
APE  laser picoemerald	Angewandte Physik & Elektronik  Filtro
(420-520 nm)	Chroma Technology	HQ470/100m-2P
(500-530 nm)	Chroma Technology	HQ515/30m-2P
(640-680 nm)	Chroma Technology	HQ660/40m-2P
Microscopio confocale	Olympus	FV1000
Pipetta di trasferimento a taglio	Fisher	13-711-7M
dicroico passa-lungo 565 nm	Tecnologia Chroma	565dcxr
dicroico passa-lungo 585 nm	Tecnologia Chroma	585dcxr
cortocircuito dicroico 750 nm	Tecnologia Chroma	T750spxrxt
piatto di coltura con fondo in vetro	MatTek	P35G-0-10-C
peso del vetro (10 mm x 10 mm asta boro)	Allen Scientific Filtro
680 nm	Chroma Technology	ET680sp-2p8
PBS