Method Article

Espansione della comprensione del microambiente tumorale mediante spettrometria di massa Imaging di campioni di tessuto fissati in formalina e incorporati in paraffina

DOI:

10.3791/64015

⸱

June 29th, 2022

 ,  ,  , 
1Department of Translational Molecular Pathology, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nell'era dell'immunoterapia del cancro, l'interesse nel chiarire le dinamiche del microambiente tumorale è aumentato in modo sorprendente. Questo protocollo descrive in dettaglio una tecnica di imaging con spettrometria di massa rispetto alle sue fasi di colorazione e imaging, che consentono un'analisi spaziale altamente multiplexata.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I progressi nelle terapie a base immunitaria hanno rivoluzionato il trattamento e la ricerca sul cancro. Ciò ha innescato una crescente domanda per la caratterizzazione del panorama immunitario tumorale. Sebbene l'immunoistochimica standard sia adatta per lo studio dell'architettura tissutale, è limitata all'analisi di un piccolo numero di marcatori. Al contrario, tecniche come la citometria a flusso possono valutare più marcatori contemporaneamente, sebbene le informazioni sulla morfologia del tessuto vengano perse. Negli ultimi anni, le strategie multiplexed che integrano l'analisi fenotipica e spaziale sono emerse come approcci completi alla caratterizzazione del panorama immunitario tumorale. Qui, discutiamo di una tecnologia innovativa che combina anticorpi marcati con metallo e spettrometria di massa a ioni secondari concentrandoci sulle fasi tecniche nello sviluppo e nell'ottimizzazione del test, nella preparazione dei tessuti e nell'acquisizione e nell'elaborazione delle immagini. Prima della colorazione, è necessario sviluppare e ottimizzare un pannello anticorpale marcato in metallo. Questo sistema di immagini hi-plex supporta fino a 40 anticorpi marcati con metallo in una singola sezione di tessuto. Da notare, il rischio di interferenze del segnale aumenta con il numero di marcatori inclusi nel pannello. Dopo la progettazione del pannello, è necessario prestare particolare attenzione all'assegnazione dell'isotopo metallico all'anticorpo per ridurre al minimo questa interferenza. Il panel test preliminare viene eseguito utilizzando un piccolo sottogruppo di anticorpi e il successivo test dell'intero pannello nei tessuti di controllo. Sezioni di tessuto fissate in formalina e incorporate in paraffina sono ottenute e montate su vetrini rivestiti d'oro e ulteriormente colorate. La colorazione richiede 2 giorni e ricorda da vicino la colorazione immunoistochimica standard. Una volta che i campioni sono macchiati, vengono posizionati nello strumento di acquisizione delle immagini. I campi visivi vengono selezionati e le immagini vengono acquisite, caricate e archiviate. La fase finale è la preparazione delle immagini per il filtraggio e la rimozione delle interferenze utilizzando il software di elaborazione delle immagini del sistema. Uno svantaggio di questa piattaforma è la mancanza di software analitico. Tuttavia, le immagini generate sono supportate da diversi software di patologia computazionale.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'importanza dei numerosi tipi di cellule che circondano le popolazioni tumorali clonali è un elemento cruciale nella categorizzazione della carcinogenesi. L'interesse nel chiarire la composizione e le interazioni di questo microambiente tumorale (TME) è aumentato continuamente in seguito all'istituzione della terapia a base immunitaria come parte dell'arsenale di trattamento del cancro. Pertanto, le strategie di trattamento sono passate da un approccio incentrato sul tumore a uno incentrato sulla TME1.

Gli sforzi per chiarire il ruolo delle cellule immunitarie nella sorveglianza del tumore e nello sviluppo del cancro sono aumentati notevolmente negli ultimi anni 2,3. Nella ricerca medica, una pletora di metodi, tra cui metodi basati sulla citometria e tecnologie di imaging singleplex e multiplex, sono sorti come parte di questo tentativo di decifrare le interazioni uniche di più elementi delle TME.

Metodi pionieristici come la citometria a flusso (inventata nel 1960), la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza e la citometria di massa si concentrano principalmente sull'identificazione e la quantificazione dei componenti della TME4. Anche se le tecniche quantitative basate sulla citometria consentono la fenotipizzazione del paesaggio immunitario, determinare la distribuzione spaziale cellulare è impossibile. Al contrario, metodi come l'immunoistochimica singleplex standard preservano l'architettura tissutale e consentono ai ricercatori di analizzare la distribuzione cellulare, sebbene un numero ridotto di bersagli in una singola sezione di tessuto sia una limitazione di questi metodi 5,6. Negli ultimi anni, le tecnologie di imaging multiplexed per la risoluzione di singole cellule come l'immunofluorescenza multiplex, l'imaging a fluorescenza con codice a barre e la spettrometria di massa per imaging sono emerse come strategie complete per acquisire informazioni sulla colorazione simultanea dei marcatori utilizzando lastessa sezione 7 del tessuto.

Qui presentiamo una tecnologia che accoppia anticorpi marcati con metalli e spettrometria di massa a ioni secondari e consente la quantificazione della risoluzione di singole cellule, la co-espressione dei marcatori (fenotipizzazione) e l'analisi spaziale utilizzando campioni di tessuto fissati in formalina, incorporati in paraffina (FFPE) e freschi congelati (FF) 8,9. I campioni FFPE sono i materiali più utilizzati per i campioni di archiviazione dei tessuti e rappresentano una risorsa più facilmente disponibile per le tecnologie di imaging multiplexed rispetto ai campioni freschi congelati10. Inoltre, questa tecnologia offre la possibilità di riacquisire le immagini mesi dopo. Qui, discutiamo i nostri protocolli di colorazione ed elaborazione delle immagini utilizzando campioni di tessuto FFPE.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I campioni di tessuto sono stati ottenuti per scopi di ricerca in conformità con l'Institutional Review Board dell'Università del Texas MD Anderson Cancer Center e i campioni sono stati ulteriormente de-identificati.

1. Selezione degli anticorpi

  1. Definire le domande di ricerca per scegliere i migliori cloni anticorpali disponibili. Utilizzare l'Atlante delle proteine umane, la ricerca pubblicata e i siti Web dei produttori di anticorpi come risorse di ricerca.
    NOTA: La selezione di adeguati controlli dei tessuti umani e degli stessi controlli dei tessuti umani da colorare nelle diverse fasi è fondamentale per assicurarsi che i marcatori siano colorati correttamente, nel posto giusto e nel corretto compartimento cellulare. Un piccolo microarray tissutale (TMA) che includa tessuti normali e tessuti neoplastici è sempre raccomandato per la convalida della colorazione.
  2. Utilizzare solo anticorpi carrier-free per progettare il pannello.
    NOTA: L'uso di formulazioni anticorpali carrier-free è richiesto se non è disponibile un anticorpo commerciale carrier-free; I kit di purificazione possono essere utilizzati per adattare l'anticorpo alla formulazione corretta. Gli additivi proteici come l'albumina sierica bovina sono noti per diminuire la capacità di coniugazione.
  3. Testare e titolare ciascun anticorpo utilizzando l'immunoistochimica cromogenica standard per determinare il pattern subcellulare dell'espressione di un marcatore; colorazione di membrana, citoplasmatica o nucleare; ed espressione in cellule specifiche nei tessuti di controllo.
    NOTA: Tuttavia, ogni anticorpo deve essere testato in acido etilendiamminotetraacetico pH 6 e acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e deve essere determinato se il pannello sarà colorato con citrato pH 6 o pH 9 EDTA. Si raccomanda l'uso di pH 9 EDTA per ottenere buoni segnali, specialmente quando si lavora con questa metodologia.
  4. Scegli la concentrazione di colorazione ottimale in base al modello di espressione nei controlli positivi.
  5. Assegnare ogni anticorpo a uno degli isotopi metallici disponibili in base all'abbondanza di marcatori immunoistochimici, alla localizzazione subcellulare e alla co-espressione cellulare con gli altri bersagli.
  6. Colorare l'anticorpo con il metallo assegnato corrispondente e confrontarlo con l'espressione nello stesso tessuto di controllo utilizzato in precedenza.
    NOTA: La coniugazione degli anticorpi metallici inizia con la preparazione, la riduzione e la successiva coniugazione degli anticorpi (file supplementare 1). Ogni tubo polimerico caricato con metallo è sufficiente per etichettare 100 μg di un anticorpo.

2. Design del pannello anticorpale

  1. Creare piccoli lotti di colorazione anticorpale. Prova fino a cinque marcatori in un cocktail.
    NOTA: Il test di anticorpi già coniugati e analizzati utilizzando l'immunoistochimica in lotti facilita l'identificazione precoce delle interferenze dei canali e offre l'opportunità di riconiugare gli anticorpi con un altro metallo. Offre inoltre l'opportunità di valutare un'adeguata co-espressione dei marcatori.
  2. Colorare ogni piccolo lotto con quattro diverse concentrazioni di anticorpi (0,05 μg/mL, 0,2 μg/mL, 1 μg/mL e 4,0 μg/mL).
    NOTA: Confrontando diversi titoli, identificare la concentrazione di anticorpi che risulta nella posizione corretta e nella massima espressione con una minima colorazione di fondo (miglior rapporto segnale-rumore).

3. Sezionamento del tessuto FFPE

  1. Selezionare vetrini rivestiti d'oro (specifici per questo scopo) e tenerli vicino al microtomo. Preparare il microtomo inserendo una nuova lama nel supporto. Impostare lo spessore della sezione su 4-5 μm.
  2. Metti i blocchi FFPE sul ghiaccio prima di sezionare. Preparare un bagno di galleggiamento tissutale riscaldando acqua distillata o acqua deionizzata (diH2O) a 40-45 °C.
    NOTA: L'uso di diH2O o acqua distillata riduce la possibilità di contaminazione.
  3. Inizia il sezionamento. Posizionare la sezione di tessuto nell'acqua usando una pinzetta e lasciarla appiattire. Utilizzare i vetrini per rimuovere sezioni di tessuto dall'acqua.
  4. Posizionare i vetrini in una griglia e lasciarli asciugare a temperatura ambiente durante la notte.

4. Colorazione anticorpale FFPE

NOTA: Il processo di colorazione avviene in due giorni separati.

ATTENZIONE: Le soluzioni impiegate in questo protocollo sono potenzialmente corrosive e rappresentano pericoli per la pelle e gli occhi. Si consiglia di indossare guanti, un camice da laboratorio e attrezzature protettive per occhi e viso e fa parte della politica di biosicurezza della nostra istituzione.

  1. Preparazione del reagente (giorno 1)
    1. Diluire 50 mL di soluzione salina tamponata Tris 20x con Tween (TBS-T) in 950 mL di diH2O per ottenere 1 L di TBS-T.
    2. Diluire 8 mL di acido tris-etilendiamminotetraacetico (EDTA) 10x in 72 mL di diH2O per ottenere una soluzione 1x di recupero dell'epitopo indotta dal calore (HIER).
    3. Diluire il siero d'asina in 1x TBS-T ad una concentrazione finale del 5% per ottenere un tampone bloccante. Conservare la soluzione a 4 °C fino al momento dell'uso.
  2. Preparazione HIER: modulo di pretrattamento (PT)
    ATTENZIONE: Indossare guanti di protezione chimica quando si maneggiano reagenti o parti immerse in qualsiasi reagente utilizzato nel modulo PT.
    1. Diluire 140 mL di soluzione salina tamponata fosfato 10x (PBS) in 1.260 mL di diH2O per ottenere 1,4 L di 1x PBS. In alternativa, diluire sette compresse di PBS in 1,4 L di diH2O.
    2. Riempire un serbatoio con 1,4 L di PBS e posizionare il contenitore della camera di scorrimento preparato con 100 ml di soluzione 1x HIER nel serbatoio.
    3. Preriscaldare il serbatoio in un modulo PT a 75 °C.
  3. Rimozione della paraffina in eccesso
    1. Cuocere i vetrini a 70 °C in forno per almeno 20 min.
      NOTA: Alcuni tessuti o sezioni potrebbero richiedere tempi di cottura più lunghi. Il tempo di cottura raccomandato per il tessuto cerebrale o una TMA è di 1 ora. Questo può essere esteso a 16 ore (durante la notte) o in base all'esperienza di laboratorio.
    2. Posizionare i vetrini cotti in un portavetrini ed eseguire i seguenti passaggi di lavaggio su uno shaker sotto una cappa aspirante. Lavare i vetrini nella seguente soluzione: xilene 2x per 30 s (senza metallo), alcool 100% 2x per 30 s (senza metallo), alcool al 95% 2x per 30 s (senza metallo), alcool 80% per 30 s (senza metallo), alcool al 70% per 30 s (senza metallo) e diH2O 2x per 30 s (senza metallo).
    3. Conservare i vetrini in un contenitore di diH2O fresco fino al momento del recupero dell'antigene.
      NOTA: I vetrini non devono essere asciugati fino alla fine della procedura.
  4. Recupero dell'antigene
    1. Posizionare le guide in una camera di scorrimento preriscaldata contenente 1 tampone HIER all'interno del modulo PT. Posizionare il coperchio sul serbatoio. Chiudere e chiudere il coperchio.
    2. Premere il pulsante Menu sul modulo PT per aprire il menu principale e premere il pulsante Ciclo di configurazione (tempo e temperatura) per creare un programma personalizzato.
    3. Far funzionare il modulo PT a 97 °C per 40 minuti. Successivamente, il modulo PT si raffredderà automaticamente a 65 °C.
    4. Rimuovere i vetrini dal modulo PT una volta raggiunta la temperatura di 65 °C. Mantenere i vetrini a temperatura ambiente per 30 minuti.
      NOTA: Il modulo PT non si apre fino a quando la temperatura non si raffredda a 65 °C. Non toccare la superficie dorata dei vetrini durante questo processo e utilizzare sempre i guanti.
  5. Blocco degli anticorpi
    1. Impostare uno shaker a 70 giri/min.
    2. Lavare i vetrini immergendoli in 1x TBS-T per 5 minuti 2x.
    3. Utilizzando una penna barriera idrofobica, disegnare un bordo attorno alla sezione di tessuto ad almeno 1 mm di distanza dai bordi del vetrino e lasciarlo asciugare per 15-30 s.
      NOTA: Evitare che il liquido della penna tocchi la sezione del tessuto per evitare interferenze tissutali con la colorazione. Non premere la penna troppo forte mentre si disegna la barriera per evitare potenziali perdite. Per ottenere risultati ottimali di colorazione e acquisizione delle immagini, le sezioni di tessuto sono posizionate al centro dei vetrini rivestiti d'oro in una cornice non più grande di 15 mm x 30 mm per consentire spazio sufficiente per disegnare la barriera senza toccare il tessuto o i punti guida posizionati sul bordo esterno del vetrino.
    4. Per rimuovere eventuali residui di penna, immergere i vetrini in TBS-T.
    5. In una camera di umidità a temperatura ambiente, incubare la sezione di tessuto con 100-200 μL di tampone bloccante per 20 minuti. Lasciare il tessuto in incubazione nel tampone bloccante fino a quando una miscela principale di anticorpi è pronta.
  6. Preparazione del pannello anticorpale
    NOTA: Il volume finale del cocktail del pannello anticorpale varia in base alla superficie stimata della sezione tissutale. Per coprire un'area di 20 mm x 20 mm, preparare 100-200 μL del cocktail.
    Effettuare le seguenti operazioni per preparare un cocktail di pannelli anticorpali di anticorpi coniugati con isotopi metallici:
    1. Confermare il volume finale del cocktail che corrisponde al volume del cocktail di anticorpi aggiunto al volume del tampone bloccante.
    2. Confermare le specifiche per tutti gli anticorpi, le diluizioni e/o le concentrazioni di anticorpi in un foglio di calcolo del pannello per il progetto.
    3. Ruotare tutti i tubi contenenti anticorpi a 10.000 x g per 5 minuti. Aggiungere singoli anticorpi al tampone bloccante e mescolare molto bene. Non disturbare il fondo del tubo anticorpale durante il pipettaggio.
    4. Filtrare il pannello anticorpale preumidando un dispositivo di filtraggio centrifugo da 0,1 μm con 100 μL di tampone bloccante. Ruotare il filtro a 10.000 x g per 2 minuti e rimuovere il flusso del buffer di blocco con una pipetta.
    5. Trasferire il pannello anticorpale in una colonna di rotazione e ruotare il filtro a 10.000 x g per 2 minuti. Scartare la colonna di rotazione e utilizzare il flow-through come pannello anticorpale filtrato.
      NOTA: Eseguire la colorazione immediatamente dopo aver preparato il cocktail per evitare lo scambio di metallo. Se è necessaria la conservazione del cocktail anticorpale per un tempo prolungato, può essere sottoposto a liofilizzazione.
  7. Colorazione anticorpale
    1. Rimuovere con attenzione il buffer di blocco dalle diapositive ribaltando ogni diapositiva su un lato e toccando delicatamente i bordi contro un tergicristallo delle attività.
    2. Posizionare i vetrini in una camera di umidità e aggiungere 100-200 μL di miscela principale anticorpale al tessuto (evitare il contatto con il tessuto e la creazione di bolle d'aria).
    3. Aggiungi vetrini di controllo positivi e negativi al batch di colorazione.
    4. Incubare i vetrini a 4 °C durante la notte (14-16 h).
  8. Preparazione del reagente (giorno 2)
    1. Diluire 100 mL di PBS 10x a basso contenuto di bario, pH 7,4, in 900 mL di diH2O per ottenere 1x PBS.
    2. Preparare 350 mL di una soluzione madre di lavoro di glutaraldeide al 2% in PBS a basso contenuto di bario (340 mL di PBS a basso contenuto di bario + 10 mL di glutaraldeide al 70%).
      NOTA: Eseguire la diluizione sotto un cappuccio. La glutaraldeide è un liquido molto viscoso. Utilizzare una pipetta da 1 mL e aggiungere 1 mL di PBS a basso contenuto di bario al tubo di glutaraldeide ogni volta fino a quando non diventa abbastanza liquido da fuoriuscire dal tubo.
    3. Diluire 10x Tris, pH 8,5, in 900 mL di diH20 per ottenere 1x Tris.
  9. Fissazione e disidratazione
    1. Rimuovere la miscela principale di anticorpi da ogni vetrino ribaltando la diapositiva su un lato e picchiettando delicatamente il bordo contro un tergicristallo.
    2. Lavare i vetrini con agitazione da leggera a moderata nei seguenti tamponi: 1x TBS-T, 3 volte per 5 minuti ciascuno (senza metallo); glutaraldeide filtrata al 2% per 5 min; filtrato 1x tris, pH 8,5, 3x per 30 s; diH2O 2x filtrato per 30 s; 70% di alcol per 30 s (senza metallo); 80% di alcol per 30 s (senza metallo); 95% di alcol per 30 s (senza metallo); e alcool al 100% per 30 s (senza metallo).
    3. Picchiettare delicatamente il bordo di ogni diapositiva contro un tergicristallo per rimuovere l'alcol in eccesso e consentire all'alcol residuo di evaporare a temperatura ambiente (~ 5-10 min).
    4. Asciugare i vetrini in un essiccatore per almeno 1 ora prima dell'acquisizione dell'immagine o conservare i vetrini in una camera a vuoto per la conservazione a lungo termine.

5. Acquisizione di immagini

  1. Configurazione diapositiva
    NOTA: prima di eseguire la scansione utilizzando lo strumento, le diapositive devono essere definite e configurate utilizzando l'applicazione di gestione delle immagini basata sul Web seguendo i passaggi descritti di seguito.
    1. Nella pagina della diapositiva dell'applicazione di gestione delle immagini basata sul Web, fare clic su Nuova diapositiva di adesione e immettere i dettagli desiderati (nome, identificazione della diapositiva, posizione e descrizione).
    2. Creare sezioni di scansione facendo clic su Aggiungi sezione. Inserire le informazioni per ogni sezione (nome del progetto, nome della diapositiva, blocco e posizione). Per salvare le nuove diapositive/sezioni create, fare clic su Invia.
    3. Nella scheda risorse, apri la pagina dei pannelli e seleziona il pannello da utilizzare. Per i nuovi pannelli, fate clic su Crea nuovo pannello.
    4. Dopo aver selezionato il pannello, fare clic su Sezioni. Aggiungere le sezioni create nel passaggio 2. facendo clic su Modifica assegnazione sezione. Salva facendo clic su Invia.
  2. Configurazione dello strumento
    NOTA: Questo strumento (vedi Tabella dei materiali) viene azionato utilizzando uno specifico programma software di controllo (vedi Tabella dei materiali).
    1. Accedere al software di controllo. Fare clic su Riattiva se lo strumento è in modalità di sospensione.
      NOTA: Almeno 1 ora prima dell'operazione, si consiglia di riscaldare lo strumento, il che aiuta con la stabilizzazione della messa a fuoco del fascio.
    2. Per caricare una diapositiva, fare clic su Exchange Sample e quindi fare clic su Continua per aprire la porta. Inserire la diapositiva nello slot di caricamento con il campione rivolto verso l'alto e l'etichetta sulla destra. Fare clic su Continua per chiudere la porta.
      NOTA: se la diapositiva non viene caricata correttamente, verranno visualizzati un suono di avviso e una notifica per regolare la diapositiva.
    3. Selezionare il progetto e quindi selezionare il nome della diapositiva per l'esempio caricato.
    4. Visualizzare l'immagine panoramica nel riquadro ottico dell'immagine della diapositiva.
  3. Selezione e acquisizione del campo visivo (FOV)
    1. Fare clic sul menu Modalità e selezionare SED (Secondary Electron Detector). Fare clic sul menu della modalità di imaging e selezionare QC −300 μm.
    2. Fare clic su Jog Stage per controllare la posizione del FOV e quindi fare clic sulle frecce per navigare e selezionare la posizione del FOV.
    3. Fare clic su Aggiungi FOV, impostare 400 μm x 400 μm come dimensione del campo e selezionare Fine come modalità di imaging e 1 ms di tempo di permanenza. Fai clic su Conferma.
      NOTA: il tempo di permanenza impostato dipenderà dalla risoluzione desiderata. Il tempo di permanenza aumenta all'aumentare della risoluzione. Il tempo di acquisizione può variare in base a molteplici fattori, tra cui il periodo di rodaggio del rilevatore e la durata del funzionamento. Il nostro tempo medio di acquisizione per un FOV è di circa 17 minuti. Utilizzare lo strumento senza sosta per un massimo di 8 ore, il che consente la scansione di circa 28 FOV. La qualità delle immagini acquisite diminuisce dopo molte ore consecutive di utilizzo.
    4. Dopo aver creato un elenco FOV, procedere alla messa a fuoco dell'immagine e regolare la stigmatizzazione spostando il raggio in una regione del tessuto che non verrà ripresa. Regolare i parametri fino ad ottenere un'immagine centrale chiara.
      NOTA: per ottimizzare l'acquisizione delle immagini, è ideale mantenere la sezione di tessuto centralizzata sulla diapositiva. Durante la messa a fuoco, è possibile ottenere un'immagine chiara solo dell'area centrale. Se la sezione del tessuto è troppo grande, i bordi saranno sfocati e l'immagine sarà sfocata.
    5. Fare clic su Avvia esecuzione. Le immagini acquisite verranno automaticamente caricate e archiviate nell'applicazione di gestione delle immagini basata sul web.

6. Preparazione dell'immagine

  1. Correzione isobarica dell'immagine
    NOTA: Lo scopo della correzione isobarica è quello di rimuovere il segnale di spillover tra i canali risultante dalla presenza di isotopi di massa uguale o molto simile le cui differenze di massa non possono essere rilevate utilizzando l'analizzatore di massa.
    1. Nell'applicazione di gestione delle immagini basata sul Web, fare clic sull'icona verde Download per salvare i FOV (immagini TIFF).
    2. Scaricare la versione più aggiornata del software di elaborazione delle immagini (vedere Tabella dei materiali) disponibile nella scheda Informazioni nell'applicazione di gestione delle immagini basata sul Web e salvarla in un file. Aprire il file di archivio .zip e seguire i passaggi di installazione. Aprire il software una volta completata l'installazione.
    3. Selezionare la cartella contenente le immagini da correggere facendo clic sull'icona File nel riquadro di input del software di elaborazione delle immagini. Verrà caricato un elenco FOV.
    4. Fare clic sull'icona Filtro nel riquadro di input per applicare le correzioni predefinite. Per ogni canale, visualizzare le immagini ottenute prima e dopo la correzione sul lato destro dello schermo.
    5. Fare clic sull'icona del disco floppy nel riquadro di output per salvare l'immagine corretta.
  2. Filtro immagini: tassellatura di Voronoi
    NOTA: I diagrammi di tassellatura di Voronoi illustrano una partizione dello spazio contenente punti di semina nelle celle di Voronoi. L'obiettivo è stimare la densità cellulare e definire i confini cellulari. Utilizzando il calcolo della tassellatura di Voronoi, viene generata una maschera che viene applicata all'immagine originale per il filtraggio.
    1. Fare clic sulla scheda Filtro e selezionare Voronoi Tesselation dal menu dei parametri di filtraggio.
    2. Nel riquadro di input selezionare l'immagine MassCorrected.tiff. Fare clic sull'icona Filtro nel riquadro di input.
    3. Fare clic sull'icona Disco floppy nel riquadro di output per salvare l'immagine filtrata. I due file risultanti avranno i suffissi -Filtered.tiff e -Filtered.json.
      NOTA: l'immagine denominata MassCorrected-Filtered.tiff può quindi essere caricata in un programma software di analisi digitale di terze parti o in un programma software open source.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sono state ottenute sezioni di tessuto TMA di tonsille e adenocarcinoma polmonare (spessore 5 mm) e posizionate al centro di vetrini rivestiti d'oro seguendo le specifiche relative alle dimensioni del tessuto e ai margini sicuri dei vetrini. I margini di vetro liberi di 5 mm e 10 mm tra il bordo del tessuto e i bordi laterali e inferiori dei vetrini, rispettivamente, sono necessari per una colorazione ottimale. Le sezioni di tessuto sono state cotte durante la notte in un forno prima della colorazione per garantire la co...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La spiegazione completa delle complesse e intricate interazioni tra le molteplici componenti di una TME rimane un obiettivo fondamentale della ricerca sul cancro. I produttori hanno introdotto numerosi saggi multiplex come parte di questo sforzo, specialmente negli ultimi 5 anni. L'analisi spaziale multiplexata è uno strumento versatile e potente che facilita la categorizzazione simultanea di diversi bersagli preservando la morfologia strutturale nei campioni tumorali. Le tecniche di analisi spaziale possono essere esegu...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno conflitti da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori ringraziano Don Norwood di Editing Services, Research Medical Library di MD Anderson per aver modificato questo articolo e il Multiplex Immunofluorescence and Image Analysis Laboratory presso il Department of Translational Molecular Pathology di MD Anderson. Questa pubblicazione è il risultato in parte della ricerca facilitata dal supporto scientifico e finanziario per il Cancer Immune Monitoring and Analysis Centers-Cancer Immunologic Data Commons Network (CIMAC-CIDC) fornito attraverso il National Cancer Institute (NCI) Cooperative Agreement (U24CA224285) all'Università del Texas MD Anderson Cancer Center Cancer Immune Monitoring and Analysis Center (CIMAC).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100% Alcool ReagenteSigma-AldrichR8382
95% Alcool ReagenteSigma-AldrichR3404
80% Alcool ReagenteSigma-AldrichR3279
70% Alcool ReagenteSigma-AldrichR315
20X TBS-TIonpath567005
10X PBS a basso contenuto di bario pH 7.4Ionpath
10X Tris pH 8,5 Percorso ionico567003
4 gradi C FrigoriferoThermoScientificREVCO
Puntali per pipette con barriera per aerosol P10Olympus24-401
Puntali per pipette con barriera per aerosol P20Olympus24-404
Puntali per pipette con barriera per aerosol P200Olympus24-412
Puntali per pipette con barriera per aerosol P1000Olympus24-430
Filtro centrifugo Ultrafree-MCFisher ScientificUFC30VV00
percorsoionico H2O deionizzato
Sigma-AldrichD9663
EasyDip, barattolo per la colorazione dei vetrini EasyDipGreen, microscopia elettronica verde Sciences71385-G
Barattolo per la colorazione dei vetrini EasyDip,microscopia elettronica gialla Sciences71385-Y
EasyDip Kit di colorazione dei vetrini (barattolo+rack),microscopia elettronica bianca Sciences71388-01
Supporto in acciaio inossidabile EasyDip Microscopiaelettronica Sciences71388-50
Glutaraldeide 70% Microscopia elettronica di grado EMSciences16360
Buffer per il recupero dell'epitopo indotto dal calore (HIER): 10X Tris con EDTA, pH 9DakoS2367
Vetrino resistente al calore cameraMicroscopia elettronica Scienze62705-01
Penna barriera idrofobicaFisher50-550-221
Software MIBI/OIonpathNA
MIBIslideIonpath567001
MIBIscopeIonpathNA
MicrocentrifugaEppendorf5415D
MicrotomoLeicaRM2135
umidità (camera umida)SimportM922-1
salina tamponata con fosfato (PBS) CompresseFisher ScientificBP2944100
Modulo PTThermo ScientificA80400012
Unità filtranti monouso sterili a flusso rapidoFisher Scientific097403A
AgitatoreBioRockerS2025
Colonna di rotazione (Filtro di rotazione Ultrafree-MC, 0,5 ml 0,1μ m )MillQUFC30VV00
Forno a scorrimentoFisher Scientific6901
Essiccatore per armadio sottovuotoVWR30621-076
Task-whipeKimberly Clark34155
XyleneSigma-Aldrich534056-4L
567004 Siero d'asino per 567002 del Software MIBIcontrol Ionpath NA Camera di Soluzione

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Laplane, L., Duluc, D., Bikfalvi, A., Larmonier, N., Pradeu, T. Beyond the tumour microenvironment. International Journal of Cancer. 145 (10), 2611-2618 (2019).
  2. Galli, F., et al. Relevance of immune cell and tumor microenvironment imaging in the new era of immunotherapy. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 39 (1), 89(2020).
  3. Liu, C. C., Steen, C. B., Newman, A. M. Computational approaches for characterizing the tumor immune microenvironment. Immunology. 158 (2), 70-84 (2019).
  4. Eisenstein, M. Cell sorting: Divide and conquer. Nature. 441 (7097), 1179-1185 (2006).
  5. Scognamiglio, G., et al. Multiplex immunohistochemistry assay to evaluate the melanoma tumor microenvironment. Methods in Enzymology. 635, 21-31 (2020).
  6. Guo, N., et al. A 34-marker panel for imaging mass cytometric analysis of human snap-frozen tissue. Frontiers in Immunology. 11, 1466(2020).
  7. Fu, T., et al. Spatial architecture of the immune microenvironment orchestrates tumor immunity and therapeutic response. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 98(2021).
  8. Rost, S., et al. Multiplexed ion beam imaging analysis for quantitation of protein expresssion in cancer tissue sections. Laboratory Investigation. 97 (8), 992-1003 (2017).
  9. Keren, L., et al. A structured tumor-immune microenvironment in triple negative breast cancer revealed by multiplexed ion beam imaging. Cell. 174 (6), 1373-1387 (2018).
  10. Mathieson, W., Thomas, G. A. Why formalin-fixed, paraffin-embedded biospecimens must be used in genomic medicine: An evidence-based review and conclusion. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 68 (8), 543-552 (2020).
  11. Baghban, R., et al. Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59(2020).
  12. Cai, S., Allam, M., Coskun, A. F. Multiplex spatial bioimaging for combination therapy design. Trends in Cancer. 6 (10), 813-818 (2020).
  13. Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics. NPJ Precision Oncology. 4, 11(2020).
  14. Rad, H. S., et al. The Pandora's box of novel technologies that may revolutionize lung cancer. Lung Cancer. 159, 34-41 (2021).
  15. Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Commununications. 40 (4), 135-153 (2020).
  16. Ptacek, J., et al. Multiplexed ion beam imaging (MIBI) for characterization of the tumor microenvironment across tumor types. Laboratory Investigation. 100 (8), 1111-1123 (2020).

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