Espansione della comprensione del microambiente tumorale mediante spettrometria di massa Imaging di campioni di tessuto fissati in formalina e incorporati in paraffina

L'importanza dei numerosi tipi di cellule che circondano le popolazioni tumorali clonali è un elemento cruciale nella categorizzazione della carcinogenesi. L'interesse nel chiarire la composizione e le interazioni di questo microambiente tumorale (TME) è aumentato continuamente in seguito all'istituzione della terapia a base immunitaria come parte dell'arsenale di trattamento del cancro. Pertanto, le strategie di trattamento sono passate da un approccio incentrato sul tumore a uno incentrato sulla TME¹.

Gli sforzi per chiarire il ruolo delle cellule immunitarie nella sorveglianza del tumore e nello sviluppo del cancro sono aumentati notevolmente negli ultimi anni ^2,3. Nella ricerca medica, una pletora di metodi, tra cui metodi basati sulla citometria e tecnologie di imaging singleplex e multiplex, sono sorti come parte di questo tentativo di decifrare le interazioni uniche di più elementi delle TME.

Metodi pionieristici come la citometria a flusso (inventata nel 1960), la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza e la citometria di massa si concentrano principalmente sull'identificazione e la quantificazione dei componenti della TME⁴. Anche se le tecniche quantitative basate sulla citometria consentono la fenotipizzazione del paesaggio immunitario, determinare la distribuzione spaziale cellulare è impossibile. Al contrario, metodi come l'immunoistochimica singleplex standard preservano l'architettura tissutale e consentono ai ricercatori di analizzare la distribuzione cellulare, sebbene un numero ridotto di bersagli in una singola sezione di tessuto sia una limitazione di questi metodi ^5,6. Negli ultimi anni, le tecnologie di imaging multiplexed per la risoluzione di singole cellule come l'immunofluorescenza multiplex, l'imaging a fluorescenza con codice a barre e la spettrometria di massa per imaging sono emerse come strategie complete per acquisire informazioni sulla colorazione simultanea dei marcatori utilizzando la^{stessa sezione 7} del tessuto.

Qui presentiamo una tecnologia che accoppia anticorpi marcati con metalli e spettrometria di massa a ioni secondari e consente la quantificazione della risoluzione di singole cellule, la co-espressione dei marcatori (fenotipizzazione) e l'analisi spaziale utilizzando campioni di tessuto fissati in formalina, incorporati in paraffina (FFPE) e freschi congelati (FF) ^8,9. I campioni FFPE sono i materiali più utilizzati per i campioni di archiviazione dei tessuti e rappresentano una risorsa più facilmente disponibile per le tecnologie di imaging multiplexed rispetto ai campioni freschi congelati¹⁰. Inoltre, questa tecnologia offre la possibilità di riacquisire le immagini mesi dopo. Qui, discutiamo i nostri protocolli di colorazione ed elaborazione delle immagini utilizzando campioni di tessuto FFPE.

I campioni di tessuto sono stati ottenuti per scopi di ricerca in conformità con l'Institutional Review Board dell'Università del Texas MD Anderson Cancer Center e i campioni sono stati ulteriormente de-identificati.

1. Selezione degli anticorpi

1. Definire le domande di ricerca per scegliere i migliori cloni anticorpali disponibili. Utilizzare l'Atlante delle proteine umane, la ricerca pubblicata e i siti Web dei produttori di anticorpi come risorse di ricerca.
   NOTA: La selezione di adeguati controlli dei tessuti umani e degli stessi controlli dei tessuti umani da colorare nelle diverse fasi è fondamentale per assicurarsi che i marcatori siano colorati correttamente, nel posto giusto e nel corretto compartimento cellulare. Un piccolo microarray tissutale (TMA) che includa tessuti normali e tessuti neoplastici è sempre raccomandato per la convalida della colorazione.
2. Utilizzare solo anticorpi carrier-free per progettare il pannello.
   NOTA: L'uso di formulazioni anticorpali carrier-free è richiesto se non è disponibile un anticorpo commerciale carrier-free; I kit di purificazione possono essere utilizzati per adattare l'anticorpo alla formulazione corretta. Gli additivi proteici come l'albumina sierica bovina sono noti per diminuire la capacità di coniugazione.
3. Testare e titolare ciascun anticorpo utilizzando l'immunoistochimica cromogenica standard per determinare il pattern subcellulare dell'espressione di un marcatore; colorazione di membrana, citoplasmatica o nucleare; ed espressione in cellule specifiche nei tessuti di controllo.
   NOTA: Tuttavia, ogni anticorpo deve essere testato in acido etilendiamminotetraacetico pH 6 e acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e deve essere determinato se il pannello sarà colorato con citrato pH 6 o pH 9 EDTA. Si raccomanda l'uso di pH 9 EDTA per ottenere buoni segnali, specialmente quando si lavora con questa metodologia.
4. Scegli la concentrazione di colorazione ottimale in base al modello di espressione nei controlli positivi.
5. Assegnare ogni anticorpo a uno degli isotopi metallici disponibili in base all'abbondanza di marcatori immunoistochimici, alla localizzazione subcellulare e alla co-espressione cellulare con gli altri bersagli.
6. Colorare l'anticorpo con il metallo assegnato corrispondente e confrontarlo con l'espressione nello stesso tessuto di controllo utilizzato in precedenza.
   NOTA: La coniugazione degli anticorpi metallici inizia con la preparazione, la riduzione e la successiva coniugazione degli anticorpi (file supplementare 1). Ogni tubo polimerico caricato con metallo è sufficiente per etichettare 100 μg di un anticorpo.

2. Design del pannello anticorpale

1. Creare piccoli lotti di colorazione anticorpale. Prova fino a cinque marcatori in un cocktail.
   NOTA: Il test di anticorpi già coniugati e analizzati utilizzando l'immunoistochimica in lotti facilita l'identificazione precoce delle interferenze dei canali e offre l'opportunità di riconiugare gli anticorpi con un altro metallo. Offre inoltre l'opportunità di valutare un'adeguata co-espressione dei marcatori.
2. Colorare ogni piccolo lotto con quattro diverse concentrazioni di anticorpi (0,05 μg/mL, 0,2 μg/mL, 1 μg/mL e 4,0 μg/mL).
   NOTA: Confrontando diversi titoli, identificare la concentrazione di anticorpi che risulta nella posizione corretta e nella massima espressione con una minima colorazione di fondo (miglior rapporto segnale-rumore).

3. Sezionamento del tessuto FFPE

1. Selezionare vetrini rivestiti d'oro (specifici per questo scopo) e tenerli vicino al microtomo. Preparare il microtomo inserendo una nuova lama nel supporto. Impostare lo spessore della sezione su 4-5 μm.
2. Metti i blocchi FFPE sul ghiaccio prima di sezionare. Preparare un bagno di galleggiamento tissutale riscaldando acqua distillata o acqua deionizzata (diH₂O) a 40-45 °C.
   NOTA: L'uso di diH₂O o acqua distillata riduce la possibilità di contaminazione.
3. Inizia il sezionamento. Posizionare la sezione di tessuto nell'acqua usando una pinzetta e lasciarla appiattire. Utilizzare i vetrini per rimuovere sezioni di tessuto dall'acqua.
4. Posizionare i vetrini in una griglia e lasciarli asciugare a temperatura ambiente durante la notte.

4. Colorazione anticorpale FFPE

NOTA: Il processo di colorazione avviene in due giorni separati.

ATTENZIONE: Le soluzioni impiegate in questo protocollo sono potenzialmente corrosive e rappresentano pericoli per la pelle e gli occhi. Si consiglia di indossare guanti, un camice da laboratorio e attrezzature protettive per occhi e viso e fa parte della politica di biosicurezza della nostra istituzione.

1. Preparazione del reagente (giorno 1)
   1. Diluire 50 mL di soluzione salina tamponata Tris 20x con Tween (TBS-T) in 950 mL di diH₂O per ottenere 1 L di TBS-T.
   2. Diluire 8 mL di acido tris-etilendiamminotetraacetico (EDTA) 10x in 72 mL di diH₂O per ottenere una soluzione 1x di recupero dell'epitopo indotta dal calore (HIER).
   3. Diluire il siero d'asina in 1x TBS-T ad una concentrazione finale del 5% per ottenere un tampone bloccante. Conservare la soluzione a 4 °C fino al momento dell'uso.
2. Preparazione HIER: modulo di pretrattamento (PT)
   ATTENZIONE: Indossare guanti di protezione chimica quando si maneggiano reagenti o parti immerse in qualsiasi reagente utilizzato nel modulo PT.
   1. Diluire 140 mL di soluzione salina tamponata fosfato 10x (PBS) in 1.260 mL di diH₂O per ottenere 1,4 L di 1x PBS. In alternativa, diluire sette compresse di PBS in 1,4 L di diH₂O.
   2. Riempire un serbatoio con 1,4 L di PBS e posizionare il contenitore della camera di scorrimento preparato con 100 ml di soluzione 1x HIER nel serbatoio.
   3. Preriscaldare il serbatoio in un modulo PT a 75 °C.
3. Rimozione della paraffina in eccesso
   1. Cuocere i vetrini a 70 °C in forno per almeno 20 min.
      NOTA: Alcuni tessuti o sezioni potrebbero richiedere tempi di cottura più lunghi. Il tempo di cottura raccomandato per il tessuto cerebrale o una TMA è di 1 ora. Questo può essere esteso a 16 ore (durante la notte) o in base all'esperienza di laboratorio.
   2. Posizionare i vetrini cotti in un portavetrini ed eseguire i seguenti passaggi di lavaggio su uno shaker sotto una cappa aspirante. Lavare i vetrini nella seguente soluzione: xilene 2x per 30 s (senza metallo), alcool 100% 2x per 30 s (senza metallo), alcool al 95% 2x per 30 s (senza metallo), alcool 80% per 30 s (senza metallo), alcool al 70% per 30 s (senza metallo) e diH₂O 2x per 30 s (senza metallo).
   3. Conservare i vetrini in un contenitore di diH₂O fresco fino al momento del recupero dell'antigene.
      NOTA: I vetrini non devono essere asciugati fino alla fine della procedura.
4. Recupero dell'antigene
   1. Posizionare le guide in una camera di scorrimento preriscaldata contenente 1 tampone HIER all'interno del modulo PT. Posizionare il coperchio sul serbatoio. Chiudere e chiudere il coperchio.
   2. Premere il pulsante Menu sul modulo PT per aprire il menu principale e premere il pulsante Ciclo di configurazione (tempo e temperatura) per creare un programma personalizzato.
   3. Far funzionare il modulo PT a 97 °C per 40 minuti. Successivamente, il modulo PT si raffredderà automaticamente a 65 °C.
   4. Rimuovere i vetrini dal modulo PT una volta raggiunta la temperatura di 65 °C. Mantenere i vetrini a temperatura ambiente per 30 minuti.
      NOTA: Il modulo PT non si apre fino a quando la temperatura non si raffredda a 65 °C. Non toccare la superficie dorata dei vetrini durante questo processo e utilizzare sempre i guanti.
5. Blocco degli anticorpi
   1. Impostare uno shaker a 70 giri/min.
   2. Lavare i vetrini immergendoli in 1x TBS-T per 5 minuti 2x.
   3. Utilizzando una penna barriera idrofobica, disegnare un bordo attorno alla sezione di tessuto ad almeno 1 mm di distanza dai bordi del vetrino e lasciarlo asciugare per 15-30 s.
      NOTA: Evitare che il liquido della penna tocchi la sezione del tessuto per evitare interferenze tissutali con la colorazione. Non premere la penna troppo forte mentre si disegna la barriera per evitare potenziali perdite. Per ottenere risultati ottimali di colorazione e acquisizione delle immagini, le sezioni di tessuto sono posizionate al centro dei vetrini rivestiti d'oro in una cornice non più grande di 15 mm x 30 mm per consentire spazio sufficiente per disegnare la barriera senza toccare il tessuto o i punti guida posizionati sul bordo esterno del vetrino.
   4. Per rimuovere eventuali residui di penna, immergere i vetrini in TBS-T.
   5. In una camera di umidità a temperatura ambiente, incubare la sezione di tessuto con 100-200 μL di tampone bloccante per 20 minuti. Lasciare il tessuto in incubazione nel tampone bloccante fino a quando una miscela principale di anticorpi è pronta.
6. Preparazione del pannello anticorpale
   NOTA: Il volume finale del cocktail del pannello anticorpale varia in base alla superficie stimata della sezione tissutale. Per coprire un'area di 20 mm x 20 mm, preparare 100-200 μL del cocktail.
   Effettuare le seguenti operazioni per preparare un cocktail di pannelli anticorpali di anticorpi coniugati con isotopi metallici:
   1. Confermare il volume finale del cocktail che corrisponde al volume del cocktail di anticorpi aggiunto al volume del tampone bloccante.
   2. Confermare le specifiche per tutti gli anticorpi, le diluizioni e/o le concentrazioni di anticorpi in un foglio di calcolo del pannello per il progetto.
   3. Ruotare tutti i tubi contenenti anticorpi a 10.000 x g per 5 minuti. Aggiungere singoli anticorpi al tampone bloccante e mescolare molto bene. Non disturbare il fondo del tubo anticorpale durante il pipettaggio.
   4. Filtrare il pannello anticorpale preumidando un dispositivo di filtraggio centrifugo da 0,1 μm con 100 μL di tampone bloccante. Ruotare il filtro a 10.000 x g per 2 minuti e rimuovere il flusso del buffer di blocco con una pipetta.
   5. Trasferire il pannello anticorpale in una colonna di rotazione e ruotare il filtro a 10.000 x g per 2 minuti. Scartare la colonna di rotazione e utilizzare il flow-through come pannello anticorpale filtrato.
      NOTA: Eseguire la colorazione immediatamente dopo aver preparato il cocktail per evitare lo scambio di metallo. Se è necessaria la conservazione del cocktail anticorpale per un tempo prolungato, può essere sottoposto a liofilizzazione.
7. Colorazione anticorpale
   1. Rimuovere con attenzione il buffer di blocco dalle diapositive ribaltando ogni diapositiva su un lato e toccando delicatamente i bordi contro un tergicristallo delle attività.
   2. Posizionare i vetrini in una camera di umidità e aggiungere 100-200 μL di miscela principale anticorpale al tessuto (evitare il contatto con il tessuto e la creazione di bolle d'aria).
   3. Aggiungi vetrini di controllo positivi e negativi al batch di colorazione.
   4. Incubare i vetrini a 4 °C durante la notte (14-16 h).
8. Preparazione del reagente (giorno 2)
   1. Diluire 100 mL di PBS 10x a basso contenuto di bario, pH 7,4, in 900 mL di diH₂O per ottenere 1x PBS.
   2. Preparare 350 mL di una soluzione madre di lavoro di glutaraldeide al 2% in PBS a basso contenuto di bario (340 mL di PBS a basso contenuto di bario + 10 mL di glutaraldeide al 70%).
      NOTA: Eseguire la diluizione sotto un cappuccio. La glutaraldeide è un liquido molto viscoso. Utilizzare una pipetta da 1 mL e aggiungere 1 mL di PBS a basso contenuto di bario al tubo di glutaraldeide ogni volta fino a quando non diventa abbastanza liquido da fuoriuscire dal tubo.
   3. Diluire 10x Tris, pH 8,5, in 900 mL di diH₂0 per ottenere 1x Tris.
9. Fissazione e disidratazione
   1. Rimuovere la miscela principale di anticorpi da ogni vetrino ribaltando la diapositiva su un lato e picchiettando delicatamente il bordo contro un tergicristallo.
   2. Lavare i vetrini con agitazione da leggera a moderata nei seguenti tamponi: 1x TBS-T, 3 volte per 5 minuti ciascuno (senza metallo); glutaraldeide filtrata al 2% per 5 min; filtrato 1x tris, pH 8,5, 3x per 30 s; diH₂O 2x filtrato per 30 s; 70% di alcol per 30 s (senza metallo); 80% di alcol per 30 s (senza metallo); 95% di alcol per 30 s (senza metallo); e alcool al 100% per 30 s (senza metallo).
   3. Picchiettare delicatamente il bordo di ogni diapositiva contro un tergicristallo per rimuovere l'alcol in eccesso e consentire all'alcol residuo di evaporare a temperatura ambiente (~ 5-10 min).
   4. Asciugare i vetrini in un essiccatore per almeno 1 ora prima dell'acquisizione dell'immagine o conservare i vetrini in una camera a vuoto per la conservazione a lungo termine.

5. Acquisizione di immagini

1. Configurazione diapositiva
   NOTA: prima di eseguire la scansione utilizzando lo strumento, le diapositive devono essere definite e configurate utilizzando l'applicazione di gestione delle immagini basata sul Web seguendo i passaggi descritti di seguito.
   1. Nella pagina della diapositiva dell'applicazione di gestione delle immagini basata sul Web, fare clic su Nuova diapositiva di adesione e immettere i dettagli desiderati (nome, identificazione della diapositiva, posizione e descrizione).
   2. Creare sezioni di scansione facendo clic su Aggiungi sezione. Inserire le informazioni per ogni sezione (nome del progetto, nome della diapositiva, blocco e posizione). Per salvare le nuove diapositive/sezioni create, fare clic su Invia.
   3. Nella scheda risorse, apri la pagina dei pannelli e seleziona il pannello da utilizzare. Per i nuovi pannelli, fate clic su Crea nuovo pannello.
   4. Dopo aver selezionato il pannello, fare clic su Sezioni. Aggiungere le sezioni create nel passaggio 2. facendo clic su Modifica assegnazione sezione. Salva facendo clic su Invia.
2. Configurazione dello strumento
   NOTA: Questo strumento (vedi Tabella dei materiali) viene azionato utilizzando uno specifico programma software di controllo (vedi Tabella dei materiali).
   1. Accedere al software di controllo. Fare clic su Riattiva se lo strumento è in modalità di sospensione.
      NOTA: Almeno 1 ora prima dell'operazione, si consiglia di riscaldare lo strumento, il che aiuta con la stabilizzazione della messa a fuoco del fascio.
   2. Per caricare una diapositiva, fare clic su Exchange Sample e quindi fare clic su Continua per aprire la porta. Inserire la diapositiva nello slot di caricamento con il campione rivolto verso l'alto e l'etichetta sulla destra. Fare clic su Continua per chiudere la porta.
      NOTA: se la diapositiva non viene caricata correttamente, verranno visualizzati un suono di avviso e una notifica per regolare la diapositiva.
   3. Selezionare il progetto e quindi selezionare il nome della diapositiva per l'esempio caricato.
   4. Visualizzare l'immagine panoramica nel riquadro ottico dell'immagine della diapositiva.
3. Selezione e acquisizione del campo visivo (FOV)
   1. Fare clic sul menu Modalità e selezionare SED (Secondary Electron Detector). Fare clic sul menu della modalità di imaging e selezionare QC −300 μm.
   2. Fare clic su Jog Stage per controllare la posizione del FOV e quindi fare clic sulle frecce per navigare e selezionare la posizione del FOV.
   3. Fare clic su Aggiungi FOV, impostare 400 μm x 400 μm come dimensione del campo e selezionare Fine come modalità di imaging e 1 ms di tempo di permanenza. Fai clic su Conferma.
      NOTA: il tempo di permanenza impostato dipenderà dalla risoluzione desiderata. Il tempo di permanenza aumenta all'aumentare della risoluzione. Il tempo di acquisizione può variare in base a molteplici fattori, tra cui il periodo di rodaggio del rilevatore e la durata del funzionamento. Il nostro tempo medio di acquisizione per un FOV è di circa 17 minuti. Utilizzare lo strumento senza sosta per un massimo di 8 ore, il che consente la scansione di circa 28 FOV. La qualità delle immagini acquisite diminuisce dopo molte ore consecutive di utilizzo.
   4. Dopo aver creato un elenco FOV, procedere alla messa a fuoco dell'immagine e regolare la stigmatizzazione spostando il raggio in una regione del tessuto che non verrà ripresa. Regolare i parametri fino ad ottenere un'immagine centrale chiara.
      NOTA: per ottimizzare l'acquisizione delle immagini, è ideale mantenere la sezione di tessuto centralizzata sulla diapositiva. Durante la messa a fuoco, è possibile ottenere un'immagine chiara solo dell'area centrale. Se la sezione del tessuto è troppo grande, i bordi saranno sfocati e l'immagine sarà sfocata.
   5. Fare clic su Avvia esecuzione. Le immagini acquisite verranno automaticamente caricate e archiviate nell'applicazione di gestione delle immagini basata sul web.

6. Preparazione dell'immagine

1. Correzione isobarica dell'immagine
   NOTA: Lo scopo della correzione isobarica è quello di rimuovere il segnale di spillover tra i canali risultante dalla presenza di isotopi di massa uguale o molto simile le cui differenze di massa non possono essere rilevate utilizzando l'analizzatore di massa.
   1. Nell'applicazione di gestione delle immagini basata sul Web, fare clic sull'icona verde Download per salvare i FOV (immagini TIFF).
   2. Scaricare la versione più aggiornata del software di elaborazione delle immagini (vedere Tabella dei materiali) disponibile nella scheda Informazioni nell'applicazione di gestione delle immagini basata sul Web e salvarla in un file. Aprire il file di archivio .zip e seguire i passaggi di installazione. Aprire il software una volta completata l'installazione.
   3. Selezionare la cartella contenente le immagini da correggere facendo clic sull'icona File nel riquadro di input del software di elaborazione delle immagini. Verrà caricato un elenco FOV.
   4. Fare clic sull'icona Filtro nel riquadro di input per applicare le correzioni predefinite. Per ogni canale, visualizzare le immagini ottenute prima e dopo la correzione sul lato destro dello schermo.
   5. Fare clic sull'icona del disco floppy nel riquadro di output per salvare l'immagine corretta.
2. Filtro immagini: tassellatura di Voronoi
   NOTA: I diagrammi di tassellatura di Voronoi illustrano una partizione dello spazio contenente punti di semina nelle celle di Voronoi. L'obiettivo è stimare la densità cellulare e definire i confini cellulari. Utilizzando il calcolo della tassellatura di Voronoi, viene generata una maschera che viene applicata all'immagine originale per il filtraggio.
   1. Fare clic sulla scheda Filtro e selezionare Voronoi Tesselation dal menu dei parametri di filtraggio.
   2. Nel riquadro di input selezionare l'immagine MassCorrected.tiff. Fare clic sull'icona Filtro nel riquadro di input.
   3. Fare clic sull'icona Disco floppy nel riquadro di output per salvare l'immagine filtrata. I due file risultanti avranno i suffissi -Filtered.tiff e -Filtered.json.
      NOTA: l'immagine denominata MassCorrected-Filtered.tiff può quindi essere caricata in un programma software di analisi digitale di terze parti o in un programma software open source.

Sono state ottenute sezioni di tessuto TMA di tonsille e adenocarcinoma polmonare (spessore 5 mm) e posizionate al centro di vetrini rivestiti d'oro seguendo le specifiche relative alle dimensioni del tessuto e ai margini sicuri dei vetrini. I margini di vetro liberi di 5 mm e 10 mm tra il bordo del tessuto e i bordi laterali e inferiori dei vetrini, rispettivamente, sono necessari per una colorazione ottimale. Le sezioni di tessuto sono state cotte durante la notte in un forno prima della colorazione per garantire la corretta aderenza della sezione al vetrino. Il pannello anticorpale era composto da 23 marcatori. Nello stesso lotto di colorazione, sono stati inclusi un vetrino per tonsille e un vetrino TMA contenente più tessuti per valutare l'espressione di marcatori espressi in modo scarso nei campioni di adenocarcinoma polmonare (Figura 1). I controlli positivi devono essere scelti in base ai bersagli degli anticorpi utilizzati nei pannelli; ad esempio, per valutare l'espressione di SOX10, sono necessari campioni di melanoma e per valutare l'espressione di GAFP, sono necessari campioni di glioblastoma (Figura 2).

Figura 1: Purezza isotopica e diafonia del canale. La matrice mostra la percentuale di diafonia derivata dalla purezza della sonda e dagli ossidi (scatole blu, ≥0,5%; scatole trasparenti, <0,5%). Per i tag di massa, vengono mostrate le sonde che hanno contribuito almeno allo 0,5% di cross-talk in nessun canale (verde), uno o due canali (giallo) o più di due canali (arancione). Vengono mostrati anche i canali di massa che ricevono almeno lo 0,5% di diafonia da nessuna sonda (verde), una o due sonde (giallo) o più di due sonde (arancione). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Immagini rappresentative di colorazione in diversi tessuti . (A) Adenocarcinoma polmonare. (B) Rene non neoplastico. c) Tonsille. CD20 è mostrato in giallo, Ki67 è mostrato in magenta, CD3 è mostrato in bianco, CD11c è mostrato in verde, CD68 è mostrato in rosso, citocheratina è mostrato in ciano e DNA a doppio filamento (dsDNA) è mostrato in blu. Ingrandimento, 200x. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Questa procedura di colorazione assomiglia molto alla colorazione immunoistochimica standard e si è verificata per due giorni consecutivi. Le cinque fasi principali del protocollo di colorazione sono 1) rimozione in eccesso di paraffina, 2) recupero dell'antigene, 3) blocco degli anticorpi, 4) colorazione degli anticorpi e 5) fissazione e disidratazione (Figura 3). Un passo fondamentale nella procedura di colorazione è quello di prendere precauzioni per evitare la contaminazione da metalli dei campioni, compreso l'uso di reagenti privi di metallo conservati in articoli di plastica e un'attenta manipolazione dei campioni per limitare i danni meccanici. Si consiglia di preparare il cocktail di anticorpi immediatamente prima della colorazione. Questo riduce lo scambio di metalli. Una volta completata la colorazione, abbiamo conservato i vetrini e li abbiamo scansionati il giorno successivo. Prima dell'acquisizione delle immagini, un passaggio necessario è l'impostazione delle diapositive utilizzando un'applicazione di gestione delle immagini basata sul Web (Figura 4).

Figura 3: Flusso di lavoro di acquisizione delle immagini e diapositiva associata. (A) Riepilogo del flusso di lavoro di acquisizione delle immagini. 1) Una sezione di tessuto FFPE colorata con anticorpi coniugati con metallo viene rasterizzata utilizzando una pistola ionica primaria, rilasciando ioni secondari. 2) Uno spettrometro di massa a tempo di volo separa e misura gli ioni in base alla loro massa a livello di pixel. 3) Quantificazione pixel-based di ioni secondari. L'asse y corrisponde al numero di ioni rilevati (picco) e l'asse x corrisponde alla massa di ciascun metallo. 4) Sulla base del picco di ogni spettro di massa, vengono ricostruite immagini multidimensionali. (B) Schema della diapositiva utilizzata in questa procedura. Per una colorazione ottimale del tessuto, la sezione deve essere posizionata ad almeno 5 mm dal bordo laterale del vetrino e a 10 mm dal bordo inferiore. Quando si disegna la barriera idrofobica attorno alla sezione del tessuto, deve essere mantenuta all'interno del rettangolo ad almeno 1 mm dal bordo del vetrino. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Impostazione delle diapositive nell'applicazione di gestione delle immagini basata sul Web. Prima di eseguire la scansione delle diapositive, è necessario impostare ogni diapositiva. Immettere i dettagli desiderati che possono aiutare con l'identificazione della diapositiva. Fare clic su Aggiungi sezione (freccia nera) per includere le informazioni sul blocco e sulla posizione. Per salvare, fai clic su Invia (freccia rossa). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Il giorno della scansione, accendere lo strumento di acquisizione utilizzando il software di controllo. Cliccando su Exchange Slide si apriva lo sportello dello strumento, permettendo il caricamento di una diapositiva. Abbiamo posizionato la slitta sulla fessura di carico rivolta verso l'alto con l'etichetta sul lato destro. È possibile eseguire la scansione di una sola diapositiva alla volta. Il passo successivo è stato selezionare i FOV e regolare il focus e la stigmatizzazione seguendo i passaggi descritti nel protocollo. Abbiamo acquisito le immagini cliccando su Start Run. Il tempo di acquisizione varia a seconda della dimensione del FOV e della risoluzione desiderata. La dimensione del FOV varia da 200 μm x 200 μm a 800 μm x 800 μm, che corrisponde a un intervallo di dimensioni del fotogramma da 128 pixel x 128 pixel a 2048 pixel x 2048 pixel. Sono disponibili tre risoluzioni standard: grossolana, fine e superfine. La scansione di FOV più grandi a risoluzione superfine richiede molto tempo, con il tempo di acquisizione finale per un FOV che va da 25 s a 4,7 h (Figura 5).

Figura 5: Acquisizione di immagini mediante il software di controllo. Le impostazioni di acquisizione possono essere regolate come desiderato. Per modificare la risoluzione di scansione, fare clic sul menu a discesa per Modalità imaging (freccia nera). Per modificare la dimensione del campo FOV, immettere un numero nel campo Dimensione FOV (μm) (freccia rossa). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Al termine della scansione, un set di immagini che include tutti i FOV è stato caricato automaticamente nell'applicazione di gestione delle immagini basata sul Web. Oltre alla memorizzazione delle immagini, questa applicazione consente la visualizzazione di tutti i canali insieme o separatamente, le regolazioni delle immagini e il download delle immagini per un'ulteriore preparazione. L'immagine visualizzata standard viene salvata come file TIFF (Figura 6).

Figura 6: Visualizzazione delle immagini utilizzando l'applicazione di gestione delle immagini basata sul Web. Le immagini acquisite vengono memorizzate e visualizzate utilizzando la piattaforma online. È possibile regolare i parametri di visualizzazione e cambiare il colore di ciascun marcatore. Fare clic su Aggiungi canale immagine (freccia bianca) per visualizzare altri marcatori. Ingrandimento, 200x. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Le interferenze metalliche sono inerenti ai metodi di etichettatura dei metalli nonostante l'uso di strategie per ridurle al minimo. Per rimuovere i segnali di fondo in eccesso dall'isotopo metallico coniugato agli anticorpi e preparare le immagini per l'analisi, abbiamo utilizzato il software di elaborazione delle immagini associato (vedi Tabella dei materiali). La procedura di preparazione dell'immagine prevede due fasi: 1) correzione isobarica, che rimuove i segnali tra i canali, e 2) filtraggio, che rimuove i segnali causati dagli aggregati sull'immagine.

Per avviare la correzione isobarica, il file contenente l'immagine TIFF salvata è stato selezionato facendo clic sull'icona File del riquadro di input. Il software carica automaticamente tutte le immagini TIFF archiviate nel file, consentendo l'analisi batch. Successivamente, abbiamo corretto l'immagine facendo clic sull'icona Filtro del riquadro di input. Due file risultanti con il suffisso -MassCorrected sono stati generati automaticamente: uno archiviato in formato TIFF e l'altro archiviato in formato JSON. Per impostazione predefinita, gli archivi risultanti sono stati salvati nello stesso file da cui è stata caricata l'immagine iniziale (Figura 7).

Figura 7: Preparazione dell'immagine: fase di correzione. Per caricare un'immagine per la preparazione nel software di elaborazione delle immagini, fare clic sull'icona File nel riquadro di input (freccia nera) e selezionare l'immagine. Per applicare la procedura di correzione predefinita, fare clic sull'icona Filtro nel riquadro di input (freccia rossa). Per salvare l'immagine aggiornata e corretta, fare clic sull'icona del disco floppy nel riquadro di output. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Il secondo passo della preparazione delle immagini è il filtraggio, che può essere selezionato nella scheda superiore del software. Abbiamo selezionato l'immagine corretta nel riquadro di input. In questa fase, la tassellatura automatica di Voronoi è stata utilizzata come parametro di filtraggio. Facendo clic sull'icona del filtro nel pannello di input, il filtro selezionato è stato applicato automaticamente a tutti i canali. In entrambe le fasi di preparazione dell'immagine (correzione e filtraggio), le immagini di ciascun canale prima e dopo l'elaborazione e le differenze di segnale vengono visualizzate sul lato destro dello schermo.

Analogamente alla fase di correzione isobarica, sono stati generati due nuovi archivi, uno in formato TIFF e uno in formato JSON. In questo passaggio, il suffisso che segue il nome del file era -Filtered. Pertanto, l'immagine finale ottenuta è stata denominata MassCorrected-Filtered.tiff. Completando questi passaggi, abbiamo preparato l'immagine per l'analisi utilizzando il software di patologia digitale preferito (Figura 8 e Figura 9). Utilizzando questa tecnica, siamo stati in grado di analizzare tutti i 23 marcatori nel pannello anticorpale con interferenze minime tra i canali a livello subcellulare in una singola sezione di tessuto.

Figura 8: Preparazione dell'immagine: fase di filtraggio. Selezionare Filtro nella scheda superiore (freccia nera) nel software di elaborazione delle immagini. In Parametri filtro selezionare il metodo desiderato (freccia verde). Nel riquadro di input selezionare Immagine con correzione massa. Per applicare la procedura selezionata all'immagine, fare clic sull'icona Filtro nel riquadro di input (freccia rossa). Per salvare l'immagine filtrata aggiornata, fare clic sull'icona Disco floppy nel riquadro di output. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 9: Immagini rappresentative della colorazione prima e dopo la preparazione dell'immagine. (A) Immagine di una sezione di tessuto tonsillare colorata con questa tecnica e visualizzata utilizzando un programma software di analisi delle immagini digitali di terze parti prima del filtraggio e della correzione. (B) Immagine della stessa sezione nelle stesse condizioni dopo le fasi di filtraggio e correzione. CD20 è mostrato in giallo, Ki67 è mostrato in magenta, CD3 è mostrato in bianco, CD11c è mostrato in verde, citocheratina è mostrato in ciano e DNA a doppio filamento (dsDNA) è mostrato in blu. Ingrandimento, 200x. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

File supplementare 1: Elenco del pannello anticorpale. Ogni anticorpo è stato coniugato a uno specifico isotopo metallico con una massa diversa come elencato. Clicca qui per scaricare questo file.

Gli autori non hanno conflitti da rivelare.