Un semplice protocollo di analisi dei pozzi per visualizzare e quantificare il riassorbimento osteoclastico in vitro

Summary

Qui, presentiamo una procedura di analisi semplice ed efficace per i saggi di riassorbimento della fossa utilizzando piastre di coltura cellulare rivestite di fosfato di calcio.

Abstract

Gli osteoclasti maturi sono cellule multinucleate che possono degradare l'osso attraverso la secrezione di acidi ed enzimi. Svolgono un ruolo cruciale in varie malattie (ad esempio, l'osteoporosi e il cancro alle ossa) e sono quindi importanti oggetti di ricerca. In vitro, la loro attività può essere analizzata dalla formazione di pozzi di riassorbimento. In questo protocollo, descriviamo un semplice metodo di analisi dei pozzi che utilizza piastre di coltura cellulare rivestite di fosfato di calcio (CaP), che possono essere facilmente visualizzate e quantificate. I precursori degli osteoclasti derivati da cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC) sono stati coltivati sulle piastre rivestite in presenza di stimoli osteoclastogeni. Dopo 9 giorni di incubazione, gli osteoclasti sono stati fissati e colorati per l'imaging a fluorescenza mentre il rivestimento CaP è stato controcolorato dalla calceina. Per quantificare l'area riassorbita, il rivestimento CaP sulle piastre è stato colorato con AgNO_{3 al} 5% e visualizzato mediante imaging a campo luminoso. L'area della fossa di riassorbimento è stata quantificata utilizzando ImageJ.

Introduction

Gli osteoclasti (OC) sono macrofagi tessuto-specifici derivati da cellule staminali ematopoietiche (HSC), che svolgono un ruolo fondamentale nel rimodellamento osseo insieme agli osteoblasti¹. I disturbi ossei indotti da ormoni sessuali, immunologici e maligni che distruggono l'osso a livello sistemico o locale sono dovuti all'eccessiva attività osteoclastica, tra cui l'osteoporosi correlata alla menopausa², l'artrite reumatoide³, la malattia parodontale⁴, la malattia ossea del mieloma⁵ e le metastasi ossee osteolitiche⁶. Al c....

Protocol

Il protocollo è stato rivisto e approvato dal comitato etico locale (numero di approvazione 287/2020B02).

1. Preparazione di piastre di coltura cellulare rivestite di fosfato di calcio

1. Preparazione di soluzione madre di calcio (25 mM CaCl₂·_{2H 2}O, 1,37 mM NaCl, 15 mM MgCl₂·6H₂O in tampone Tris)
   1. Preparare il tampone Tris da 1,0 M e regolare il pH a 7,4 utilizzando 1 M HCl.
   2. Impostare un becher di vetro su un agitatore magnetico e aggiungere 100 ml di tampone Tris da 1,0 M.
   3. Pesare 0,368 g di CaCl₂·2H₂O, 8,0 g di NaCl e 0,30....

Results

Il rivestimento di fosfato di calcio sul fondo delle piastre di coltura cellulare è stato eseguito in due fasi di rivestimento comprendenti una precalcificazione di 3 giorni e una fase di calcificazione di 1 giorno. Come mostrato nella Figura 1, il fosfato di calcio uniformemente distribuito è stato ottenuto sul fondo delle piastre a 96 pozzetti. Il rivestimento ha aderito molto bene al fondo dopo le fasi di lavaggio eseguite.

Discussion

Qui descriviamo un metodo semplice e affidabile per un test di riassorbimento osteoclastico utilizzando OC derivati ed espansi in vitro da PBMC. Le piastre di coltura cellulare rivestite in CaP utilizzate possono essere facilmente preparate e visualizzate utilizzando materiali disponibili in laboratorio. Oltre alle PBMC non selezionate adottate in questo protocollo, anche le OC generate da cellule monocitiche murine²¹ e cellule macrofagiche del midollo osseo¹⁷ sono.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AgNO3	SERVA Electrophoresis GmbH	35110	Nitrato d'argento
a-MEM	Gibco	32561-029	MEM alfa, GlutaMAX, senza nucleosidi
amfotericina B	Biochrom	03-028-1B	Soluzione di amfotericina B
CaCl2	Sigma-Aldrich	21097-50G	Cloruro di calcio diidrato
Calcein	Sigma-Aldrich	C0875	Calcein
FBS	Sigma-Aldrich	F7524	siero fetale bovino
Ficoll	Cytiva	17144002	Ficoll Paque Plus
Tampone di fissazione	Biolegend	420801	Paraformaldeide
HCl	Merk	1.09057.1000	Acido cloridrico
Hoechst 33342	Promochina	PK-CA707-40046	Hoechst 33342
M-CSF	PeproTech	300-25	M-CSF umano ricombinante
MgCl2	Sigma-Aldrich	7791-18-6	Cloruro di magnesio
Na2HPO4	AppliChem GmbH	A2943,0250	di- Sodio idrogeno fosfato anidro
NaCl	Merk	S7653-250G	cloruro di sodio
NaHCO3	Merk	K15322429	Bicarbonato di sodio
PBS	Lonza	17-512F	salina tamponata con fosfato di Dulbecco (1X), DBPS senza calcio e magnesio
Pen-Strep	Lonza	DE17-602E	Miscela penicillina-streptomicina
Falloidina-Alexa Fluor 546	Invitrogen	A22283	Alexa Fluor 546 Falloidina
RANKL	PeproTech	310-01	Ligando umano ricombinante sRANK (derivato da E.coli)
Tris	Sigma-Aldrich	93362	Tris(idrossimetil)amminomethan
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Alchil fenil polietilenglicole
TrypLE Express	Gibco	12605010	Enzimi ricombinanti per la dissociazione cellulare