Uso di pinzette ottiche doppie e microfluidica per studi a singola molecola

Sommario

La biochimica visiva a singola molecola studiata attraverso camere microfluidiche è notevolmente facilitata utilizzando barili di vetro, siringhe a tenuta di gas, connessioni stabili di tubi alle celle di flusso ed eliminazione delle bolle posizionando valvole di commutazione tra le siringhe e i tubi. Il protocollo descrive due trappole ottiche che consentono la visualizzazione delle transazioni del DNA e delle interazioni intermolecolari.

Abstract

La biochimica visiva è una potente tecnica per osservare le proprietà stocastiche di singoli enzimi o complessi enzimatici che sono oscurati nella media che avviene negli studi in fase di massa. Per ottenere la visualizzazione, le pinzette ottiche doppie, in cui una trappola è fissa e l'altra è mobile, sono focalizzate in un canale di una camera microfluidica multi-flusso posizionata sul palco di un microscopio a fluorescenza invertita. Le pinzette ottiche intrappolano singole molecole di DNA marcato fluorescentmente e il fluido scorre attraverso la camera e oltre le perle intrappolate, allunga il DNA in forma B (sotto una forza minima, cioè 0 pN) con l'acido nucleico osservato come una stringa bianca su uno sfondo nero. Le molecole di DNA vengono spostate da un flusso all'altro, traslando lo stadio perpendicolarmente al flusso per consentire l'avvio delle reazioni in modo controllato. Per raggiungere il successo, i dispositivi microfluidici con canali otticamente trasparenti sono accoppiati a siringhe di vetro tenute in posizione in una pompa a siringa. I risultati ottimali utilizzano connettori legati in modo permanente alla cella di flusso, tubi meccanicamente rigidi e resistenti agli agenti chimici e collegati a valvole di commutazione che eliminano le bolle che impediscono il flusso laminare.

Introduzione

La capacità di visualizzare le interazioni proteina-DNA a livello di singola molecola e in tempo reale ha fornito informazioni significative sulla stabilità del genoma ^1,2. Oltre a lavorare con singole molecole di DNA una alla volta, la possibilità di visualizzare le transazioni tra singole molecole vicine fornisce ulteriori informazioni ^3,4,5. La manipolazione di ulteriori molecole di DNA richiede sia trappole ottiche aggiuntive che celle a flusso microfluidico multicanale di alta qualità⁶.

Protocollo

1. Allineamento e test della trappola laser con perline di polistirolo

NOTA: per l'installazione, fare riferimento alla Figura 1A,B.

ATTENZIONE: Lo sperimentatore deve indossare occhiali protettivi appropriati o occhiali di sicurezza laser durante l'allineamento del raggio laser. Poiché il sistema di pinzette ottiche qui descritto utilizza sia raggi HeNe che IR, sono necessari due set separati di vetreria di sicurezza laser.

1. Allineamento HeNe Beam
   1. Posizionare tutti i componenti ottici sulla breadboard. Allineare la breadboard in modo....

Risultati

Il test iniziale dell'allineamento e della resistenza della trappola viene eseguito con perle di polistirene non fluorescente da 1 μm. Poiché la maggior parte della ricerca condotta in laboratorio utilizza la fluorescenza, testiamo ulteriormente la resistenza della trappola utilizzando perline di polistirene verde drago da 1 μm (Figura 1D, E). Successivamente il lavoro cambia l'intrappolamento ottico dei complessi DNA-perline in cui il DNA viene colorato con il colorante bi-.......

Discussione

L'assemblaggio accurato del sistema di flusso è fondamentale per il buon esito degli esperimenti ^4,6. Uno degli aspetti più impegnativi del protocollo è il fissaggio dei connettori alla superficie del vetro. Per questo, utilizziamo i seguenti due approcci: connettori per tubi press-fit e assemblaggi nanoport. I connettori press-fit aderiscono facilmente al vetro seguiti dalla spinta dei tubi in PTFE nei fori preformati utilizzando una pinza. Quando è richiesto un.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Obiettivo 100x	Leica	506318 o 506038	Lenti ad immersione in olio; Solo imaging e trapping ottico; Obiettivi Plan APO ottimizzati per l'imaging a fluorescenza
Obiettivo 10X	Leica	506263	Utilizzato per localizzare i punti dei raggi laser durante l'allineamento; per trovare la messa a fuoco e la posizione X-Y nella cella di flusso
Perline fluorescenti da 1 mm	Bangs Labs	FSDG004	Utilizzato per le prestazioni del tocco, la determinazione della posizione focale
Perle di polistirene da 1 mm	Bangs Labs	CPO1004	Utilizzato per la valutazione delle prestazioni della trappola e il legame con le molecole biotinilate
Obiettivo 63x	Leica	506081	Utilizzato per localizzare i punti dei raggi laser durante l'allineamento e per trovare la messa a fuoco e la posizione X-y nella cella di flusso; può essere utilizzato per l'intrappolamento ottico in quanto ha un diametro di apertura posteriore identico a quello del 100X; lente ad immersione in olio
Laser di allineamento	Lumentum	serie	1100Laser HeNe da 10 mW visibile ad occhio nudo che viene utilizzato per posizionare l'ottica Telecamera di
allineamento del fascio	Amscope	MU303	Una telecamera semplice, economica e controllata da software per l'imaging della posizione del fascio Software di
controllo della telecamera e di acquisizione delle immagini	Hamamatsu	HCImage Coordina	le attività della Lambda DG4 con la telecamera per facilitare il cambio rapido della lunghezza d'onda
Fotocamera; Telecamera CCD Orca flash 4	Hamamatsu	c13440-20cu	per l'imaging di esperimenti a singola molecola
C-mount per la telecamera di allineamento del fascio	Soluzioni di imaging spot	DE50CMT	Fornisce un posizionamento ottimale della telecamera per l'imaging di raggi laser durante
l'allineamento C-mount per la fotocamera			Orca Flash 4Ha un anello di ritegno per tenere in posizione un filtro di blocco IR. Ciò elimina il raggio IR riflesso dalle trappole ottiche e facilita l'imaging più chiaro degli oggetti intrappolati.
Cubo filtrante a fluorescenza Cy5	Semrock	cy5-404a-lsc-zero	Utilizzato in combinazione con Lambda DG4 per l'immagine solo Cy5
Cubo filtrante a fluorescenza Fitc-Txred	Semrock	fitc/txred-2x-b-000	Utilizzato in combinazione con Lambda DG4 per l'immagine di tubi fluidici FITC e TXRed
Grace	Bio	46004	Tubo in PTFE in alternativa al PEEK; Funziona bene su alcune celle a flusso. Può essere utilizzato con celle a flusso PDMS o celle a flusso in vetro quando si utilizzano connettori per tubi Grace Bio fit
Cubo filtrante a fluorescenza GFP	Semrock	gfp-3035b-lsc-zero	Utilizzato in combinazione con Lambda DG4 per l'imaging solo GFP
Celle a flusso in vetro	Translume	Custom	Clear flow channels per l'imaging (Fig. 2E)
Colla per vetro	Loctite	233841	Incolla in modo sicuro e semplice i gruppi Nanoport alle celle a flusso in vetro
Celle di flusso a sandwich in vetro/PDMS	CIDRA Servizi di precisione	Progettazione personalizzata	Celle di flusso costruite secondo le vostre specifiche; i canali di imaging sono chiari (Fig. 2C)
Hamilton Soluzione detergente	Hamilton	18311	Soluzione detergente delicata ma efficiente per celle a flusso in vetro; non bolle se usata con attenzione
Sistema di illuminazione	Sutter Instrument	Lamda DG4	Fuori produzione, quindi consiglio Lambda 721
Sistema di illuminazione	Sutter Instrument Lamda	DG4	Fuori produzione, quindi consiglia Lambda 721
Software di analisi delle immagini	Cibernetica dei media	Image Pro Premiere	Analisi delle immagini e tracciamento di singole molecole Software di analisi delle
immagini	Fiji/NIH Image/Image J	Shareware	Analisi delle immagini e tracciamento di singole molecole
Image scheda di visualizzazione	Melles Griot	06 DLA 001	Prodotto alternativo da Thorlabs: VRC5
Olio da immersione	Zeiss	444960	Immersol 518 F senza fluorescenza
Strumenti di allineamento del raggio laser	Thor labs	FMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1	Utilizzato per garantire che le travi siano orizzontali e all'altezza corretta
Visualizzatore di fasci laser	Canadian Photonics labs	IR 3150	Utilizzato per l'imaging di punti di fascio IR su specchi e bersagli
Misuratore di potenza laser Thor	labs		Misurazione dell'uscita laser e della forza della trappola
Occhiali di sicurezza laser (HeNe)	Thor labs	LG7 o 8	blocchi >3 unità OD di luce di lunghezze d'onda >600 nm
Occhiali di sicurezza laser (IR)	Thor labs	LG11	Blocchi >7 unità OD di luce di lunghezze d'onda ³ 1000 nm
Mcherry  cubo filtro a fluorescenza	Semrock	mcherry-a-lsc-zero	Utilizzato in combinazione con Lambda DG4 per l'immagine solo mcherry
Microscopio	Leica	DMIRE2	DIC rimossa per ospitare lo specchio di intrappolamento/allineamento dicroico
Software di controllo del microscopio	UCSF/shareware	uManager	Controlla il microscopio, consente l'allineamento focale degli obiettivi e il controllo del tavolino
Assemblaggio nanoport	IDEX	N333	Connettori legati alle celle di flusso
Supporto del tavolo ottico	Thor Labs	PA52502	Supporto del tavolo di isolamento attivo
Ottiche e lenti	Solar TII	Vari	Specchi di interferenza, telescopi e lenti progettati su misura per il sistema
Celle di flusso PDMS	ufluidix	Celle di	flusso personalizzate costruite secondo le vostre specifiche; i canali di imaging sono trasparenti (Figg. 2B e D)
Tubo in PEEK	IDEX	1532	Fornisce un eccellente collegamento alle celle di flusso e alle valvole di commutazione
Cubo filtrante a fluorescenza Pinkel	Semrock	lf488/543/635-3x-a-000	Utilizzato in combinazione con Lambda DG4 per l'imaging rapido di più fluorofori
Connettori per tubi a pressione	GraceBio	46003	Connettore in silicone trasparente con adesivo che si lega bene al vetro
Specchi di scansione	GSI Lumonics	VM500	Utilizzato per fornire il controllo della seconda trappola ottica. GSI Lumonics non esiste più. Specchi simili possono essere acquistati da Cambridge Scientific
Stage
Leica Stage Micrometer	Electron Microscopy Sciences	68042-08	Fornisce un righello sullo schermo per il posizionamento del fascio e la calibrazione del sistema
Valvole di commutazione	IDEX	V-101T	Controlla la direzione del flusso del fluido ed elimina l'introduzione di bolle nelle celle di flusso
Siringa e collettore di valvole	Officina meccanica	Nessuno	costruita su misura
	Harvard Apparatus	PHD 2000	Controlla il flusso del fluido attraverso le celle
di flusso Software della pompa a siringa	Harvard Apparatus	70-6000	Flow control fornisce un controllo continuo e programmabile del flusso del fluido
Siringhe	Hamilton	81320	A tenuta di gas, PTFE Luer Lock, cilindri di vetro con Pistoni rivestiti in teflon
Piano del tavolo	Thor Labs	T36H	Piano ottico del tavolo o breadboard
Laser a trappola	Newport/Spectra Physics	J-series; BL106C	Laser Nd:YAG; 1064 nm; laser da 5W